用于与细胞表型有生物学关联的系统的计算机软件和算法的制作方法

专利名称：用于与细胞表型有生物学关联的系统的计算机软件和算法的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及高通量筛选方法领域。特别地，本发明涉及计算机实施的筛选方法，该方法可以用于鉴定在细胞中引发所需生物学反应的单一物质(agent)混合物和这些混合物中的单一物质。
背景技术：
对于用于治疗或者治愈人类疾病的疗法中的细胞，当在体外细胞培养维持细胞时，需要对细胞的命运例如细胞存活、增殖和分化进行控制。因此需要控制细胞表面的受体与配基的相互作用。例如，为了对细胞和体外细胞培养基质上存在的配基之间的相互作用进行控制，可以使用不能让细胞附着(即使在培养基中使用血清蛋白)的聚合物包被适宜的细胞培养基质例如聚苯乙烯。因此这种包被消除了血清蛋白不可控的任意吸附。然后，适宜与细胞表面受体相互作用的具有生物活性的配基可以被固定在这个包被上同时保持了配基的生物活性。这个概念是已知的。例如已知使用透明质酸或者海藻酸作为表面包被物，可以使用化学方法将细胞附着配基固定在表面包被物上，在包被物和细胞附着配基之间产生稳定的共价键。这防止了细胞附着配基被溶解并离开表面。而且，包被物自身并不支持细胞吸附。这在共同未决的、共同拥有的美国申请10/259,797中进行了描述，该申请于2002年9月30日提交。可能需要物质的混合物以获得所需的细胞命运。已知大量的生长效应分子。这些包括生长因子、激素、肽、小分子和细胞外结合分子。因此对于给定细胞类型为获得所需的细胞命运找到正确的生长效应物或者生长效应物组合是繁重的工作。所以在本领域内需要有高通量的方法用于鉴定对于给定细胞类型为获得所需的细胞命运有用的物质。对于在传统的细胞培养系统中不能存活或者需要显著改变其分化状态才能存活的细胞(最佳的示例是初级哺乳动物细胞)，这是非常有益的。特别地，在本领域内需要有用计算机实施的、统计设计的实验方法以及用于实施方法的系统，目的是系统地探究为获得所需的细胞命运需要的因子混合物间的相互作用。优选地，更高通量的方法包含机器自动化制备实验条件以及荟萃分析(meta-analysis)。
发明概述本发明提供了用于鉴定导致细胞表型改变的物质的自动化的方法以及系统。该方法包括提供阵列(array)形式的容器(receptacle)以及提供包括通称因子名称(generic factor name)、因子水平以及实验运行在内的统计设计。该方法还包括根据统计设计的计算机表示(computer representation)将单一物质不同的混合物放置在选择容器中；以及使用软件程序产生设计的计算机表示。软件自动在物质的身份与通称因子的名称之间找到对应(map)，在物质的浓度或者量与因子的水平之间找到对应，在阵列内容器的位置与实验运行之间找到对应。一旦按照设计的计算机表示将不同的混合物正确地放置在容器中，被放置的混合物就与能够改变自身表型的整个细胞接触。该方法还包括获得表明在所接触的细胞出现表型改变的数据，以及使用包括了用于比较所得到的数据与统计设计的算法的处理器鉴定哪一种物质混合物和/或哪些单一物质对于使所接触的细胞产生表型改变是有效的。该方法还包括在一个或者多个数据库中储存统计设计、物质的身份、设计的计算机表示、得到的实验数据以及算法比较的结果。本发明还提供了用于实施刚刚描述的方法的系统。该系统包括容器的阵列，其中具有选择性的容器用于接受(i)单一物质不同的混合物以及(ii)包括细胞的流体。该系统还包括了包括通称因子名称、因子水平以及实验运行的统计设计；以及用于产生设计的计算机表示的软件程序。软件程序自动在物质的身份与通称因子名称之间找到对应，在物质的浓度或者量与因子的水平之间找到对应(map)，在阵列内容器的位置与实验运行之间找到对应。该系统还包括获得表明在所接触的细胞内出现表型改变的数据，以及使用包括了用于比较所得到的数据与统计设计的算法的处理器确定对于使所接触的细胞产生表型改变是有效的物质混合物和/或单一物质。在该系统中还包括一个或者多个数据库，用于储存统计设计、物质的身份、设计的计算机表示、得到的实验数据以及算法比较的结果。
附图简要描述

图1A和1B是根据本发明的示例性自动化方法的流程图，其中可以以高通量的方式确定在细胞内能够引起表型改变的最佳混合物和/或最佳物质。图2是根据本发明的示例性自动化方法的流程图，其中可以使用由图1A和1B中的方法得到的信息产生生物模型和/或对其进行改动。图3图解了示例性的细胞途径，对物质混合物(M)对生物系统的作用进行假设(hypotesized)。图4是计算机系统示例性实施例的示意图，该计算机系统可以用于实施本发明的方法。图5是示意图，图解了本发明的系统的组分的优选实施方案。图6是本发明一个实施方案中检测孔的图示。图7是包含不同单一物质混合物的96孔平板布局的图示。在所示的实施方案中，布局(layout)是使用统计设计产生的，其中在设计中通称因子代表单一物质，单一物质组合形成不同的混合物。图8图示了可以用于开发本发明方法的统计设计的方案。图9图示了另一个可以用于开发本发明方法的统计设计的方案。图10是电子数据表(spreadsheet)，它是混合物设计的计算机表示。显示了对96孔平板的布局，布局是使用图9中的方案进行的，其中一个孔中的总流体体积根据存在的因子的数目进行划分。图11显示了根据图10中的电子数据表的统计设计制成的96孔平板布局。图12是附着于96孔平板孔上用荧光标记的细胞的荧光显微镜图片，96孔平板具有图11所示的布局。图13是对图12中的显微镜图片进行分析后得到的细胞核计数与孔编号的图形。图14是Ln(细胞计数-无血清+1)与对参考混合物的偏离的曲线图，其是使用图9-13的信息进行混合物-模型分析后得到的。图15是Ln(细胞计数-10％血清+1)与对参考混合物的偏离的曲线图，其是使用图9-13的信息进行混合物-模型分析得到的。图16(a-d)是电子数据表，显示了用于96孔平板布局的Plackett-Burman统计设计。图17显示了图16的统计设计中的因子的身份。
发明详述这里所述的“物质(agent)”是与细胞结合并且调节靶细胞或者组织存活、分化、增殖或者成熟的生长效应分子。用于本发明的适宜的物质的实例包括生长因子、细胞外基质分子、肽、激素以及细胞因子、它们可以在溶液中或者与培养的表面如孔表面、支架表面、小珠表面等结合。术语“物质固定化材料”在这里的定义是具有生物兼容性的聚合物，它们可以作为培养表面与物质之间的连接。这里所述的术语“固定化”、“固定化的”等等指的是使物质即生长效应分子在培养表面(例如孔的表面或者孔内含有的支架的表面)固定不动。这个术语还包括物质被动吸附到培养表面，以及物质直接或者间接共价附着在培养表面。“因子”是实验中变量的名称，代表了从一次试验或运行(例如一个孔)到下一次试验或运行所改变的事物。在本发明中，“因子”是单一物质或者单一物质的混合物通称名称(generic name)。在实验中根据统计设计对因子进行组合，形成不同的混合物。这里所述的“统计设计”是帮助使用者找到可调整变量(即因子)的组合，得到最佳实验结果，显著降低为了达到该目标所需实验次数的实验设计。在本发明中，使用代表被检测物质的通称因子名称产生适宜的统计设计。设计包括了可以是因子的量和/或浓度或者可以被转化为实际的因子量和/或浓度的因子水平。