专利名称：靶向肿瘤的模拟逆转录病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种靶向肿瘤的模拟逆转录病毒
(mimoretrovirus )及其制备方法和应用。
背景技术：
现代医学对于肿瘤仍缺乏有效的防治措施。大多数肿瘤的发生与基因变异 密切相关，主要表现在癌基因的突变、扩增、过度表达以及抑癌基因的突变、 失活等方面，因此，抑制肿瘤相关基因的表达是研究与开发新型抗癌疗法的一 个重要思路。RNA干预(RNA interference, RNAi )技术作为一种基因沉默的新 工具，通过小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)特异性结合同源mRNA 并促使其降解，能够快速、高效、特异地抑制靶基因的表达，将其应用到胂瘤 基因治疗领域有着非常光明的前景。
目前，肿瘤基因治疗的首要问题是要能将治疗基因高效率地运送到肿瘤细 胞中，同时尽可能不进入或较少进入正常细胞，因此，建立有效的把向性导入 系统成为当今肺瘤基因治疗的研究热点。由于siRNA合成费用昂贵、体内易降解、 作用时间短、实际操作困难等问题，直接注射siRNA不适于肿瘤防治的长期过程， 而多以基因载体协助siRNA进入细胞。基因载体包括病毒栽体和非病毒载体两大 类。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱渗病毒、痘病毒等，可以高效 率地转染细胞，但其存在如免疫原性和病毒性重组等安全性问题，以及制备过 程复杂，自身容量有限，制得的病毒滴度较低等缺陷。非病毒载体包括阳离子 脂质体、壳多糖、胶原蛋白、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺等，其与病毒载体相比 虽然转染效率有限，但具有无传染性、不限制载体容量、化学结构可控制和可 大量制备等优点，已日益受到研究者的青睐。但是，上述基因载体均存在无肺
瘤细胞靶向性的缺陷。
发明内容
有鉴于此，为克服针对肿瘤相关基因的siRNA在体内靶向递送方面存在的 缺陷，本发明的目的之一在于提供一种靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，以多聚赖 氨酸和RGD肽组成的融合多肽为基因载体，包裹肿瘤相关基因的siRNA逆转录 病毒重组表达载体，自组装而成。
进一步，所述多聚赖氨酸为18个L-赖氨酸连接成的多聚体直链；
进一步，所述RGD肽具有如SEQ ID No. 1所示的氨基S交序列；
进一步，所述融合多肽由多聚赖氨酸与RGD肽通过柔性接头连接而成，所 述柔性接头为氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的多肽片段；
进一步，所述融合多肽由多聚赖氨酸与RGD肽直接连接而成；
进一步，所述肿瘤相关基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体为Pokemon 基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体。
进一步，所述Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA 靶序列I ,如SEQ ID No. 3所示；
进一步，所述Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA 輩巴序列II,如SEQ ID No. 4所示；
进一步，所述Pokemon基因的siRM逆转录病毒重组表达载体含有siRNA 輩巴序列III,如SEQ ID No. 5所示;
进一步，所述Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA 耙序列IV,如SEQ ID No. 6所示。
本发明的目的之二在于提供一种制备所述靶向肺瘤的模拟逆转录病毒的方 法，包括以下步骤
a. 用化学合成法制备融合多肽；
b. 用常规方法制备s iRNA逆转录病毒重组表达载体；
c. 模拟逆转录病毒的制备在浓度为140-160 mmol/L的NaCl条件下，加
入步骤2所得siRNA逆转录病毒重组表达载体，于搅拌条件下，緩慢加入步骤l 所得融合多肽，加完后继续搅拌30 - 40分钟，再静置30 - 60分钟，融合多肽 可包裹siRM逆转录病毒重组表达载体，自组装形成电荷比为2-4的颗粒，即 得模拟逆转录病毒。
本发明的目的之三在于提供所述靶向肿瘤的模拟逆转录病毒在制备抗肿瘤 药物中的应用。
本发明的有益效果在于
