专利名称：细胞质dna的提取方法
技术领域：
本发明涉及从细胞中提取DNA的方法，特别是一种提取细胞DNA的方法。
背景技术：
真核细胞拥有两种类型DNA。 一种是核DNA(nDNA)，它是目前受到高度重视 的研究对象。另一种是细胞质DNA (mtDNA)，它位于线粒体内，仅占细胞总DNA 量的百万分之一到百分之一。与nDNA相比，细胞质DNA具有不同的遗传密码 和分子结构。人类细胞质DNA是一个闭合、环状的双链DNA分子，由16569个 碱基对(base pair ， bp)构成，其核苷酸序列已完全清楚。研究表明，人类神 经退行性疾病、糖尿病以及衰老的发病与细胞质DNA突变密切相关。恶性肿瘤 细胞细胞质DNA分子结构及表达调控研究已逐渐成为研究的热点。获取细胞质 DNA也是从事线粒体和叶绿体遗传研究的基础。传统的细胞质提取DNA方法分两 步提取，即首先将细胞中的线粒体或叶绿体分离出来，再进行抽提，其操作过 程繁琐，需要耗费大量的时间和实验材料，所得细胞质DNA质量不稳定，且数 量有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞质DNA的提取方法，通过该方法直接将细 胞质DNA从细胞中提取，避免了传统分两步抽提的弊端，且抽提效率高，所得为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是-
一种细胞质DNA的提取方法，包括(1)从人体或动物体的细胞组织获得单 细胞，或从人体或动物体的外周血中获得外周白细胞的步骤，其关键在于还有 下列步骤-
(2) 细胞、线粒体的裂解及DNA的变形与复性
向装有细胞的离心管中加入溶液A，所加入溶液A的量按每107个细胞加 140 160ul计，在冰浴中吹吸均匀，然后加入溶液B，加入溶液B的量按每107 个细胞加290 310u 1计，颠倒混匀，然后放在冰浴中5 10分钟，再加入溶 液C，加入溶液C的量按每1()7个细胞加215 235"1计，再混匀，然后放在冰 浴中20 30分钟；
上述溶液A中各溶质及其浓度为葡萄糖55mmol/L， EDTANa2 2H20 50画1/L ， Tris-HCl 0.025画1/L;
上述溶液B中各溶质及其浓度为SDS 1%, NaOH 0.2mol/L; 上述溶液C中各溶质及其浓度为钾离子3mol/L，乙酸根离子5mol/L;
(3) 细胞质DNA的提取
将复性完毕的溶液离心，取上清液，再加入上清液1/2体积的Tris饱和酚， 振荡混匀，再加入上清液1/2体积的氯仿-异戊醇，氯仿与异戊醇的体积比为24-1，再振荡混匀，然后离心，取上层水相；
(4) 细胞质DNA的纯化 加入所取上层水相等体积的异丙醇，冰浴25 40分钟，离心，弃上层水相，
用0"C 65% 75%乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清层，沉淀干燥后得细胞质DNA。 本发明所述的细胞质DNA的提取方法，采用以下过程单细胞或外周白细
胞——细胞、线粒体的裂解——DNA变形与复性——DNA提取及纯化，直接从细
胞中提取细胞质DNA，所得DNA样品完全可以满足常规分子生物学和分子遗传学
如PCR分析、DNA探针的制备、DNA杂交以及限制酶谱的构建等研究工作的
需要。大大提高了DNA的提取效率，而且成功率为100%。
作为优选实施例，在步骤(2)中，加入所述溶液A的温度为0'C 6'C。 作为优选实施例，在步骤(2)中，加入所述溶液B的温度为15°C 25°C。 作为优选实施例，在步骤(2)中，加入所述溶液C的温度为0"C 6"C。 作为优选实施例，在步骤(3)中，复性完毕的溶液的离心条件为离心加
速度9000 11000 g,离心时间5 10分钟，离心温度2。C 6。C。
作为优选实施例，在步骤(3)中，加入氯仿-异戊醇后的离心条件为离
心加速度9000 11000 g，离心时间8 15分钟，离心温度2。C 6。C。
作为优选实施例，在步骤(4)中，加入异丙醇后的离心条件为离心加速
度14000 16000 g，离心时间8 15分钟，离心温度2。C 6。C。