设计还包括编号的实验运行。实验运行特别指明了要检测的因子的组合及其水平，例如每一个运行对应多孔平板上的单一孔。可以将实验运行与非专利的多孔平板上的孔对应起来。这里所使用的术语“预处理”和“预处理的”指的是向表面或者其他基质上添加官能团，官能团在化学上参与接下来与物质固定材料(即生物相容性聚合物)形成的共价键。例如，微量滴定孔的表面可以进行氨基等离子体处理(amino-plasma treatment)，产生富含胺的表面，物质固定材料可以结合于这样的表面。这里所述的术语“阵列(array)”、“容器阵列(receptaclearray)”等等指的是大量独特的容器，例如管或者孔，它们被按顺序排列放置，例如成行或者成列。如以上所描述的，可能需要单一物质的混合物以获得所需的细胞命运。例如，与细胞表面受体结合并且调节这些细胞存活、分化、增殖或者成熟的的生长效应分子包括生长因子、细胞外基质分子、肽、激素和细胞因子，它们都有很多实例。因此为找到正确的生长效应物或者生长效应物组合与细胞接触获得所需的细胞命运可能是繁重的工作。本发明通过提供高通量的计算机实施的方法来鉴定对于给定细胞类型最佳的物质，解决了本领域内的需要。图1A和1B是根据本发明的优选方法的示意流程图，根据这个优选的方法可以鉴定能够引发细胞表型改变的独特的混合物和/或单一物质。在该实施方案中，使用的型式是微孔阵列。一般地，这种阵列非常适合进行自动化，因为很容易得到自动的移液器和读板仪。第一步，在块(block)100用户或者使用商品化的软件如JMPTM(SASInstitute，Cary，NC.)进行实验设计或者根据已经包括在本发明的系统的软件中的算法进行统计设计。在块100的设计包括通称因子的名称、因子的水平、实验运行以及实验运行与通称的微孔阵列的对应。在块102统计设计储存于数据库中。用户在块104向软件中输入特定的物质以及其浓度和/或量。用户的输入在块106储存数据库中。在块107，用户可以选择特异的统计设计。接下来，在块108使用软件程序以产生特异统计设计的计算机表示。设计的计算机表示可以是能够转化为96孔布局的电子数据表。特别地，用于产生计算机表示的软件程序使特定的物质的名称与设计中的通称因子名称对应，使物质的浓度和/或量与设计中的因子水平对应，根据特异的物质及其浓度和/或量产生实验运行，并且使孔的位置与特异微孔阵列上的实验运行相对应。然后在块110，将计算机表示储存在数据库中。在块112产生计算机程序，用于根据设计的计算机表示的机器自动化系统(robotic system)。在块114(图1B)，机器自动化系统根据设计的计算机表示将物质分配到孔内，在微孔阵列中的选择孔中产生不同的混合物。最佳地，机器自动化系统可以将单一物质分配到微孔阵列中的其他孔内。除了试剂的加入，也可以使用机器自动化系统进行试剂的取出和洗涤步骤。或者可以手工进行这些步骤中的一些或者全部。可通过生物相容性聚合物例如海藻酸或者透明质酸将物质共价束缚在孔或者其他培养表面上，或者物质可以存在于溶液中。一旦物质被正确地置于孔内，在块116的机器自动化系统将包含整个细胞的流体分配到微孔阵列的孔内。在块118获得实验数据，它将指示细胞表型的改变。获得的数据储存于块120的数据库中，这样使实验数据与设计的计算机表示相关联。然后在块122，使用包括算法的处理器，比较储存的实验数据与储存的统计设计以确定引发所需生物学反应(即引发细胞中的表型改变)的最佳混合物和/或最佳的物质。选择地可以使用另一个算法，比较物质的混合物或者单一物质在多次实验中的表现以确定趋势或者型式。在每种情况下，算法比较结果都可以储存在数据库中并在块124显示给用户，并且可以定期更新。在优选的实施方案中，图1A和1B中显示的数据库是单一综合或者联合数据库。在块126，如果需要的话，可以使用最佳混合物的子集(subset)或者最佳物质的子集对本发明方法的步骤进行重复。而且如果需要的话可以使用组合的最佳物质的子集和来自最佳混合物的物质子集(未显示)对本发明方法的步骤进行重复。而且，在块128可以重复本发明方法的步骤，改变最佳混合物中物质的浓度和/或量。本发明的另一个方面在块122从算法比较获得的信息可以最理想地用于产生或者修改生物模型(块130)。现在参考图2，它展示的是根据本发明的示例性方法的流程图，可以通过它建立生物模型或者使用图1B的块122和124的信息对已有的模型进行修改。在块200，从多种不同的来源如文章、杂志、书籍、专家、实验、内部信息等收集科学信息。科学信息可以包括但是不限于，基因表达数据、蛋白质表达数据、细胞表型数据、信号传导数据、细胞途径数据以及它们的组合。这种科学信息可以储存于一个或者多个数据库中。可以用计算机例如通过因特网提取信息。在块202处将提取的信息与图1B的块122中确定的物质混合物和/或单一物质进行比较。根据这个比较，可以在块204设计生物模型或者进行修改。生物模型可以确定参与表型改变的生物系统，以及任何在生物系统之间的相关交流机制。例如在块204，可以鉴定与细胞表型改变相联系的特异的细胞途径、蛋白质或者基因。在一个实施方案中，图1B中描述的处理器还包含第一应用程序，用于计算细胞途径、蛋白质或者基因参与与鉴定的单一物质混合物相关的细胞表型改变的可能性。使用提取的科学信息确定细胞途径、蛋白质或者基因。在图2中，生物模型可以是可计算机实施的模型，如果需要的话，该型在模块206处实施，在块208处检查其正确性、在块210处进行修改。一旦确定模型是正确的，就可以使用(块212)。可计算机实施的生物系统模型的实例在美国专利No.5,808,918中描述，其整个内容在这里引用作为参考。理想地该模型将能够支持计算、更新、比较和呈现(visualization)。图3阐释了示例性的细胞途径，假设用于物质混合物(M)对生物系统的作用。物质混合物(M)通过与假设的生物途径300和302相互作用作用于细胞。混合物(M)和这些途径之间的弧线表示了混合物(M)对这些途径的可能作用。混合物(M)对细胞的整个作用假定可以表达为混合物(M)对这两个途径中一个或者两个的作用的组合。如这里所使用的，细胞途径一般被理解为细胞成分的集合，各成分的相互关系在于集合中的每一个细胞成分，根据一些生物学机制，受到集合中一个或者多个其他细胞成分的影响。组成特定细胞途径的细胞成分可以来自细胞的生物学状态的任何方面，例如来自转录状态或者翻译状态或者活性状态，或者生物学状态的混和方面。细胞途径的细胞成分可以包括mRNA水平、蛋白质丰度、蛋白质活性、蛋白质或者核酸的修饰程度(例如磷酸化或者甲基化)、这些类型细胞成分的组合等等。每一种细胞成分都通过某种生物学机制受到集合中至少一种其他细胞成分的影响。这种一种细胞成分对另外一种细胞成分的影响，不论是直接还是间接的，在两种细胞成分之间以弧线表示，整个途径表示为将细胞成分与途径相连的弧线的网络。在图3中，生物途径300包括蛋白质P1(例如或者是P1的丰度或者活性)以及基因G1、G2和G3(例如它们转录出的mRNA的水平)。生物途径300还包括蛋白质P1对这三个基因的影响，不论是直接还是间接的，影响表示为从P1到这三个基因的弧形。这种影响可能例如由于蛋白质P1可以与这些基因的启动子结合并增加它们转录产物的丰度而产生。图3中还显示了细胞途径302。在这个途径中蛋白质P2和P3都(直接)影响基因G。