1、 本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，具有以下优点(l)RGD肽可与 肿瘤细胞及其新生内皮血管表面的整合素受体特异性结合，引导模拟逆转录病 毒靶向定位到肿瘤细胞，从而大大提高肿瘤基因治疗的安全性和有效性；(2) 多聚赖氨酸为生物可降解的合成高分子，以其为基因载体，无蓄积危害性和传 染性，自身容量无限制，制备方法简便，可大量制备；(3)在RNAi的靶基因选 择上，具有很大的灵活性，只需设计针对不同肿瘤相关基因的siRNA编码序列， 并克隆到逆转录病毒载体中，即可制备出针对特定肿瘤相关基因的模拟逆转录 病毒，或同时针对多种不同肺瘤相关基因的模拟逆转录病毒，达到使多个序列 不相关的基因同时沉默的目的；(4 ) Pokemon基因作用于许多肿瘤抑制基因和原 癌基因的上游，选其作为RNAi的耙基因，有助于肿瘤的根治。
2、 本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的制备方法，操作简便、快速，以 多聚赖氨酸和RGD肽组成的融合多肽可采用化学合成法直接合成，其与siRNA 逆转录病毒重组表达载体仅需在室温条件下反应约1小时，即可制得本发明的 模拟逆转录病毒。
3、 本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒可用于制备抗肿瘤药物，实验结果 证明，本发明的模拟逆转录病毒能够靶向定位到肿瘤细胞，有效介导基因转染， 其介导的针对肿瘤相关基因的RNAi策略能明显抑制肿瘤的发生和增殖，对肿瘤 能够起到较好的预防和治疗效果，具有良好的应用前景。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图，对本
发明作进一步的详细描述，其中
图1为本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的结构和合成示意图2为本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的凝胶阻滞实验结果图3为本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的DNase I保护实验结果图4为本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的透射电镜图5为预防性实-验各组成瘤率比较图6为治疗性实验各组肿瘤生长曲线图。
具体实施例方式
本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的结构和合成示意图如图1所示，以 多聚赖氨酸和RGD肽组成的融合多肽为基因载体，由于多聚赖氨酸富含正电荷， 能够与富含负电荷的siRNA逆转录病毒重组表达载体通过电荷间的相互作用， 自组装形成纳米级的颗粒，即;f莫拟逆转录病毒；由于RGD肽具有肿瘤靶向性， 能够引导模拟逆转录病毒定位到肿瘤细胞，从而完成siDNA的靶向体内递送， 提高肿瘤基因治疗的安全性和有效性。
多聚赖氨酸是生物可降解的合成高分子，能够被体内的胰蛋白酶降解生成 人体内存在的氨基酸，不存在蓄积危害性。在本发明中，所述多聚赖氨酸优选 地为由18个L-赖氨酸连接成的多聚体直链，用fU表示。
RGD肽是一类含有Arg-Gly-Asp 3个氨基酸的小肽，是细胞外基质及血液中 多种粘附蛋白所共有的细胞粘附和分子识别位点，其与肿瘤细胞及其新生内皮 血管表面的整合素受体特异性结合，参与肿瘤细胞的浸润过程。在多聚赖氨酸 上连接RGD肽，不仅可以提高模拟逆转录病毒对肿瘤细胞的选择性，还可以通过 受体介导的内吞作用增强细胞对模拟逆转录病毒的吸收，提高非病毒载体的转 染效率。在本发明中，所述RGD肽优选地为十肽，氨基酸序列如SEQ ID No. l所
示，此RGD肽的两个半胱氨酸(C)之间可通过二硫键成环，从而使-RGD-突出出 来，便于识别肿瘤细胞上的整合素受体。
在本发明中，多聚赖氨酸和RGD肽之间可以直接连接(K18-RGD)，也可以采 用柔性接头(flexible linker)连接(K18-l inker-RGD ),都可以达到发明效果。 所述柔性接头优选地为氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的多肽片段，此柔性接 头具有较强的柔软性，可保证RGD肽的摆动范围在多聚赖氨酸和siRNA逆转录 病毒重组表达载体形成致密颗粒时不受影响，从而保证RGD肽对肿瘤细胞上整 合素受体的可及性。