作为优选实施例，在步骤(4)中，加入乙醇后的离心条件为离心加速度
14000 16000g，离心时间2 3分钟，离心时温度2°C 6°C。
与现有提取方法相比，本发明的有益效果是
(1) 本发明省时、成功率高，现有的提取方法分离纯化完整的细胞质DNA 需6h才能完成整个实验操作，本发明仅需4h就可完成，并且，经过58例次 重复性试验，成功率为100%;
(2) 本发明采用的试剂为常规实验试剂配制而成，提取成本低，而且对实 验设备求不高。
图1为所制得细胞质DNA样品的紫外光谱分析曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例进一步对本发明加以说明。
实施例1 (1)细胞质DNA的制备
将人体肺细胞组织研磨，用金属滤网过滤组织细胞，获得单细胞，用TBS 液(TBS液的配置方法取NaCl 8g， KC1 0. 2g， Tris 3g，加入去离子双蒸水 800ml溶解，用2mol/L HC1调节pH值至7. 4,双蒸水定容至1000ml。)清洗两 次，2000r / min离心，弃上清，再用STE液(STE液的配置方法取NaCl 5. 84g， 0. 5mol/L Tris-HCl 20ml, 0. 5mol/LEDTANa2. 2H20 2ml， 800ml去离子双蒸水溶 解，2mol/L HC1调节pH值至7. 4，双蒸水定容至lOOOml。)洗涤一次，离心弃 上清，沉淀中的细胞数为107。向细胞沉淀中加入4"C溶液A (溶液A的配置方 法取葡萄糖lg， 0. 5画1/L Tris-HCl 5ml， 0. 5mol/L EDTANa2 . 2H20 10ml， 加去离子双蒸水90ml， 2mol/L HC1调节PH值至8. 0，双蒸水定容至100ml。) 160W，在冰浴中吹吸混匀，再加入25'C溶液B (溶液B的配置方法用新鲜 配置的腦SDS 0. 2ml加入5mol/LNaOH 80ul，加入双蒸水1. 72ml，充分混匀。) 310ri，轻柔颠倒混匀，冰浴中裂解、变性10分钟，再加入4"C溶液C (C溶液 的配置方法为取乙酸钾29.44g，加双蒸水60ml充分溶解，加冰乙酸11.5ml， 加双蒸水28.5ml。) 轻柔混匀，冰浴中复性30分钟。复性完毕的溶液在
10000g、 4。C条件下离心6分钟，取上清液，加入上清液1/2体积的Tris饱和 酚，温和振荡10分钟，再加入原上清液1/2体积的氯仿/异戊醇，氯仿与异戊 醇的体积比为24: 1，温和振荡5分钟，然后以10000g、 4'C，离心10分钟，
轻取上层水相，加入所取上层水相等体积的异丙醇，冰浴30分钟，以15000g 离心10分钟，离心时的温度为4。C，弃上层水相，用0匸70%乙醇洗涤沉淀， 以15000g离心2分钟，离心时的温度为4X:，弃上清，空气中自然干燥沉淀， 所得沉淀即为细胞质DNA。
上述细胞质DNA，必要时还可加入RNA酶消化操作过程中混入的RNA，经进 一步精练，可获得高纯度的细胞质DNA。 (2)细胞质DNA的鉴定
用UV2754型紫外分光光度仪测定A230 、 A260 、 A280值，计算A230/PA260 、 A260/PA280比值，绘制核酸紫外吸收光谱曲线，如图1所示，结果显示，细胞质 DNA样品的最大光吸收值在260 nm处，最小光吸收值在230 nm处，呈现出典型 的核酸紫外吸收光谱曲线。
实施例2
从人体抽取肝素抗凝外周静脉血1 3 ml ，低速离心5 min后取白细胞层， 用TBS液(TBS液的配置方法同实施例1)清洗两次，2000r / min离心，弃上清， 再用STE液(STE液的配置方法同实施例1)洗涤一次，离心弃上清，沉淀中的 细胞数为107。向细胞沉淀中加入0'C溶液A (溶液A的配置方法同实施例1) 140W，在冰浴中吹吸混匀，再加入15。C溶液B (溶液B的配置方法同实施例1)
290W，轻柔颠倒混匀，冰浴中裂解、变性5分钟，再加入ox:溶液c (C溶液