然后基因G(可能间接地)影响基因G4、G5和G6。为了确定某些途径、蛋白质或者有特殊意义的基因，可以在已经被鉴定为引发细胞表型改变的单一物质混合物(图1B的块122)存在的情况下，对细胞的生物状态的方面，例如转录状态、翻译状态或者活性状态进行测量。在一个实施方案中，可以在鉴定的单一物质混合物存在的情况下通过鉴定由该细胞表达的基因和/或蛋白质，鉴定细胞途径或者机制。在另一个实施方案中，可以在鉴定的单一物质混合物存在的情况下通过鉴定被激活的细胞上受体鉴定细胞途径或者机制。图4阐释的是适于实施本发明的方法的示例性计算机系统。在所示的实施方案中显示了计算机系统400，包括了与外部组分相连的内部组分。内部组分包括与主存储器404互连的处理器402。在一个实施例中，计算机系统400可以是基于Intel Pentium的处理器，时标频率(clock rate)是200Mhz或者更高，主存储32Mb或者更大。外部组分可以包括一个或多个硬盘406，其通常与处理器和存储器包装在一起。外部组分还包括界面板405，微孔平板读板仪407和微孔阵列409，它们一同使实验数据传输到计算机系统400中。外部组分还包括机器自动化(robotic system)系统411，它根据用户选择的统计设计，将实验的因子例如图4所示的10个细胞外基质蛋白(ECMs)置于微孔阵列409的容器中。其他的外部组分可以包括用户界面装置408，它可以是监视器或者键盘以及点击装置410，它可以是鼠标，或者其他图片输入装置(未显示)。通常，计算机系统400还与网络连接412相连，412可以是连接到其他局域计算机系统、远程计算机系统或者因特网的以太网(Ethernet)的一部分。该网络连接412使计算机系统400与其他计算机系统共享数据并且处理任务。载入存储器404的是几个软件组分，它们对于本领域是标准的，对于本发明是特殊的。这些软件组分一起使计算机系统400根据本发明的方法起作用。软件组分通常储存在硬盘406上。软件组分414代表了操作系统，它负责控制计算机系统400及其网络互连。适宜的操作系统的实例是Windows 98，或者Windows NT。软件组分415用于分析来自微孔平板读板仪407的图像。软件组分416代表了常规的语言，可以在系统400上方便地起作用，辅助程序实施本发明特异的方法。可以用于本发明分析方法编程的语言包括优选配置中的Java，但是也包括C，C++，Fortran，Visual Basic或者其他计算机语言。最优选地，本发明的方法以数学软件包编程，可以用符号输入等式以及对过程进行高水平说明，包括要使用的算法，这样使用户不用按照程序对每一个等式或者算法进行编程。这种软件包包括Mathworks(Natick，MA.)的Matlab，Wolfram Research(Champaign，III.)的Ma thematica，Mathsoft(Seattle Wash.)的S-Plus，Mathsoft(Cambridge，Mass.)的MathCAD或者RFoundation(www.r-project.org)的″R″。因此软件组分418代表了如程序语言或者符号软件包所编程的本发明的方法。在优选的实施方案中，软件组分418实际上包括几个软件组分，它们如图5所示相互作用。软件组分500代表了数据库，数据库优选是含有计算机系统400运行需要的数据的单一综合或者联合数据库。这种数据库优选包括统计设计、统计设计的计算机表示、实验数据、算法结果、被检测的特异物质的名称、被检测的物质的量和/或浓度以及将要在实验中使用的孔的位置。软件组分502表示的是用户界面(UI)，它优选地是图形用户界面(GUI)，是用图形的方式表示操作系统，例如Windows 2000或者X11。用户界面502为计算机系统400的用户提供了关于统计设计、特异物质、它们的浓度和/或量，以及选择地，实验数据的控制和输入。用户界面还可以包括从硬盘406、从可移动媒介(例如CD-ROM)或者从不同的计算机系统(通过网络例如因特网的即时系统进行交流)装载信息(例如实验数据)的方式。软件组分504表示了控制软件，它可以被称为UI服务器，控制计算机系统的其他软件组分。软件组分506表示了数据简化和计算组分，包括了执行本发明分析方法的算法。例如，组分506可以包括用于获得的实验数据与统计设计进行比较从而确定最佳混合物和/或最佳物质的算法。数据可以输入软件中，并且与统计设计自动连接，使数据被完全注释，可以用于统计分析。而且，组分506可以包括用于比较混合物或者物质在多次实验中表现的算法以确定趋势或者型式，如果需要的话，这些结果可以被储存起来并且定期更新。在一个实施方案中，软件组分506包括线性回归算法。通过这种方法对统计设计中使用的每一个特异物质的系数进行估计。软件组分418还包括用于产生统计设计的计算机表示的软件组分508，以及软件组分510，用于机器自动化系统根据数据库500中储存的统计设计将物质正确地加入阵列409的孔内。例如，用户可以通过界面502进行一个选择，产生计算机文件，文件可以输入到机器自动化样品制备平台例如Biomek FX，Biomek 2000，TecanGenesis或者任何类似的平台中。可以使用计算机文件自动地在微孔阵列上制备正确的实验条件，培养细胞，并且进行任何流体的分配、流体取出或者洗涤步骤，对表型进行检测。注意到本发明的方法能够在远离正在进行实验的实际实验室的客户位置实施，这也正是本发明所涉及的。这可以包括基于网络的界面或者向客户分配厚实客户(thick-client)软件应用。实验室和客户之间的相互作用水平可能有所不同。例如，客户可能对过程具有完全的控制。或者客户只能够从实验室得到关于获得最佳物质混合物进展的定期报告。在本发明方法的一个实施方案中，单一物质的混合物共价固定于培养表面(例如容器表面或者容器内含有的支架的表面)上的物质固定材料上。单一物质的混合物可以被动地吸附在培养的表面，这也是本发明所涉及的。而且，混合物中的一些或者全部单一物质可以在溶液中。现在参考图6，根据本发明，容器10以阵列的形式提供(未显示)。容器10包括表面12，它可以进行预处理。在一个实施方案中，表面12是氨基等离子体处理的，这样产生了富含胺的表面14，物质固定材料16可以结合到表面14上。如以下将要详细描述的，物质固定材料16优选地是生物相容的聚合物，它已经被结合到胺化的表面14上。在所示的实施方案中，单一物质20(例如20a-d)的混合物18共价固定在物质固定材料16上。但是，所检测的物质中的一些或者全部在溶液中而不是结合在培养的表面，这也是本发明所涉及的。如以上的描述，适宜的用于检测的物质包括，但是不止限于，生长因子、细胞外基质分子、肽、激素以及细胞因子。但是小分子、金属、螯合剂或者酶也可以作为物质加入到孔中。根据统计设计将单一物质20的不同混合物18置于容器10内，以下将要对此进行详细描述。如图6所示，在容器10a中物质20a-d的组合物与第二容器10b中的组合物不同，图10b中的容器中组合物包含单一物质20e-h。但是注意到一个以上的容器可以包括相同的物质。例如本发明也涉及给定的物质如果被其他物质的某种组合包围，可能对获得所需的细胞命运具有正面的作用；而同一种物质如果被不同的物质组合包围，则可能对获得所需的细胞命运具有中性或负面的作用。因此，使物质与其他物质位于不同组合物中，来评价这些作用可能是有益的。