本发明在RNAi的輩巴基因选择上，具有很大的灵活性，优选对肿瘤细胞生存 才及其关4建的基因，如Pokemon、 MCF-7、 Survivin、 MDM2和P53基因。Pokemon 是POK蛋白家族成员，与细胞分化密切相关，已发现在T、 B细胞淋巴瘤、乳腺 癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌等疾病的肺瘤中均异常高表达，是肿瘤 发生的一个关键因素，其基因作用于许多肿瘤抑制基因和原癌基因的上游，将 Pokemon基因作为RNAi的耙基因将有助于肿瘤的根治。
在哺乳动物细胞中，3，端对称性突出2个核苷酸的约21个核苦酸的双链RM 即siRNA。制备siRNA可采用常规方法，即利用PCR方法，构建一个包含RNA聚合 酶III启动子U6或H1、编码小发夹状shRNA (small hairp in RNA)的DNA模板和 RNA聚合酶III终止子的重组表达载体。将此重组表达载体转染细胞后可转录出 shRNA, shRNA在胞质内被核糖核酸酶(Dicer)剪切成siRNA而发挥作用。许多 逆转录病毒载体可用于siRNA的表达。发明人通过比较研究发现，pSilencer 5. 1-H1 Retro是一种特别优选的载体。
本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，以多聚赖氨酸和RGD肽组成的融合 多肽为基因载体，不仅可以包裹针对一种胂瘤相关基因的siRNA逆转录病毒重 组表达载体，还可以同时包裹多种针对不同肿瘤相关基因的siRNA逆转录病毒 重组表达载体，达到使多个序列不相关的基因同时沉默的目的。
下面将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中
未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第
三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例l、靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的制备
1、 融合多肽的制备
本实施例的融合多肽由多聚赖氨酸与RGD肽的氨基端通过柔性接头连接而 成，用Kis-linker-RGD表示，氨基酸序列为K18-Xaa-Ser-Xaa-Ser-Xaa-Ser-Ala-Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Phe-Gly-Cys-Ala ( Xaa=Acp ),此融合多肽委托吉尔生化 (上海)有限公司釆用固相多肽合成法制备，产物经高效液相色谱(HPLC)和 质谱(MS )鉴定，纯度为97. 6%。
2、 siRNA逆转录病毒重组表达载体的制备
利用美国 Ambion公司提供的在线工具(www.ambion.com/techlib/ misc/siRNAfinder. html )，选取Pokemon基因(Genbank登录号为NM—015898 ) 的siRNA靶序列，4艮据以下选取标准①GC含量在40%-55%之间、②紧接在 连续2个AA下、③不能有连续4个或以上的T或A、④尽量在基因的前面部 分选取、⑤不能含有要使用的限制性酶切位点，获得4条siRNA靶序列，即 siRNA耙序列I -IV,如SEQ IDNo. 3-6所示，经序列同源性比对(BUST ), 确定与其它人类基因无超过16-17连续碱基对同源性序列；再根据siRNA靶 序列I-IV和表达载体pSilencer 5. 1-HI Retro的特点，i殳计并合成针对 siRNA耙序列I、 II、 m或IV的正义链和反义链，共4对，如SEQ ID No. 7-14 所示，正义链5，端有BamH I酶切位点，3，端有RNA聚合酶III终止子序列， 反义链5，端有Hind III酶切位点；
取浓度均为l jig/lLiL的针对siRNA靶序列I 、 II、 III或IV的正义链和反义链 各2 (iL,加入l xDNA退火緩沖液46 ^L,加热至温度90。C孵育3分钟，再降温至 37。C孵育l小时，即得含有siRNA輩巴序列I 、 II、 III或IV的双链DNA;
将所得含有siRNA靶序列I 、 II 、 III或IV的双链DM与逆转录病毒载体 pSilencer 5. 1-HI Retro ( Ambion公司)进行连接，连接方法为溶液I (含 T4连接酶和2x緩冲液)5 pL,双链DNA 1 pL,逆转录病毒载体l jxL，无核酸酶 水3pL,总体积为10)LiL，置温度16。C孵育1小时，定向构建含有siRNA靶序列I 、 II、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体；
