专利名称：用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种用于外加直流电场下观察细 胞生物学行为的装置。
背景技术：
直流电场(direct-current electric fields, dcEF )在生物体中广泛存 在，是由于多种带电离子(如Na+、 K+、 Ca2+、 HC03—、 CI —等)在细胞内外、细 胞与细胞之间、组织和器官不同部位分布的差异而产生的。近年来，人们对 直流电场的生物效应的研究逐渐深入，涉及胚胎发育中组织形成、炎症反应 以及损伤修复等细胞生物学各个领域，已经证实多种细胞的运动、分裂，如 胚胎发育中神经细胞的迁移、肿瘤细胞的侵袭与转移等，受到直流电场的影 响；应用外加直流电场刺激，可引导轴突再生治疗难治性脊髓损伤修复，或 调节皮肤伤口愈合等。直流电场的生物效应研究正日益受到人们的重视，其 研究意义重大，目前尚处于起步阶段，主要是在细胞水平上对直流电场下细 胞的生物学行为进行研究。此项研究需要一种制作简便、性能稳定、重复性 好、可用于实时动态观察的装置，能够产生稳定的生理强度的电场，长时间 作用于培养的细胞，并能在显微镜下观察细胞活动情况。
此种装置目前较成熟的是文献报道的Min Zhao等制作的装置(Nature Protocols, 2(6): 1479-1489， 2007; Nature, 442: 457-460, 2006),即 先制作一个方形的玻璃井；再在细胞培养皿底部并排粘上两块盖玻片，两块 盖玻片之间留出 一 定距离形成通道，用314 0硅胶在培养皿底部沿两块盖玻片 的上缘和下缘(通道部分截断)分别筑二道隔离堤，使电流仅从通道通过； 然后将玻璃井置于通道中，井内加入细胞悬液，待细胞在通道底部贴壁生长
后移除玻璃井，在通道顶部、于两块盖玻片之间粘上盖玻片，形成电流通过
空间；再在培养皿中加入培养基；最后盖上培养皿盖，接上琼脂胶盐桥、银-氯化银电极及电源，置显微镜下进行观察。但该装置存在以下缺陷(l)制 作复杂、耗时且不能重复使用；(2)每次制作的装置之间可能存在误差而影 响实验结果的精确性；(3)每次制作时需粘贴盖玻片和涂胶，易破坏细胞培 养部位的无菌状态，且硅胶在完全干燥前可能释放某些化学物质至培养基中 而导致培养基的污染；(4)通道顶部粘贴的盖玻片的高度难以阻挡培养基漫 过，当加入培养基过多或移动培养皿时培养基易漫过盖玻片而影响观察；(5) 对观察的细胞难以定位，无法将某细胞的生物学行为观察结果与后续的分子 生物学或细胞生物学检测结果相对照；(6)难以实现同等条件下两种细胞的 直观比较；现有技术中，比较两种细胞多采用分别观察，再将数据进行统计 学处理的方法，其缺点在于无法保证每次实验条件完全一致；也可采用对其 中一种细胞进行焚光标记，然后在同一细胞爬片上同时观察两种细胞的方法， 其缺点在于需将能够表达焚光蛋白的载体转染入细胞，成本昂贵，操作复杂， 对转染效率要求高，在不能100"/。表达荧光蛋白的情况下，很难对两种细胞各 自的生物行为学进行准确的判断；还可采用在同一爬片上筑隔离堤，在隔离 堤两边分别培养两种细胞的方法，其缺点在于培养细胞时两种细胞极易混合， 且隔离堤往往不能做得足够薄，难以达到在同 一显微镜视野下观察两种细胞 的目的；(7)不能实时监测或控制通过细胞的直流电场的强度，并通过监测 随时对电源输出的电压进行调整；(8 )不能序贯性观察不同电场方向对细胞 的影响。