再次参考图6，一旦物质20作为不同的混合物被置于根据统计设计的各种不同的容器10中，这些混合物18与整个细胞22接触。物质20结合细胞22，并能够在被接触的细胞中产生所需的生物学反应。在这个细胞类型中，根据得到的实验数据，确定给定物质混合物或者混合物中单一物质引发所需反应的效果。所述的数据可以使用包括免疫细胞化学分析、显微术或者功能检测等方法得到，但是不限于这些方法。现在参考图7-9，现在更加详细描述统计设计的方面。特别参考图7，显示容器10相应于微孔阵列24，例如96孔平板，其包含行A-H和列1-12。如图7所示，本发明的一方面是图6中的单一物质20或者混合物18由通称的因子名称代表。因子是实验中的变量。例如，在图7显示的实施方案中，通称因子1-10代表了10个单一的细胞外基质蛋白，如块28所示。在这个实施例中，通称因子1是胶原蛋白I，通称因子2是胶原蛋白III等等。这些因子的每一个都可以与一个或者多个其他因子组合，产生用于平板布局的混合物。现在参考图7中显示的实施方案描述图8和9，其中通称因子1-10每一个对应的是具有给定浓度或者量(即因子水平)的单一物质。如图8所示意的，提出了一个方案，其中容器10内的总流体体积被分成10个相同体积的隔间(compartment)32。96孔平板的每一个孔都可能含有所有10个因子(例如单一物质)或者这些因子的子集。如图8A所示，在第一种情况中，存在所有10个因子，且所有10个因子都占据了流体隔间32。图8A中孔10内的总因子浓度是[10/10]＝[1]。这提供的因子总浓度相当于每孔[1]。图8B表示了例如同一块96孔平板上的一个不同的孔。在这种情况下(情况2)，10个因子中只存在5个。同样流体体积被分成10个相等的隔间32。在情况2中，如果存在一个因子，则流体隔间被该因子充满。但是在情况2中，10个体积隔间中有5个没有被一种因子充满，而是被“位置占据者(place holder)”例如培养基充满。在图8B的情况2中，总因子浓度相当于
。因此，图8B中所示的孔中，总因子浓度是每孔
。情况1中的总因子浓度与情况2中的总因子浓度不相等。因此，每个容器中的物质总浓度可以不同。而且，在情况1和情况2中，孔间单一因子的浓度是相同的。例如，代表了单一胶原蛋白I配基的因子1的浓度在情况1的孔和情况2的孔中是相同的。参考图9，提出了另一个方案，其中特殊考虑了表面化学需要。特别地，在该方案中，孔与孔的因子总密度保持恒定，只允许孔间有因子组成的改变。换言之，孔与孔间的因子浓度可以不同，但是每一个孔具有相同总量的固定化的因子。如图9所示，给定的孔内总的流体体积根据存在的因子的数目进行分割。同样，为简化起见，我们可以假设一个因子对应一种单一物质，尽管本发明不限于这种情况。如图9A所示，所有10个因子都存在且总的因子浓度等于[10/10]＝[1]，每孔的总因子浓度是[1]因子。在图9B中，10个因子中只存在5个，但是这5个因子每一个的流体体积32是图9A中所示的每个因子的体积32的两倍。因此，图9B中所示的总的因子浓度与图9A中所示的总的因子浓度相同，是每孔[1]因子。所以，在一个优选的实施方案中，每一个容器中物质的总浓度是相同的。根据图9，可以看出虽然图9A和图9B所示的孔之间的总的因子浓度是恒定的，单一因子的浓度在这些孔之间可以是不同的。特别地，就因子1而言，它可能代表胶原蛋白I，该单一物质在图9B中的浓度可以是图9A中浓度的两倍。因此，在本发明的另一个实施方案中，在容器之间单个物质的浓度是不同的。注意到图8和图9中描述的每个方案都是可行的，可以用于筛选单一物质的混合物。本发明提供的方法使用例如微孔阵列的形式筛选大量物质的不同混合物，同时筛选它们与给定细胞类型结合并且在细胞内引发所需应答的能力。该方法包括根据统计设计将不同的物质混合物置于多孔平板选择性孔内。该方法选择地包括将单一物质置于其他孔内的步骤。该方法还包括将包含一种细胞类型的流体样品加入到孔内。在孔之间以及不同孔的样品之间进行适当孵育时间以后，可以直接或者间接检查细胞和孔组分之间的相互作用。例如，可以使用功能检测、免疫细胞化学或者显微术获得数据。用于本发明的适宜的统计设计包括，但是不限于下列分部析因设计(fractional factorial design)、D-最优设计(D-optimaldesign)、混合物设计(mixture design)以及Plackett-Burman设计。统计设计还可以是基于覆盖标准的空间填充设计(space-fillingdesign)，点阵设计(lattice design)或者拉丁方设计。如以上描述的，物质可以结合在培养表面(例如容器表面或者支架表面)或者在溶液中。例如，在一个实施方案中，培养表面可以被预先处理，使用物质固定化材料包被。物质固定化材料最好是不支持细胞附着并且可以作为培养表面和物质间灵活连接(绑缚)的生物相容性聚合物。适宜的聚合物的实例包括合成聚合物如聚环氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺以及天然聚合物如透明质酸和海藻酸。在优选的实施方案中，培养表面(例如孔表面)选自，但是不限于下列聚苯乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚环氧乙烷、玻璃、聚硅酸盐、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、碳氟化合物和尼龙。培养基质可以完全或者部分包括可以生物降解的材料例如聚酐、聚乙醇酸、多羟基酸例如聚乳酸、聚乙醇酸和聚乳酸-乙醇酸共聚物，聚原酸酯、聚羟基丁酸酯、聚磷腈、聚富马酸丙酯以及可以生物降解的聚氨酯，这也是本发明所涉及的。培养表面可以进行预处理。例如，可以通过在氨环境下对聚合物进行等离子体放电处理制备带有伯胺的细胞培养表面。在一个实施方案中，可以使用标准固定化方法(如共同未决的共同拥有的美国申请10/259,797中所描述的，该申请于2002年9月30日提交，其全部内容在这里引用作为参考)将物质固定材料共价连接在那些胺化的表面。制备组织培养处理的聚苯乙烯的两种商用方法是空气等离子体处理(也被称为电晕放电)以及真空等离子体处理，这两种方法都是本领域内众所周知的。等离子体是具有高度反应性的气体离子和自由基的混合物。氨基等离子体处理或氧/氮等离子体处理可以用于制备富含胺的表面，可以使用碳二亚胺生物缀合物化学(如美国申请10/259,797中描述的)通过羧基基团将生物相容的聚合物例如透明质酸(HA)或者海藻酸(AA)与这种表面结合。产生的表面即使细胞培养基中存在高浓度例如10-20％的血清蛋白也不能使细胞附着。可以用于通过物质固定材料使物质共价连接的预处理组织培养聚苯乙烯产品的实例是PRIMARIATM组织培养产品(Becton Dickinson Labware)，它使用对聚苯乙烯的氧-氮等离子体处理，使含有氧和氮的官能团如氨基和酰胺掺入。接下来使用蛋白质/肽上的胺基团和HA或AA上的羧基基团或者通过使用例如高碘酸钠氧化作用在HA或AA上产生的醛基基团，将例如细胞外基质蛋白、肽等物质共价结合到以上描述的HA或者AA表面。