将所得含有siRNA靶序列I 、 II、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载 体转化入CaCh法制备的DH5ct大肠杆菌感受态细胞，转化方法为将重组表达 载体10pL加入到感受态细胞100nL中，冰浴30分钟，42。C水浴热休克90秒， 立即水浴2分钟，再加入液体LB培养基O. 9mL,于温度37。C, 250 r/min振摇 1小时，制得转化细胞；
取转化细胞涂布于含氨千青霉素的LB平板上，于温度37。C正置30分钟， 倒置过夜，从LB平板上随机挑取3个白色菌落，接种于液体LB培养基中，于 温度37。C、 150r/min振摇过夜，采用质粒提取试剂盒(omega公司)小量提取 质粒，用BamH I、 Hind 11I双酶切初步鉴定有无插入片^爻后，再通过序列测定 确保插入方向正确，序列顺序正确的质粒即为成功构建的含有siRNA靶序列I 、 II、 m或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体；
3、模拟逆转录病毒的制备
在60 pL、 pH值为7. 4的HBS緩冲液(由浓度为150 mmol/L的NaCl和浓 度为10 mmol/L的Hepes组成)中，加入2 ^L、浓度为500 ng/pL的步骤2所 得的含有siRNA輩巴序列I 、 II 、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体溶液， 于涡旋条件下，逐滴加入0. 5 pL、浓度为2. 65 pg/^iL的步骤1所得的融合多肽 溶液，滴定完毕后于室温条件下继续涡旋30分钟，再静置30分钟，融合多肽 可包裹含有siRNA耙序列I 、 II、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体， 自组装形成电荷比为2的纳米级颗粒，即得含有siRNA靶序列I 、 II、 ni或IV 的模拟逆转录病毒。
实施例2、靶向胂瘤的模拟逆转录病毒的制备 1、 融合多肽的制备
制备方法与实施例1相同；
2、 siRNA逆转录病毒重组表达载体的制备 制备方法与实施例1相同；
3、 模拟逆转录病毒的制备
在60 pL、 pH值为7. 4的HBS緩沖液(由浓度为140 mmol/L的NaCl和浓 度为10 mmol/L的H印es组成)中，加入2 pl、浓度为500 ng/^L的步骤2所 得的含有siRNA乾序列I 、 II、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体溶液， 于涡旋条件下，逐滴加入1 pL、浓度为2. 65 pg4iL的步骤1所得的融合多肽溶 液，滴定完毕后于室温条件下继续涡旋40分钟，再静置50分钟，融合多肽可 包裹含有siRNA耙序列I 、 II、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体，自 组装形成电荷比为4的纳米级颗粒，即得含有siRNA把序列I 、 II、 III或IV的 模拟逆转录病毒。
实施例3、靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的制备
1、 融合多肽的制备
本实施例的融合多肽由多聚赖氨酸与RGD肽的氨基端直接连接而成，用 K18-RGD表示,氨基酸序列为K18-Ala-Cys-Arg-Gly-Asp-Met-Phe-Gly-Cys-Ala,此融合多肽委托吉尔生化(上海)有限公司采用固相多肽合成法制备， 产物经HPLC和MS鉴定，纯度为98.1%;
2、 siRNA逆转录病毒重组表达载体的制备 制备方法与实施例1相同；
3、 模拟逆转录病毒的制备
在60 pL、 pH值为7. 4的HBS緩冲液(由浓度为150 mmol/L的NaCl和浓 度为10 mmol/L的Hepes组成)中，加入2 pL、浓度为500 ng L的步骤2所 得的含有siRNA耙序列I 、 II、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体溶液，于涡旋条件下，逐滴加入0. 5 pL、浓度为2. 15 pg4iL的步骤1所得的融合多肽 溶液，滴定完毕后于室温条件下继续涡旋30分钟，再静置40分钟，融合多肽 可包裹含有siRNA輩巴序列I 、 II、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体， 自组装形成电荷比为2的纳米级颗粒，即得含有siRNA耙序列I 、 II、 III或IV 的模拟逆转录病毒。
实施例4、耙向肿瘤的模拟逆转录病毒的制备