唐波等在Min Zhao等的基础上制作了 一种改进装置(第三军医大学学报， 27 (7): 683-684, 2005 ),包括直流电源、电;f及系统、〗現测小室和细胞培养 室。其改进点主要在于先在盖玻片上培养细胞，再将制好的细胞爬片放入 载玻片上的"U"型槽中，在"U"型槽顶部粘贴载玻片，形成观测小室；然 后将观测小室粘贴至一个由有机玻璃制成的方形小室的底板正中，制成细胞 培养室；细胞培养室顶盖上位于观测小室上方设置两孔，用于实验中测量电 压。这些改进仅克服了Min Zhao等制作装置的部分不足，仍然存在制作较复 杂，制作过程易导致污染，培养基易漫过盖玻片，对观察的细胞难以定位， 难以实现同等条件下两种细胞的直观比较，不能序贯性观察不同电场方向对 细胞的影响等缺陷，且有机玻璃制成的细胞培养室不能应用常规的高压消毒。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于外加直流电场下观察细胞生物 学行为的装置，不仅性能稳定，可重复使用且重复性好，能实现实时动态监 测，而且可对观察的细胞进行定位，可实现同等条件下两种细胞的直观比较， 可序贯性观察不同电场方向对细胞的影响。
为达到上述目的，本发明的用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的 装置，包括电源、电极交换瓶、盐桥、电极、细胞爬片和培养观察组件，其 特征在于所述细胞爬片平面上设置形成网格的定位线。
进一步，所述培养观察组件包括培养基室和观察室，培养基室为两个， 分别与观察室设置为一体，两个培养基室沿水平方向设置在观察室两侧，培 养基室高度至少为观察室高度的3倍；
进一步，所述培养观察组件包括培养基室和观察室，培养基室为四个， 分别与观察室设置为一体，四个培养基室呈十字型设置在观察室四周，培养 基室高度至少为观察室高度的3倍；
进一步，所述培养基室至少一个为梯形，所述梯形培养基室与观察室连 通部分为梯形的上底；
进一步，还包括固定组件，所述固定组件包括容器和容器盖；容器盖上 设置观察孔、电极插入孔、盐桥插入孔和培养基更换管道插入孔；电极插入 孔、盐桥插入孔和培养基更换管道插入孔的数量和培养基室的数量相对应； 观察孔的位置与观察室的位置相对应，电极插入孔的位置与培养基室和观察 室的连通处的位置相对应，盐桥插入孔的位置与培养基室的位置相对应，培
养基更换管道插入孔的位置与培养观察组件对角线两端的位置相对应；所述 容器盖上电极插入孔和培养基更换管道插入孔处插入并固定设置中空立柱；
进一步，所述电极交换瓶设置密封盖，形成封闭式电极交换瓶，所述密 封盖上设置电极插入孔和盐桥插入孔；
进一步，所述电源为稳压直流电源，可显示电流、输出电压和监测电压， 所述监测电压为额定电压；
进一步，所述细胞爬片为直角梯形，使用时为两张细胞爬片斜边切合并 列设置。
本发明的用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的装置，其有益效果 在于
(1) 采用平面上设置形成网格的定位线的细胞爬片，可达到对观察的细 胞进行定位的目的，与相关进一步实验的衔接能力强，即使后续进行分子生 物学检测或细胞生物学检测(如免疫细胞化学染色，免疫荧光染色等)时， 细胞爬片离开显微镜的视野去进行染色等操作，待其重新回到显微镜的视野 中时，易于将之前观察的某细胞的后续检测结果与其生物学行为进行对照， 从而使实验结果更加客观、准确；
(2) 采用预制的、独立的、设置为一体的培养观察组件，实验时不需要 临时涂胶或粘贴等步骤，可达到简化操作、缩短时间、避免污染组件和培养 基的目的；使用前可按常规方法清洗、消毒，消毒后可重复使用，减少因每 次临时制作装置所造成的误差；使用时直接将细胞爬片插入观察室即可，使 用方便；
(3) 采用培养基室高度至少为观察室高度的3倍的结构，可将培养基很 好的保存在培养基室内，不会因为加入培养基较多或移动培养皿时使正、负 极的培养基漫过观察室顶部，出现额外电流通过，另外还可以保持观察室顶 部的清洁，保证良好的观察效果；
(4) 采用四个培养基室呈十字型设置在观察室四周的结构，进一步拓展
了装置的实验功能，可在不移动观察窗的情况下，实现从与直流电场相垂直 的方向更换培养基，减少从与直流电场平行方向更换培养基时培养基的流动