例如，人胎盘透明质酸的末端糖可以通过E.Junowicz和S.Charm，″The Derivatization of Oxidized Polysaccharides forProtein Immobilization and AffinityChromotography，″Biochimica et.Biophysica Acta，Vol.428157-165(1976)中描述的高碘酸盐方法进行活化，此文献在这里引用作为参考。该方法要求在透明质酸的溶液中加入高碘酸钠或者钾，活化末端糖，使其化学地交联在物质表面的游离氨基基团如细胞外基质蛋白上的末端氨基基团上。在另一个优选的实施方案中，可以使用碳二亚胺作为交联剂将生物相容聚合物(例如HA或者AA)上的游离羧基基团与物质上的游离氨基基团化学交联。其他标准的固定化化学是本领域内技术人员已知的并且可以用于连接培养表面和生物相容聚合物以及连接生物相容聚合物与物质。例如参见″ProteinImmobilizationFundamentals and Applications″Richard F.Taylor，Ed.(M.Dekker，NY，1991)或者共同未决的美国申请10/259,797，该申请于2002年9月30日提交。注意到使用标准的固定化化学，可以将物质通过生物相容聚合物束缚在胺化的组织培养表面或者通过生物相容聚合物束缚到羧化的表面或者羟基化的表面。连接剂的实例有溴化氰、琥珀酰亚胺、醛、甲苯磺酰氯、亲和素-生物素、光可交联剂、环氧化物以及顺丁烯二酰亚胺。同样，注意到物质可以存在于溶液中，不需要结合在培养表面。如上面的描述，本发明的一个方面是选择性的容器中含有物质的混合物，物质混合物可以结合在培养表面或者在溶液中。而且，本发明的另一个方面是其他容器也可能含有单一物质。这些物质可以以任何需要的比例进行组合。可以通过例如将要被分配到容器中的组合物中物质的浓度对容器中存在的不同物质的相对量进行控制。而且在物质通过生物相容聚合物共价连接到容器表面的实施方案中，可以通过调整结合在培养表面的生物相容聚合物的容量(capacity)控制荷载密度。这可以通过例如控制能够与物质反应的聚合物上反应性基团的数目或者控制培养表面上生物相容聚合物分子的密度来实现。而且，可以首先将物质分别与生物相容聚合物(系链(tether))相连，然后“负载的”系链可以按照所需的比例混和然后连接在预处理的基质上。如以上描述，物质可以在溶液中和/或结合在表面上。例如，可以通过生物相容聚合物将物质共价固定在预处理的组织培养表面上，该表面最好是富含胺的。或者可以通过物质被动吸附至表面将物质固定在容器表面上。物质可以事先固定在固相支持物例如小珠上，然后再加入容器中，这也是本发明所涉及的。接下来可以检测在容器中与小珠接触的细胞类型的反应。包含单一物质的小珠混合物可以组合形成物质混合物。或者可以将单一物质的混合物固定在小珠上。物质可以固定或者注入到支架中，支架可以置于容器中然后与含有细胞的流体接触，这也是本发明所涉及的。用于本发明的适宜支架以及在支架上或者其中固定物质的方法在共同未决的共同拥有的美国申请10/259,817中有所描述，该申请于2002年9月30日提交，其全部内容在这里引用作为参考。用于本发明的容器可以具有任何一般形式，但是最好是微孔或者管。微量滴定孔或者管的型式在本发明中非常有用，这可以使得同时进行大量样品的自动化检测有效方便地进行。自动移液器以及读板仪使微量滴定孔能够充分自动化。也可使用其他固相特别是其他塑料固相支持物。在本发明的一个优选实施方案中，容器包含96孔微量滴定板(即微孔阵列)的孔。对于微量滴定板已经有自动移液设备(用于试剂的加入和洗涤步骤)以及颜色读板仪。用于进行本发明的自动化装置的实例可以包括移液工作台以及检测装置(例如读板仪)，移液工作台能够在恒温环境(例如温度受到控制的环境)中在特定时刻进行向孔中加入和取出试剂的连续操作。如以上所描述，用于本发明的物质有在细胞表面上结合受体或者通过离子通道或者转运途径被摄取，调节靶标细胞或者组织生长、复制或者分化的生长因子分子。在一个实施方案中，这些物质是细胞附着配基和/或外因子(extrinsic factor)。在优选的实施方案中，物质可以是细胞外基质蛋白、细胞外基质蛋白片段、肽、生长因子、细胞因子以及它们的组合。优选的物质是生长因子、细胞外基质分子、细胞因子、肽、激素、金属、螯合剂或者酶。生长因子的实例包括，但是不限于，血管内皮来源的生长因子(VEGF)，表皮生长因子(EGF)，血小板来源的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGFα，TGFβ)、肝细胞生长因子、肝素结合因子、胰岛素样生长因子I或者II，成纤维细胞生长因子、红细胞生成素神经生长因子、骨形成蛋白质、肌肉形成蛋白质以及其他本领域内技术人员已知的因子。其他适宜的生长因子在例如″Peptide Growth Factors and Their Receptors I″M.B.Sporn andA.B.Roberts，Eds.(Springer-Verlag，NY，1990)中有所描述。可以使用本领域内已知的方法从组织中分离生长因子。例如，可以从组织中分离或者通过重组方法生产生长因子。例如，EGF可以从小鼠的颔下腺中分离，Cenentech(South San Francisco，CA.)生产重组的TGF-β。其他天然或者重组形式的生长因子可以从销售商处例如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO.)，R&D Systems(Minneapolis，MN.)，BD Biosciences(San Jose，CA.)，以及Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA.)获得。用于本发明的适宜的细胞外基质分子的实例包括玻连蛋白、腱生蛋白、血小板反应蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白以及蛋白聚糖。其他细胞外基质分子在Kleinman等人，″Use ofExtracellular Matrix Components for Cell Culture，″AnalyticalBiochemistry 1661-13(1987)中有所描述，或者对于本领域内技术人员是已知的。在本发明中有用的其他物质包括细胞因子例如白细胞介素和GM集落刺激因子，以及激素如胰岛素。这些在文献中有描述，并且可以商业化地获得。用于本发明的细胞可以是对物质可能产生应答或者其生长需要所述物质的任何细胞。例如，细胞可以从确立细胞系获得或者从分离的组织中分离。适宜的细胞包括大多数上皮和内皮细胞类型，例如实质细胞如肝细胞、胰岛细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、外分泌细胞、肠源细胞、胆管细胞、甲状旁腺细胞、甲状腺细胞、肾上腺-下丘脑-垂体通道细胞、心肌细胞、肾脏上皮细胞、肾小管细胞、肾基底膜细胞、神经细胞、血管细胞、形成骨和软骨以及平滑肌和骨骼肌的细胞。其他有用的细胞可以包括干细胞，它们响应物质的选择混合物产生表型改变。其他适宜的细胞包括血细胞、来自脐带血的细胞、来自脐带血的干细胞、来自脐带血的祖细胞、来自脐带的细胞、来自胎盘的细胞、来自骨髓的细胞以及来自羊水的细胞。可以对这些细胞进行遗传工程操作。在容器中例如96孔微量滴定板的孔中使用物质培养细胞。可以使用众多众所周知的细胞培养技术中的任何一种，如Freshney，″Cell Culture，A Manual of Basic Technique″第三版(Wiley-Liss，NY，1994)中所描述的，培养这些细胞。其他细胞培养基和技术对本领域技术人员是众所周知的并且可以用于本发明。这些细胞可以在存在于溶液中或者结合在标准组织培养容器(如微量滴定板)上的物质存在的条件下进行培养。可以使用已经结合在小珠或者纤维(优选是10微米直径长度级别)上的物质，悬浮培养细胞，这也是本发明所涉及的。这些粒子，当加入培养基中时，将附着于细胞，由此刺激其生长和提供附着信号。现在描述根据本发明的统计设计实施方案。