1、 融合多肽的制备 制备方法与实施例3相同；
2、 siRNA逆转录病毒重组表达载体的制备 制备方法与实施例l相同；
3、 模拟逆转录病毒的制备
在60 pL、 pH值为7. 4的HBS緩沖液(由浓度为160 mmol/L的NaCl和浓 度为10 mmol/L的H印es组成)中，加入2 )iL、浓度为500 ng/jiL的步骤2所 得的含有siRNA靶序列I 、 II、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体溶液， 于涡旋条件下，逐滴加入1 (iL、浓度为2. 15 pg/(_iL的步骤1所得的融合多肽溶 液，滴定完毕后于室温条件下继续涡旋35分钟，再静置60分钟，融合多肽可 包裹含有siRNA耙序列I 、 II、 III或IV的siRNA逆转录病毒重组表达载体，自 组装形成电荷比为4的纳米级颗粒，即得含有siRNA耙序列I 、 II、 III或IV的 模拟逆转录病毒。
本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的鉴定 1、凝胶阻滞实验
方法取电荷比为O. 25、 0.5、 1、 2、 4或8的本发明的模拟逆转录病毒各 15 )iL,进行质量百分浓度为0. 8°/ 的琼脂糖凝胶电泳。
结果如图2所示，其中1泳道为DNA分子量标准(1000 bp Laddar ) ， 2
泳道为siRNA逆转录病毒重组表达载体，3-8泳道分别为电荷比为0. 25、 0. 5、 1、 2、 4、 8的本发明的模拟逆转录病毒，从图可见，当电荷比>2时，无电泳 条带显示，表明siRNA逆转录病毒重组表达载体所带的负电荷被融合多肽所带 的正电荷完全中和。
2、 DNA酶I (DNaseI )保护性实验
方法取电荷比为O. 25、 0.5、 1、 2、 4或8的本发明的模拟逆转录病毒各 180 |iL，力口入浓度为10 mmol/L的MgCh和CaCl2溶液20 pL、浓度为0. 5 mg/mL 的DNase I溶液20 置温度37。C反应30分钟后，加入浓度为0. 5 mol/L的 乙二胺四乙酸(EDTA)溶液16^L终止反应，置温度65。C水浴10分钟灭活，再 加入等体积的质量百分浓度为2. 5%的胰酶溶液，置温度37。C孵育150分钟以消 化融合多肽，然后按常规有机溶剂提取法提取质粒(即siRNA逆转录病毒重组 表达载体)，所得质粒加入TE (即pH值为8.0、浓度为10 mmol/L、含有浓度 为0. 1 mmol/L的EDTA的Tris-HC1緩冲液)18 pL使溶解，最后进行质量百分 浓度为0. 8°/ 的琼脂糖凝胶电泳。
结果如图3所示，其中l泳道为制备的质粒，2-7泳道分别为从电荷比为 0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8的本发明的模拟逆转录病毒中提取的质粒，从图可见， 当电荷比>2时，有清楚的、且与原质粒一致的电泳条带，表明电荷比>2的本 发明的模拟逆转录病毒可以完全"fe抗DNase I的消化。
3、 透射电镜观察
方法取电荷比为2或4的本发明的模拟逆转录病毒，以质量百分浓度为 2%的磷鴒酸溶液进行负染色，进行透射电镜观察。
结果如图4所示，其中A为siRNA逆转录病毒重组表达载体，可见其以 较为松散的超螺旋形式存在；B为电荷比为2的本发明的模拟逆转录病毒，可见 其为直径约20nm的颗粒，且大小均匀；C为电荷比为4的本发明的模拟逆转录 病毒，可见随着电荷比增加，模拟逆转录病毒颗粒被进一步压缩，有少数聚集 情况发生，但仍然能达到本发明目的。
本发明的靶向肿瘤的jt拟逆转录病毒的抗肿瘤效应研究
1 、对肿瘤细胞中Pokemon基因的沉默效应研究
方法将本发明的模拟逆转录病毒转染人宫颈癌细胞系Hela细胞，通过荧 光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测Hela细胞中Pokemon基因的表达情况。 具体步骤如下设K18-linker-RGD实验组(以K18-linker-RGD为基因载体形成 的模拟逆转录病毒)、K18-RGD实验组(以K18-RGD为基因载体形成的模拟逆转录 病毒)、"对照组(以Ku为基因载体形成的模拟逆转录病毒)和空白对照组 (siPORTXP-1转染试剂)；根据Pokemon基因序列设计并合成如下引物F: 5, -CCTTTGCCCACAACTACGAC-3，， R: 5， - GCAGCCGTCTTTCTTGAGG - 3，；将本发明的 模拟逆转录病毒转染Hela细胞；在已转染的Hela细胞悬液中，加入Trizol试 剂(Invitrogen公司)，按照试剂说明书提取细胞总RNA;采用试剂盒SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara公司)进行RT-PCR，以提取的细胞总RNA为 模板进行逆转录，反应总体积IO pL，反应条件为37。C水浴15分钟，85。C水 浴5秒；再以逆转录制得的cDNA为模板，以引物F、 R为上下游引物进行cDNA 扩增，反应总体积25pL,反应条件为95'C预变性10秒，然后95'C变性5秒、 63。C退火30秒、80。C延伸5秒，共40个循环，最后于80。C读取荧光信号；以 人管家基因GAPDH为内参照，进行相对定量分析。