对细胞行为可能造成的影响；还可在不移动观察窗的情况下，改变直流电场 方向，序贯地观察方向垂直的两个电场对细胞运动方向的影响，从而使实验 结果更加客观、可靠；
(5)采用培养基室至少一个为梯形，梯形培养基室与观察室连通部分为 梯形的上底的结构，可起到导向作用，能够方便、快速地将细胞爬片插入观 察室；
(6 )显微镜观察需要光线从装置中间透过，采用容器盖上设置观察孔的 结构，可减少对光线的阻挡，保证良好的观察效果；采用容器盖上设置电极 插入孔的结构，用于固定电极，可实时监测观察室两侧的电压变化；培养基 经过长时间后可能由于细胞代谢而无法维持细胞的活力，此时应更换培养基 使细胞获得合适的环境，保持活力，以便进行长时间的观察，采用容器盖上 设置培养基更换管道插入孔的结构，可在不移动观察窗的情况下，方便地更 换培养基；
(7 )采用呈对角线设置的培养基更换管道插入孔，和容器盖上电极插入 孔、培养基更换管道插入孔处插入并固定中空立柱的结构，在容器中放入培 养观察组件并盖上容器盖的同时，可通过中空立柱卡住培养基室内侧，达到 固定培养观察组件的目的，保证培养观察组件在容器内不会发生移动或晃动 而使观察窗移动；
(8 )采用封闭式电极交换瓶盛装电解质溶液完成金属电极向琼脂盐桥电 极的转换，可达到保证电解质无菌并且增强装置稳定性的目的；
(9) 采用显示电流、输出电压和监测电压的稳压直流电源，可达到以监 测电压为额定电压，电源自动调节输出电压的大小，即直接额定应用于观察 室两侧的电压的目的；
(10) 采用两张直角梯形细胞爬片斜边切合并列设置使用的结构，可消
除或尽量减小两张细胞爬片并列设置时的缝隙，达到在同等条件、同一显微 镜视野下对两种不同的细胞进行直观对比观察的目的，便于研究两种细胞在
相同直流电场下是否具有不同的生物学行为；
(11)本发明装置由各组件组装后结构和性能稳定，产热小、散热快、 对培养基的影响小，可长时间持续观察，能够很好地满足相关实验的技术要求； 不仅能用于倒置显微镜，也能用于正置显微镜，对其它配套设备的适应能力强； 本发明装置可制成标准化产品，便于对不同时间或不同实验室的实验结果进行 比较；具有很好的应用前景和市场价值。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本 发明作进一步的详细描述，其中 图1为矩形细胞爬片结构示意图； 图2为直角梯形细胞爬片结构示意图； 图3为本发明实施例一的培养观察组件的纵向剖视图； 图4为图3沿A-A向剖;f见图5为本发明实施例二的培养观察组件的剖视图； 图6为本发明直角梯形细胞爬片使用状态示意图； 图7为本发明的使用状态示意图； 图8为本发明容器盖的结构示意图。
具体实施例方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。 本发明的用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的装置，包括电源、 电极交换瓶、盐桥、电极、细胞爬片、培养观察组件。
图1为矩形细胞爬片结构示意图，图2为直角梯形细胞爬片结构示意图，
如图所示在玻片l平面上设置形成网格的定位线2。
图3为本发明实施例一的培养观察组件的纵向剖视图，图4为图3沿A-A 向剖视图，如图所示本实施例的培养观察组件包括观察室3和两个培养基室 培养基室I 41和培养基室I142，两个培养基室分别与观察室3设置为一体， 沿水平方向设置在观察室3的两侧，培养基室高度为观察室3高度的3倍， 培养基室和观察室3相连通；培养基室I 41为梯形，梯形培养基室与观察室 3连通部分为梯形的上底。在本实施例中，培养基室II42也可和培养基室I 41 一致，设计为梯形。