实施例实施例1透明质酸与富含胺的组织培养表面结合Becton Dickinson Labware使用氧/氮等离子体制备PRIMARIATM组织培养产品。特别地，使用氧/氮等离子体处理聚苯乙烯产品，使含有氧和氮的官能团例如氨基和酰胺基团掺入。对于该实验，通过HA上的羧基基团，使用本领域内众所周知的碳二亚胺生物缀合物化学(例如″Protein ImmobilizationFundamentals andApplications″Richard S.Taylor，Ed.(M.Dekker，NY，1991)中所描述的或者在共同未决的共同拥有的美国申请10/259,797中所描述的(该申请于2002年9月30日提交)，将HA结合到PRIMARIATM多孔平板上富含胺的表面。
实施例2ECM蛋白与透明质酸的结合ECM物质共价连接到实施例1的束缚在培养表面的HA聚合物上。特别地，使用E.Junowicz and S.Charm，″TheDerivatization of Oxidized Polysaccharides for ProteinImmobilization and Affinity Chromotography，″Biochimica et.Biophysica Acta，Vol.428157-165(1976)中描述的高碘酸盐方法通过氧化在HA上产生醛基基团。该方法需要将高碘酸钠加入到HA的溶液中，这样使末端糖活化。接下来，使用标准的固定化化学(例如″Protein ImmobilizationFundamentals andApplications″Richard F.Taylor，Ed.(M.Dekker，NY，1991中描述的或者在共同未决的共同拥有的美国申请10/259,797中描述的，该申请于2002年9月30日提交)将活化的HA结合到ECM蛋白质上的胺基团。
实施例3使用统计设计的实验(混合物设计)同时筛选10种不同的ECM蛋白在本实施例中，统计设计是混合物设计。使用该设计鉴定对细胞应答有正面作用的因子对或者单一因子，这使我们看到两种ECM之间的相互作用。在该实施例中，使用10种单一ECM，每一种代表一个单一“因子”，制备ECM混合物，将其置于如图7中所示的96孔平板的孔内。ECM共价连接到培养表面上的生物相容聚合物(参见实施例1和2)上。注意到如果不对实验进行统计设计，则需要210(1024)个单一实验，或者11个96孔平板，才能检测10种ECM中每一种与其他ECM一起对给定细胞类型的作用。在该实施例中，选择一组10种附着配基并选择96孔阵列作为该筛选的模式。为了消除由于蒸发不均匀造成的边界效应，在实验中只使用了96孔阵列的内部的60个孔。这样板较外侧的行和列中的孔可以作为适宜的对照。选择了以下的10种附着配基，选择依据是它们作为细胞培养试剂的共同用途，商业可获得性以及价格胶原蛋白I(CI)，胶原蛋白III(CIII)，胶原蛋白IV(CIV)，胶原蛋白VI(CVI)，弹性蛋白(ELA)，纤连蛋白(FN)，玻连蛋白(VN)，层粘连蛋白(LAM)，聚赖氨酸(PL)，以及聚鸟氨酸(PO)。开发了对表面化学需要进行特殊考虑的统计设计。特别地，在该实验中使用了图9所示的方案，其中总附着配基的密度在孔和孔之间保持恒定，只允许附着配基的组成改变。换言之，单一附着配基的浓度在孔和孔之间可以不同，但是每孔整体上含有等量的固定化的附着配基。以上进一步描述了该方案。这种设计的实例在图10的电子数据表中显示。该电子数据表作为在数据库中储存的设计的计算机表示。图9中最上面一行列出了10个在该特定筛选中使用的因子(A-K)以及它们所对应的身份。在显示的电子数据表中，因子A表示纤连蛋白。因子B表示胶原蛋白I等等。第一列列出了转化成96孔平板中的孔的实验点，例如在该情况下是52个孔。电子数据表中的数字是因子水平。在该实施例中，这些水平是加入到特定孔中的因子的实际体积(用微升表示)。在这个特定的设计中，向孔中加入的因子有三种体积，例如5微升、25微升或者50微升。在该情况下，孔的总体积是50微升。这样，对于只加入50微升一个因子的孔，最终的孔组成包含共价固定在孔表面的单一附着配基。因此，如果向孔中加入25微升的一种因子，另一种因子也加入25微升，则最终的孔组合物包含共价固定在孔表面的两种不同细胞附着配基的混合物。如果一种因子加入5微升，其他9种因子也各加入5微升，则最后孔中包含所有10种细胞附着配基组成的混合物，位于孔表面上。这些含有所有10种附着配基的实验点被称为“中点(mid point)”，是该实施例中统计设计的整体的组成部分。现在参考图11，显示了96孔平板的布局，这是从图10中所示的特殊统计设计转化而来的。特别地，该96孔平板包括了图10所示的孔组成，例如固定在每个孔底部的细胞附着配基组合。特别地，图10中进行的实验按以下对应于图11中的行/列图10设计中的运行1-10分别代表图11中的阵列的B行，2-11列；运行11-20代表C行，2-11列；运行21-30代表D行，2-11列；运行31-40代表E行，2-11列；运行41-50代表F行，2-11列；运行51和52分别代表G行，2和3列。如图10中的统计设计以及图11中相应的96孔平板布局所示，本发明的一个实施方案是除了物质混合物以外，单一物质也可以加入容器中。
实施例4特异于MC3T3-E1成骨细胞的ECM筛选MC3T3-E1来自Dr.L.D.Quarles，Duke University，由Dr.Gale Lester，University of North Carolina at Chapel Hill惠赠。使用标准的细胞培养技术培养这些细胞。MC3T3-E1是很好表征的、生长迅速的成骨细胞系，选择它的原因在于它对大多数常用的组织培养表面有强的附着。根据本领域内众所周知的方法使用胰蛋白酶-EDTA从细胞培养瓶中取出细胞。对细胞进行计数，离心并且重悬于不含血清的培养基或者含有10％胎牛血清的培养基中。根据图11所示的布局和以上实施例3中的描述，将细胞置于96孔微阵列的孔中。接种密度是每孔大约10000个细胞。在37℃下细胞在平板上孵育过夜。第二天，去掉培养基以及没有附着于孔表面的固定化物质上的细胞。使用福尔马林处理至少15分钟固定所有附着的细胞。使用碘化丙啶(propidiumiodite)对所述的固定后的附着细胞的细胞核进行荧光标记。使用荧光显微镜(Discovery-1，Universal Imaging Corporation，asubsidiary of Molecular Devices，Downingtown，PA.)