结果与空白对照组相比，K18-linker-RGD实—睑组、K18-RGD实验组与Kw对 照组可明显下调Hela细胞中Pokemon基因的表达，3组之间无显著性差异； 当电荷比为2或4时，本发明的才莫拟逆转录病毒对Pokemon基因的沉默效应4交 好，电荷比为2时Pokemon基因的相对表达率为0. 57±0. 04，电荷比为4时 Pokemon基因的相对表达率为0. 66±0. 05。
2、抗肿瘤效应的在体研究 (1)预防性实验
方法SCID小鼠(购自军事医学科学院)共20只，随机分成4组(每组5只)，分别为K18-linker-RGD实验组、K18-RGD实^验组、1(18对照组和空白对照组 (HBS緩沖液)；收集处于对数生长期的Hela细胞，用磷酸盐緩沖液(PBS ) 制成细胞悬液，于小鼠腹股沟皮下注射，每只0.1 mL (约lxlO'个细胞)；在 接种Hela细胞的同时，于小鼠尾静脉注射本发明的模拟逆转录病毒,每只100 (含4 pmol的siRNA逆转录病毒重组表达载体)，每隔5天重复注射1次，共 注射5次，观察肿瘤生成情况。
结果如图5所示，接种Hela细胞后，空白对照组5只小鼠均有肿瘤生成； 而接种Hela细胞并同时注射4莫拟逆转录病毒3周后，U对照组2只小鼠有肿瘤 生成，肿瘤体积小于空白对照组，K18-RGD实验组和K18-linker-RGD实验组小鼠 均未见可触及的胂瘤生成，成瘤率明显低于空白对照组和IU对照组，表明本发 明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒能够对胂瘤起到较好的预防效果。 (2)治疗性实—验
方法实验动物及分组与预防性实验方法相同；收集处于对数生长期的Hela 细胞，用PBS制成细胞悬液，于小鼠腹股沟皮下注射，每只0. 1 mL (约1 x 107 个细胞)；在接种Hela细胞12天后，待肿瘤长至直径约5腿时，于小鼠尾静 脉注射本发明的才莫拟逆转录病毒，每只100 (含4 pmol的siRNA逆转录病毒 重组表达载体)，每隔5天重复注射1次，共注射5次；分别于接种Hela细胞 后第15、 20、 25、 30和35天用游标卡尺测量肿瘤的长轴和短轴，按照公式 肿瘤体积=(长轴x短轴)2 x 0. 52,计算肿瘤体积，以各组5只小鼠的肿瘤体积 均值作肿瘤生长曲线。
结果如图6所示，接种Hela细胞后，各组小鼠均有肺瘤生成；但注射模 拟逆转录病毒后，Ku对照组、K厂RGD实验组和Ks-linker-RGD实验组小鼠的肿 瘤生长明显受到抑制，肿瘤体积均小于空白对照组(P<0. 05)， K『RGD实验组和 K18-linker-RGD实验组的抗肿瘤效果较L对照组好，表明本发明的靶向胂瘤的 模拟逆转录病毒能够对肿瘤起到较好的治疗效果。
基于上述实验结果，本发明的耙向肺瘤的模拟逆转录病毒具有抗胂瘤效应，
可以用于制备抗肿瘤药物。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管 通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术 人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所 附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110〉 中国人民解放军第三军医大学
<120〉耙向肺瘤的;^莫拟逆转录病毒及其制备方法和应用
<160> 14
<210> 1
<211> 10
<212〉 PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述RGD肽
<400> 1
Ala Cys Arg Gly Asp Met Phe Gly Cys Ala 1 5 10
<210> 2
<211> 6
<212〉 PRT
<213> 人工序列
<220>
<221〉 MUTAGEN
<222> (1,3,5)
<223> Xaa=Acp
<220〉