图5为本发明实施例二的培养观察组件的剖视图，如图所示本实施例 的培养观察组件包括观察室3和四个培养基室培养基室I41、培养基室II 42,培养基室III43和培养基室IV44,四个培养基室分别与观察室3设置为一 体，呈十字型设置在观察室3四周，培养基室高度为观察室3高度的3倍， 培养基室和观察室3相连通；培养基室I 41为梯形，梯形培养基室与观察室 3连通部分为梯形的上底。在本实施例中，其他培养基室也可和培养基室I 41一致，设计为梯形。
图7为本发明使用状态示意图，图8为本发明容器盖的结构示意图，如 图所示本发明装置还包括固定组件，固定组件包括容器5和容器盖；容器 盖上设置观察孔61、电极插入孔64、盐桥插入孔62和培养基更换管道插入 孔63;电极插入孔64、盐桥插入孔62和培养基更换管道插入孔63的数量和 培养基室的数量相对应；当在容器中放入培养观察组件并盖上容器盖时，观 察孔61的位置与观察室3的位置相对应，电极插入孔64的位置与培养基室 和观察室3的连通处的位置相对应，盐桥插入孔62的位置与培养基室的位置 相对应，培养基更换管道插入孔6 3的位置与培养观察组件对角线两端的位置 相对应；容器盖上电极插入孔64和培养基更换管道插入孔63处插入并固定 设置中空立柱65,中空立柱65的长度为可插入培养基室内侧，保证培养观 察组件在容器内不会发生移动或晃动而使观察窗移动。在本发明中，针对图 3和图5所示的培养观察组件的两种结构，容器盖也可相应制成两种结构， 一种结构是容器盖上设置一个观察孔61、两个电极插入孔64、两个盐桥插入 孔62和两个培养基更换管道插入孔63，可和图3所示的培养观察组件配套 使用；另一种结构是容器盖上设置一个观察孔61、四个电极插入孔64、四个 盐桥插入孔62和四个培养基更换管道插入孔63,可和图5所示的培养观察 组件配套^f吏用。
图6为本发明直角梯形细胞爬片使用状态示意图，图7为本发明使用状态 示意图，如图所示采用本发明的直角梯形细胞爬片，用于同等条件下直观对 比两种细胞的生物学行为时，使用两张细胞爬片细胞爬片I和细胞爬片II, 将两种细胞分别铺于细胞爬片I和细胞爬片II上，观察时将细胞爬片I和细 胞爬片II从不同的方向、以斜边切合的方式插入观察室3，斜边切合过程可 以使两张细胞爬片之间的缝隙达到最小，便于在同 一显微镜视野下同时观察 两种不同细胞的生物学行为。
本发明的电极交换瓶设置密封盖，形成封闭式电极交换瓶，密封盖上设 置电极插入孔和盐桥插入孔。
本发明的电源为稳压直流电源，可显示电流、输出电压和监测电压，可 以监测电压为额定电压，电源自动调节输出电压的大小。
本发明装置的使用和组装顺序为
(1) 在细胞爬片上培养细胞；
(2) 在培养基室中加入细胞培养基，将表面有细胞贴壁生长的细胞爬片 插入观察室；
(3) 将培养观察组件放入容器内，盖上容器盖，放置于显微镜下，连接 盐桥、电极交换瓶、电极和电源，需要的情况下连接培养基更换管道，设定 电源电压，打开电源，进行观察；可以设定监测电压为额定电压，采用电源 自动调节输出电压大小的模式进行观察。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽 管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通 技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不 偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1、用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的装置，包括电源、电极交换瓶、盐桥、电极、细胞爬片和培养观察组件，其特征在于所述细胞爬片平面上设置形成网格的定位线(2)。