得到ECM筛选平板中附着于孔中的荧光标记细胞的图像。从96孔平板得到的图像的实例在图12中显示。特别地，除了G行，4-11列用作对照孔以外，布局与图11中所示的布局相同。在图12中将含有10％胎牛血清的培养基中的MC3T3-E1细胞置于平板的孔中，除了孔G4-G9只含有透明质酸表面，孔G10和G11只包含组织培养级的聚苯乙烯以外，其他孔内含有已经束缚于透明质酸表面的物质的混合物。正如预期，在孔G4-G9中的只含透明质酸的表面抑制细胞附着。在该实施例中，在孔G10和G11中聚苯乙烯表面的细胞附着非常低。相反，一些含有细胞附着配基的孔显示了强烈的细胞附着，这可以从大量的白点看出，每一个白点代表附着细胞的细胞核。使用了图像分析软件包(Meta Morph，UniversalImaging Corporation，a subsidiary of Molecular Devices，Downingtown，PA.)对图12中荧光标记的细胞核进行计数，对于没有胎牛血清以及含有10％胎牛血清的培养基中细胞核计数的结果显示于图13中。在图13中，孔1-10对应于图9中的行B，列2-11；图12中的孔11-20对应于图12中的行C，列2-11，等等。在图13中，在存在10％胎牛血清的条件下，在一些孔中观察到细胞附着。在没有血清的情况下，细胞附着降低，但是仍然可以在一些孔中观察到细胞附着。两种情况下，在一些含有根据统计设计实验的细胞附着配基的孔中，细胞附着超过了普通组织培养级聚苯乙烯上培养的细胞的附着(图12中的孔59和60)。这些得到的结果确定了一些比最为常用的细胞培养支持物--组织培养级聚苯乙烯更好支持MC3T3-E1附着的表面。为了对表面进行优化，可以从两个方向入手，例如“最佳孔”组合物或者“最佳因子”。根据对实验结果的严格统计分析确定“最佳因子”。在“最佳孔”方法中，选择具有最佳实验结果的孔进行进一步优化。在图13中所示的实例中，可以选择具有最高细胞核数目的孔40(或者孔E11)，这个孔含有根据图11中所示的平板布局的VI型胶原蛋白和III型胶原蛋白混合物。根据使用模型ECM，纤连蛋白用MC3T3-E1细胞进行的初始浓度依赖研究，选择用于制备ECM筛选平板中的固定化步骤的VI型胶原蛋白和III型胶原蛋白的浓度。注意到对于研究中的一种细胞类型最佳的浓度对于另外一种细胞类型不一定是最佳的。而且，对于给定细胞类型最佳的某种ECM的浓度对于另外一种ECM不一定是最佳浓度，即使使用相同的细胞类型。类似地，在“选中的孔(hit well)”中混合物的组成不一定是最佳的。例如，“最佳孔”孔E11的表面包含50/50的VI型胶原蛋白和III型胶原蛋白的混合物。可以进行后续实验对选择用于固定化步骤的两个配基的浓度，以及对于结合在对于一个给定细胞类型所“选中”的孔表面的混合物组成(50/50混合物可能不是最佳组成)进行优化。在“最佳因子”方法中，使用统计模型对实验结果进行分析。对于以上描述的实例，对MC3T3-E1数据的混合物模型分析显示在没有血清的情况下，当胶原蛋白IV、层粘连蛋白以及聚L-赖氨酸(边缘效应)显著大量地存在时，细胞计数提高，如图14显示。所有图线的交叉点对应于中点，在这里所有10个ECM都是每个5微升。这个图形提示了细胞计数是如何变化的，这取决于孔组成对于这个参考“中点”混合物的偏离有多远。可以看出，随着胶原蛋白IV或者层粘连蛋白的增加，细胞计数增加。现在参考图15，在10％血清存在的情况下，在图14中观察的聚L-赖氨酸的所有效应都消失了，只有胶原蛋白IV和层粘连蛋白对细胞计数持续显示正作用。注意到“最佳孔”和“最佳因子”方法都是有效的，但是每种方法会产生不同的表面组合。在本实施例中。“最佳孔”方法将产生的表面包含VI型胶原蛋白和III型胶原蛋白，而“最佳因子”方法产生的表面包含胶原蛋白VI和层粘连蛋白。
实施例5使用统计设计实验(Plackett-Burman设计)筛选30个不同的物质设计本实施例描述了如图16(a-d)中所示的Plackett-Burman(PB)设计，该设计使用了商业可以获得的SAS研究所(Cary，NC)的软件包JMPTM。特别地，使用SAS/JMP V 4.0.5中的客户设计功能产生筛选设计。软件包是GUI定向软件包，所以没有可以显示的编码。参考图16a，第一列是转化为96孔平板中单一点的实验点(运行)的列表，例如在该情况下是60个孔。电子数据表自身内的数目(-1或者1)(图16a-d)表示了因子的水平。在该实施例中。“1”表示存在该因子，“-1”表示不存在该因子。而且，在该实施例中，如果在一个给定的孔中存在某因子，就孔的总体积而言，该因子总是相同的浓度存在。孔与孔之间的总物质浓度可能根据相应的实验运行中所包括的物质的数目而有所不同。在图16a-d最上面一行提供了通称因子的名称。图17显示了该实验中每个通称因子F01-F30的身份。例如第一列中的实验运行1可能表示了96孔平板的孔1。从图16(a-d)所示的统计设计可以看出孔1中存在以下的因子(即水平“1″)F04，F08，F09，F11，F12，F14，F16，F20，F23，F25，F26，F27和F29。
提议的数据获取以及统计分析根据图16(a-d)的电子数据表中所显示的设计将细胞置于96孔平板的孔内。接种密度是大约每孔10000个细胞。在37℃下细胞在平板上孵育过夜。第二天，去掉培养基以及没有附着于孔表面的固定化物质上的细胞，使用福尔马林处理至少15分钟固定所有附着的细胞。对固定后的附着细胞的细胞核进行荧光标记，使用以上在实施例4中描述的荧光显微镜获得图像。使用图像分析软件包(Meta Morph，Universal Imaging Corporation)计数荧光标记的细胞核，得到细胞的细胞核计数结果。根据这些结将细胞置于果，选择具有最佳实验结果(例如最多的细胞核数目)的孔进一步进行优化。通过检查给出最佳结果的孔的内容物，得到关于哪个因子和/或因子组产生有益作用的信息。通过在设计中包括许多因子，可以确定因子间潜在的更为复杂的相互作用。后续筛选实验可以集中于在第一轮筛选中发现的特别有意义的因子的组合。在第一轮筛选之后，对主要效果进行评估和回顾。“主要效果”的意思是单独作用的单一因子产生的效果。相互作用效果的意思是一个以上单一因子共同作用(不是单独作用)时产生的组合效果。这时在统计模型中对物质间的相关相互作用通常不进行评估，但是将预期物质间的相互作用会产生最佳的实验运行，即最佳的孔。在第一轮筛选以后，确定最佳的孔和这些孔中包括的因子(水平＝“1”)。可以使用孔中包括的所有因子对每个最佳的孔进行后续实验，不论这些因子在初始统计分析中具有正面、中性或者负面的效果。可以使用在最佳孔中确定的物质的子集重复进行实验，以产生最佳的因子子集用于在细胞中产生所需的应答。而且，可以改变最佳孔中物质浓度而重复实验。也可以使用具有统计显著主要效果的单一物质子集或者将最佳单一物质子集与在最佳混合物中确定的子集组合，进行后续实验。已经提出通过细胞外条件的细胞表型控制受到细胞外环境中因子间高级别相互作用的控制。相信这里提出的Plackett-Burman设计对于主要效果会提供良好的统计评估，并且也提供了在其实验运行中观察多种因子组合的机会。在这种情况下，预计更高级别的相互作用会产生是“最佳孔”的特殊的实验运行，其优于由最佳孔中的物质的单独主要效果预测的。
权利要求