<223>人工序列的描述柔性接头
<400> 2
Xaa Ser Xaa Ser Xaa Ser 1 5
<210> 3
<211〉 21
<212〉 ■
<213> 智人(H觀n)
<220>
<223> Pokemon基因的siRNA輩巴序列I
<400> 3
aacgtgtacg agatcgactt c
<210> 4
<2U> 21
<212> 飄
<213> 智人(Human)
<220>
<223> Pokemon基因的siRNA靶序列II
<400> 4
aacggcttag acttctatgg g
<210> 5
<211> 21
<212> 腿
<213> 智人(H觀n)
<220>
<223> Pokemon基因的siRNA靶序列III
<400> 5
aaggtggaga agaagatccg a
<210〉 6
<211> 21
<212> 飄
<213> 智人(H画n)
<220>
<223> Pokemon基因的siRNA耙序列IV
<400〉 6
aagcacttta aggacgagga c 21
<210〉 7
<211> 64
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<223>人工序列的描述针对siRNA耙序列I的正义链
〈400〉 7
gatccgcgtg Ucgagatcg acttcttcaa gagagaagtc gatctcgtac acgttttttg 60 gaaa 64
<210> 8
<211> 64
<212〉 羅
<213> 人工序列
<220>
<223>人工序列的描述针对siRNA耙序列I的反义链
<400> 8
agcttttcca纖aacgtgt acgagatcga cttctctctt g tcg atctcgtaca 60 cgcg 64
<210> 9
<211〉 64
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223〉人工序列的描述针对siRNA耙序列II的正义链
<400〉 9
gatccgcggc tUgacttct atgggttcaa gagacccata gaagtctaag ccgtttUtg 60 g纖 64 <210> 10
<211〉 64
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220〉
<223> 人工序列的描述针对siRNA輩巴序列II的反义链
<400> 10
agcttttcca aaaaacggct tagacttcta cgcg
tgggtctctt gaacccatag aagtctaagc 60
64
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述针对siRNA靶序列m的正义链
<400〉 11
gatccggtgg agaagaagat ccgattcaag agatcggatc ttcttctcca ccttttttgg 60 aaa 63
<210> 12
<211> 63
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220〉
<223>人工序列的描述针对siRNA耙序列m的反义链
<400> 12
agcttttcca aaaaaggtgg agaagaagat ccgatctctt gaatcggatc ttcttctcca 60 ccg 63
<210> 13 <211> 63 <212> DNA
<213> 人工序列 <220〉
<223> 人工序列的描述针对siRNA輩巴序列IV的正义链 <400> 13
gatccgcact ttaaggacga ggacttcaag agagtcctcg tccttaaagt gctttUtgg 60 aaa 63
<210> 14
<211〉 63
<212〉 腿
<213> 人工序列
<220>
<223〉 人工序列的描述针对siRNA靶序列IV的反义链
<400> 14
agcttttcca aaaaagcact Uaaggacga ggactctcU gaagtcctcg tccttaaagt 60 gcg "
权利要求
1、靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于以多聚赖氨酸和RGD肽组成的融合多肽为基因载体，包裹肿瘤相关基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体，自组装而成。