2、 根据权利要求1所述的用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的 装置，其特征在于所述培养观察组件包括培养基室和观察室(3),培养基 室为两个，分别与观察室(3)设置为一体，两个培养基室沿水平方向设置在 观察室(3)两侧，培养基室高度至少为观察室(3)高度的3倍。
3、 根据权利要求1所述的用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的 装置，其特征在于所述培养观察组件包括培养基室和观察室(3),培养基 室为四个，分别与观察室(3)设置为一体，四个培养基室呈十字型设置在观 察室(3)四周，培养基室高度至少为观察室(3)高度的3倍。
4、 根据权利要求2或3所述的用于外加直流电场下观察细胞生物学行 为的装置，其特征在于所述培养基室至少一个为梯形，所述梯形培养基室 与观察室(3)连通部分为梯形的上底。
5、 根据权利要求1至3任一权利要求所述的用于外加直流电场下观察 细胞生物学行为的装置，其特征在于所述培养基室为矩形，还包括固定组 件，所述固定组件包括容器(5)和容器盖；容器盖上设置观察孔(61)、电 极插入孔(64)、盐桥插入孔(62)和培养基更换管道插入孔(63);电极 插入孔(64)、盐桥插入孔(62)和培养基更换管道插入孔(63)的数量与 培养基室的数量相对应；观察孔(61)的位置与观察室(3)的位置相对应， 电极插入孔(64)的位置与培养基室和观察室(3)的连通处的位置相对应， 盐桥插入孔(62)的位置与培养基室的位置相对应，培养基更换管道插入孔(63)的位置与培养观察组件对角线两端的位置相对应；所述容器盖上电极 插入孔(64 )和培养基更换管道插入孔(63 )处插入并固定设置中空立柱(65 )。
6、 根据权利要求5所述的用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的 装置，其特征在于所述电极交换瓶设置密封盖，形成封闭式电极交换瓶， 所述密封盖上设置电极插入孔和盐桥插入孔。
7、 根据权利要求6所述的用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的 装置，其特征在于所述电源为稳压直流电源，可显示电流、输出电压和监 测电压，所述监测电压为额定电压。
8、 根据权利要求1、 2、 3、 6、 7之任一权利要求所述的用于外加直流 电场下观察细胞生物学行为的装置，其特征在于所述细胞爬片为直角梯形， 使用时为两张细胞爬片斜边切合并列设置。
9、 根据权利要求4所述的用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的 装置，其特征在于所述细胞爬片为直角梯形，使用时为两张细胞爬片斜边 切合并列设置。
10、 根据权利要求5所述的用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的 装置，其特征在于所述细胞爬片为直角梯形，使用时为两张细胞爬片斜边 切合并列设置。
全文摘要
本发明公开了一种用于外加直流电场下观察细胞生物学行为的装置，包括电源、电极交换瓶、盐桥、电极、细胞爬片和培养观察组件，细胞爬片平面上设置形成网格的定位线；本发明装置不仅性能稳定，可重复使用且重复性好，能实现实时动态监测，而且可对观察的细胞进行定位，可实现同等条件下两种细胞的直观比较，可序贯性观察不同电场方向对细胞的影响。
文档编号C12M3/00GK101353624SQ20081007028
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月11日 优先权日2008年9月11日
发明者华 冯, 卢佳友, 吴国材, 梅 李, 飞 李 申请人:中国人民解放军第三军医大学