的配置方法为同实施例l) 21514，轻柔混匀，冰浴中复性20分钟。复性完毕的 溶液在9000g、 2'C条件下离心5分钟，取上清液，加入上清液1/2体积的Tris 饱和酚，温和振荡10分钟，再加入原上清液1/2体积的氯仿/异戊醇，氯仿与 异戊醇的体积比为24: 1,温和振荡5分钟，然后以9000g、 2'C，离心8分钟， 轻取上层水相，加入所取上层水相等体积的异丙醇，冰浴30分钟，以15000g 离心10分钟，离心时的温度为4。C，弃上层水相，用0。C 65%乙醇洗涤沉淀， 以14000g离心3分钟，离心时的温度为2'C，弃上清，空气中自然干燥沉淀， 所得沉淀即为细胞质DNA。
权利要求
1.一种细胞质DNA的提取方法，包括(1)从人体或动物体的细胞组织获得单细胞，或从人体或动物体的外周血中获得外周白细胞的步骤，其特征在于还有下列步骤(2)细胞、线粒体的裂解及DNA的变形与复性向装有细胞的离心管中加入溶液A，所加入溶液A的量按每107个细胞加140～160μl计，在冰浴中吹吸均匀，然后加入溶液B，加入溶液B的量按每107个细胞加290～310μl计，颠倒混匀，然后放在冰浴中5～10分钟，再加入溶液C，加入溶液C的量按每107个细胞加215～235μl计，再混匀，然后放在冰浴中20～30分钟；上述溶液A中各溶质及其浓度为葡萄糖55mmol/L，EDTANa2.2H2O50mmol/L，Tris-HCl 0.025mmol/L；上述溶液B中各溶质及其浓度为SDS 1％，NaOH 0.2mol/L；上述溶液C中各溶质及其浓度为钾离子3mol/L，乙酸根离子5mol/L；(3)细胞质DNA的提取将复性完毕的溶液离心，取上清液，再加入上清液1/2体积的Tris饱和酚，振荡混匀，再加入上清液1/2体积的氯仿-异戊醇，氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，再振荡混匀，然后离心，取上层水相；(4)细胞质DNA的纯化加入所取上层水相等体积的异丙醇，冰浴25～40分钟，离心，弃上层水相，用0℃65％～75％乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清层，沉淀干燥后得细胞质DNA。
2. 根据权利要求1所述的细胞质DNA的提取方法，其特征在于在步骤(2) 中，加入所述溶液A的温度为0'C 6-C。
3. 根据权利要求1所述的细胞质DNA的提取方法，其特征在于在步骤(2) 中，加入所述溶液B的温度为15°C 25°C。
4. 根据权利要求1所述的细胞质DNA的提取方法，其特征在于在步骤(2)中，加入所述溶液c的温度为ot: 6'c。
5. 根据权利要求1所述的细胞质DNA的提取方法，其特征在于在步骤(3) 中，复性完毕的溶液的离心条件为离心加速度9000 11000 g，离心时间5 IO分钟，离心温度2。C 6。C。
6. 根据权利要求1所述的细胞质DNA的提取方法，其特征在于在步骤(3) 中，加入氯仿-异戊醇后的离心条件为离心加速度9000 11000 g，离心时间 8 15分钟，离心温度2-C 6。C。
7. 根据权利要求1所述的细胞质DNA的提取方法，其特征在于在步骤(4) 中，加入异丙醇后的离心条件为离心加速度14000 16000 g，离心时间8 15分钟，离心温度2°C 6°C。
8. 根据权利要求1所述的细胞质DNA的提取方法，其特征在于在步骤(4) 中，加入乙醇后的离心条件为离心加速度14000 16000g，离心时间2 3分 钟，离心时温度2°C 6°C。
全文摘要
本发明涉及一种提取细胞DNA的方法，采用以下过程单细胞或外周白细胞——细胞、线粒体的裂解——DNA变形与复性——DNA提取及纯化，直接从细胞中提取细胞质DNA，所得DNA样品完全可以满足常规分子生物学和分子遗传学如PCR分析、DNA探针的制备、DNA杂交以及限制酶谱的构建等研究工作的需要，大大提高了DNA的提取效率，而且成功率为100％。
文档编号C12N15/10GK101338310SQ200810070110
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月13日 优先权日2008年8月13日
发明者刘丽红, 孙恒文, 胡义德, 钱海洪 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院