2、 根据权利要求1所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于所述 多聚赖氨酸为18个L-赖氨酸连接成的多聚体直链。
3、 根据权利要求1所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于所述 RGD肽具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列。
4、 根据权利要求1所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于所述 融合多肽由多聚赖氨酸与RGD肽通过柔性接头连接而成，所述柔性接头为氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示的多肽片段。
5、 根据权利要求1所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于所述 融合多肽由多聚赖氨酸与RGD肽直接连接而成。
6、 根据权利要求l所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于所述 肿瘤相关基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体为Pokemon基因的siRNA逆转 录病毒重组表达载体。
7、 根据权利要求6所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于所述 Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA靶序列I ，如SEQ ID No. 3所示。
8、 根据权利要求6所述的靶向肺瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于所述 Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA把序列II,如SEQ ID No. 4所示。
9、 根据权利要求6所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于所述 Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA把序列III，如SEQ ID No. 5所示。
10、 根据权利要求6所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，其特征在于所 述Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体含有siRNA靶序列IV,如SEQ ID No. 6所示。
11、 制备权利要求1所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒的方法，包括以下 步骤a. 用化学合成法制备融合多肽；b. 用常规方法制备s iRNA逆转录病毒重组表达载体；c. 模拟逆转录病毒的制备在浓度为140-160 mmol/L的NaCl条件下，加 入步骤2所得siRNA逆转录病毒重组表达载体，于搅拌条件下，緩慢加入步骤l 所得融合多肽，加完后继续搅拌30 - 40分钟，再静置30 - 60分钟，融合多肽 可包裹siRNA逆转录病毒重组表达载体，自组装形成电荷比为2-4的颗粒，即 得模拟逆转录病毒。
12、 权利要求1所述的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒在制备抗肿瘤药物中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种靶向肿瘤的模拟逆转录病毒，以多聚赖氨酸和RGD肽组成的融合多肽为基因载体，包裹肿瘤相关基因的siRNA逆转录病毒重组表达载体，自组装而成；其制备方法包括融合多肽的制备、siRNA逆转录病毒重组表达载体的制备、以及模拟逆转录病毒的制备共3个步骤；本发明的靶向肿瘤的模拟逆转录病毒能够靶向定位到肿瘤细胞，有效介导基因转染，明显抑制肿瘤的发生和增殖，大大提高肿瘤基因治疗的安全性和有效性，且制备方法简便，可用于制备抗肿瘤药物，具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/113GK101353647SQ20081007027
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月10日 优先权日2008年9月10日
发明者兵 倪, 石晶磊 申请人:中国人民解放军第三军医大学