1.用于鉴定导致细胞表型改变的物质的自动化方法，包含以下步骤提供阵列形式的容器；提供包括通称因子名称、因子水平以及实验运行的统计设计；使用软件程序产生所述统计设计的计算机表示，所述的计算机表示通过自动在物质的身份与所述通称因子的名称之间、在所述物质的浓度或量与所述的因子水平之间、以及在所述容器在所述阵列中的位置与所述实验运行之间找到对应而产生；根据所述统计设计的所述计算机表示将单一的所述物质的不同混合物置于位于所述阵列中的选择的所述容器中；使所放置的混合物与所述细胞接触；获得表示在所述被接触的细胞表型改变的数据；使用包括用于比较所述表型数据与所述统计设计的算法的处理器，鉴定哪一种所述的单一物质的混合物和/或所述混合物中的哪一种所述单一物质对于在所述被接触的细胞中产生所述表型改变是有效的；以及在一个或者多个数据库中储存所述的统计设计、所述的物质身份、所述统计设计的所述计算机表示、所述的获得的数据和所述算法比较的结果。
2.权利要求1的方法，其中用户向所述的软件程序中输入所述物质的所述身份和所述浓度或量。
3.权利要求1的方法，其中用户向所述的软件程序中输入所述的统计设计。
4.权利要求1的方法，还包含产生计算机程序用于机器自动化系统进行所述放置步骤。
5.权利要求1的方法，还包含向所述阵列中的其他所述容器中放置单一的所述物质的步骤。
6.权利要求1的方法，其中所述的容器包括包被了物质固定材料的表面。
7.权利要求6的方法，还包含将所述的单一物质的混合物共价固定在所述容器表面上的所述物质固定材料上。
8.权利要求6的方法，其中所述的物质固定材料是包括了用于共价固定所述物质的反应性基团的生物相容聚合物。
9.权利要求1的方法，其中所有所述的数据库是单一综合或者联合数据库。
10.权利要求1的方法，其中有效导致所述表型改变的所述混合物通过拟合统计模型而确定。
11.权利要求1的方法，其中有效导致所述表型改变的所述混合物通过直接在所述混合物间比较和/或与对照进行比较而确定。
12.权利要求1的方法，其中所述的处理器还包括用于比较所述单一物质或者所述单一物质混合物在多次实验中表现的算法，以确定趋势或者型式，其中所述的比较储存于数据库中并且可以定期更新。
13.权利要求1的方法，其中所述的统计设计是分部析因设计、D-最优设计、混合物设计或者Plackett-Burman设计。
14.权利要求1的方法，其中所述的统计设计是基于覆盖标准的空间填充设计，点阵设计或者拉丁方设计。
15.权利要求1的方法，其中所述的物质包含细胞配基和/或外因子。
16.权利要求15的方法，其中所述的物质选自由以下各项组成的组细胞外基质蛋白、细胞外基质蛋白片段、肽、生长因子、细胞因子以及它们的组合。
17.权利要求1的方法，还包含使用所述鉴定的单一物质混合物的子集重复所述的步骤。
18.权利要求1的方法，还包含重复所述的步骤，其中在所述鉴定的单一物质混合物中单一物质的浓度有所改变。
19.权利要求1的方法，还包含鉴定与所述表型改变相关的内部细胞机制的步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述的细胞机制的鉴定包括提取细胞途径的科学信息并且将所述提取的信息与所述的单一物质的鉴定混合物以及所述的表型改变进行比较。
21.权利要求20的方法，其中所述的信息是计算机提取的。
22.权利要求20的方法，其中所述的信息包含基因表达数据、蛋白质表达数据、细胞表型数据、信号传导数据、细胞途径数据以及它们的组合。
23.权利要求19的方法，其中所述的细胞机制的鉴定包括鉴定在所述鉴定的单一物质混合物存在的情况下由所述细胞表达的基因和/或蛋白质。
24.权利要求19的方法，其中所述的细胞机制的鉴定包括鉴定在所述鉴定的单一物质混合物存在的情况下在所述的细胞上哪些受体被激活。
25.权利要求1的方法，其中所述的处理器还包括第一应用程序，用于计算细胞途径、蛋白质或者基因参与与所述鉴定的单一物质混合物相关的细胞表型改变的可能性，其中使用科学信息确定所述的细胞途径或者蛋白质。
26.权利要求25的方法，其中所述的科学信息选择自由以下各项组成的组基因表达数据、蛋白质表达数据、细胞表型数据、信号传导数据、细胞途径数据以及它们的组合。
27.权利要求25的方法，其中所述的科学信息储存于一个或者多个数据库中。
28.权利要求25的方法，其中所述的科学信息包含在所述鉴定的单一物质混合物存在的情况下由所述细胞表达的基因和/或蛋白质的鉴定。
29.权利要求25的方法，其中所述的科学信息包含在所述鉴定的单一物质混合物存在的情况下在所述的细胞上被激活的受体的鉴定。
30.权利要求1的方法，其中所述的表型数据通过免疫细胞化学分析获得。
31.权利要求30的方法，其中所述的免疫细胞化学分析确定是否存在表明在特定的单一物质混合物存在的情况下所述的细胞的增殖或者分化的生物标记。
32.用于鉴定导致细胞表型改变的物质的系统，包含容器的阵列，具有选择性的容器用于接受(i)单一所述的物质的不同混合物以及(ii)包括所述细胞的流体；包括通称因子名称、因子水平以及实验运行的统计设计；用于产生所述统计设计的计算机表示的软件程序，其中所述的软件程序自动在所述物质的身份与所述通称因子名称之间找到对应，在所述物质的浓度或者量与所述因子的水平之间找到对应，在所述阵列内所述容器的位置与所述实验运行之间找到对应；所获得的表明所述细胞出现所述表型改变的实验数据；包括用于比较所述实验数据与所述统计设计的算法的处理器，确定哪一种所述单一物质的混合物和/或所述混合物中的哪一种所述单一物质对于使所述细胞产生所述表型改变是有效的；以及一个或者多个数据库，用于储存所述统计设计、所述物质的身份、所述统计设计的所述计算机表示、所述获得的实验数据以及所述算法比较的结果。
33.权利要求32的系统，其中所述的数据库是单一综合或者联合数据库。
34.权利要求32的系统，还包含机器自动化系统，后者根据所述统计设计的所述计算机表示，将所述的单一物质的混合物正确地置于所述容器中。
35.权利要求34的系统，还包含带有指令的计算机程序，用于所述机器自动化系统根据所述统计设计的所述计算机表示，将所述的单一物质的混合物正确地置于所述容器中。
36.权利要求31的系统，其中所述的处理器还包括用于比较所述单一物质或者所述单一物质混合物在多次实验中表现的算法，以确定趋势或者型式，其中所述的比较储存于数据库中。
全文摘要
提供了用于鉴定能够引发某一细胞类型表型改变的物质的自动化方法和系统。该方法包括了以下的步骤提供了阵列形式的容器；并且提供了统计设计，包括通称因子名称、因子水平和实验运行。该方法还包括使用软件程序，通过自动在物质的身份和通称因子名称间找到对应、在物质的浓度或量与因子水平间找到对应、在阵列中的容器位置与实验运行间找到对应，产生统计设计的计算机表示。该方法还包括根据统计设计的计算机表示将单一物质的不同混合物置于阵列中的容器内；使放置的混合物与细胞接触；从被接触的细胞获得实验数据；以及使用包括算法的处理器，算法用于将获得的数据与统计设计进行比较，鉴定导致被接触细胞表型改变的特定物质混合物或者单一物质。
文档编号G06Q50/00GK1890676SQ200480029218
公开日2007年1月3日 申请日期2004年8月26日 优先权日2003年9月15日
发明者P·D·哈兰, M·A·海达兰 申请人:贝克顿·迪金森公司