专利名称：一种细胞三维力学加载装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞力学领域，具体涉及一种细胞三维力学加载装置。
背景技术：
细胞力学的研究是一个比较活跃的领域.主要的兴趣点集中在力学信号是如何在细胞 内部传导，以及细胞在力学信号作用下结构和功能的改变。机械应力在细胞生长、分化、 凋亡以及基因表达等生理过程和某些病理过程(如心肌肥大、动脉粥样硬化等疾病)中起 重要作用。细胞表面存在对应力敏感的受体，这些受体能将所感应的力信号通过细胞表面 特殊的分子通道传递至胞内不同结构部件上，实现力化学转换，从而调节细胞的生理功 能。
我们当前对细胞和细胞基质粘附的理解-一细胞的表面结构调节细胞跟胞外基质 (ECM)的粘附一-是基于体外研究的结论粘附斑和其他的粘附结构，粘附斑是以整合素为 基础的结构，产生细胞与基底强烈的粘附力，同时在细胞外基质和细胞质之间双向传导信 息。粘附斑也是细胞拉伸的力学信号传导的主要途径。我们关于这些结构在细胞粘附、迁 移、信号传导、细胞骨架功能的理解是来源于在二维基底拉伸的细胞或者组织，然而，三 维的ECM被认为对细胞是很重要的，(参见Edna Cukierman， Roumen Pankov, Daron R. Stevens, Kenneth M. Yamada. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science 294， 1708 (2001)1708-1712;)。因此，在体内，相关组织细胞通过膜受体与胞 外粘附分子粘附,这些粘附分子与胞外基质的胶原纤维连接,这些连接把应力应变传递给 细胞.众所周知，细胞骨架在细胞内起力学传导的作用，细胞骨架通过整合素家族连接到 胞外基质，而胞外基质是三维的结构。文献显示，生物体内所有的细胞均处于相当复杂的 力学环境之中，就血管内皮细胞和血管平滑肌细胞而言不仅包括血液流动产生的剪切力、 正压力，也包括由血压引起的周向张力和血管内部基质及其周围组织自身的张力和压力。 因此，血管细胞受到动态的基底拉伸同时也受到了血管壁的压力或者是反弹力等[参见 K. J. Gooch, C. J. Tennant. Mechanical forces: their effects on cells and tissues.First edition ，New York, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1997， 1-15, 19-55, 123—147]，同样，皮肤的角质细胞，成纤维细胞等是受到表面基底二维张力，同时也受到 下层组织以及外界的拉伸或者是压縮作用的，因此细胞是处于三维力学环境中的[，参见 Frederick H. Silver, Lorraine M. Siperko and GurinderP. Seehar. Mechanobiology of force transduction in dermaltissue. Skin Research and Technology 2003:9:3-23]。 通常使用相关仪器和装置来模拟细胞的在体环境进行体外的细胞力学研究，为细胞的在体 机理提供研究模型。典型的细胞加载模型是用可以变形的材料制成平面的膜来对细胞进行 静态的或者是周期性的力学加载，在力学加载条件下，细胞显示不同的力学反应，包括细 胞重新排列，细胞骨架重排，细胞增殖，基因表达，蛋白质合成，细胞迁移和细胞凋亡等。 现在已经对各种类型的细胞的力学加载反应有了较好的认识。
但是目前使用的很多力学加载的模型还有许多明显的缺陷。首先，细胞在平的培养表 面上力学加载后细胞重新排列使细胞处于最小的应变，细胞在基底拉伸前的无序性以及随 后的细胞重新排列显示了细胞对表面应变的感觉。为了消除这个问题，发展了等轴拉伸装 置，使基底膜产生周向的应变，细胞在此应变下不会发生重排，但是等轴拉伸可能不符合 生理应变。其次，细胞在现在的拉伸装置上是无序的，细胞的形态也是多样的，结果，细 胞反应可能不能完全模拟体内的环境，因为细胞的组织和形态影响细胞的功能，所以有必 要研究一个新的培养系统，通过此培养系统，细胞的排列，形态，力学加载条件能够更加 严密的控制。James H,C. Wang等使用微装配技术，发展的新的力学加载的基底膜，在基 底膜上蚀刻微沟槽，控制细胞的排列，发现在同样的应变条件下，细胞与主应变方向角度 为0°或者是45°的条件下细胞的a-SMA表达明显增加，而90°的没有明显的改变；同时， 0°比45°改变明显，说明细胞形变量或者是形变面积大的，细胞的力学反应就越明显参 见James H._C. Wang et al controlling cell response to cyclic mechanical stretching .Annals of Biomedical Engineering, vol. 33, no. 3, 2005:337—342。这禾中 技术的缺陷是微沟槽把细胞分隔开使细胞不能进行直接的交流，而在体条件下细胞与周围 的细胞之间是通过整合素或者是钙粘蛋白之间进行交流的。Michael Glogauer等人报道了 一个新的细胞拉伸装置,使用胶原四氧化三铁包被的磁珠通过整合素家族粘附到细胞表面， 然后就可以对细胞进行力学加载，并且可以将其置于交变的电磁场中，细胞会在交变的电 磁场中受妾校变的机械拉伸，(参见Michael Glogauer . Jack Ferrier. A new method for application of force to cells via ferric oxide beads. Arch - Eur J Physiol (1998) 435:320 - 327)，同时，细胞会沿着磁力的方向排列，这样在力学拉伸下，细胞受到的力是相当明显的。但是这种方法的缺陷是细胞的基底不能受到拉力的作用。
发明内容
本发明的目的在于，为了使细胞体外拉伸更接近在体环境，使细胞具有更大的潜能， 克服上述现有技术中的不足之处而提供一种细胞三维力学加载装置，结合现有的细胞力学 基底加载装置和新型的细胞加载装置，将细胞种植在硅胶基底膜上，置于三维的复合力场 作用下，使细胞处于三维力场中，提高细胞代谢，促进其分泌功能，以构建出具有特定形 态和功能的组织替代物的装置。
本发明的技术方案如下
一种细胞三维力学加载与培养装置，它具有控制部分、机械部分和电磁部分
所述机械部分包括有步进电机、转动圆盘、连杆、推动轴、固定压縮环、覆盖有弹性 基底膜的细胞培养盘和安装上述各部件的架座；所述弹性基底膜上种植有进行了磁珠包被 的细胞；所述步进电机由控制部分的微处理器控制；步进电机的输出与转动圆盘偏心连接， 连杆再连接在偏心转动圆盘上，连杆在步进电机的驱动下作周期性往复运动，连杆的上端 连接推动轴，在推动轴上装有覆盖有弹性基底膜的细胞培养盒，弹性基底膜的位置与固定 在架座上的固定压縮环相对，在推动轴上下运动时，固定压縮环对弹性基底膜上的细胞形 成挤压拉伸。
所述电磁部分采用亥姆霍兹线圈组，所述亥姆霍兹线圈组固定在架座上对应硅胶基底 膜的位置，亥姆霍兹线圈组由控制部分输出的触发脉冲信号控制直流电源输出脉冲电流进 行驱动，形成电磁场。
使用上述装置进行细胞三维力学加载的方法如下首先由控制部分控制步进电机带动 偏心转动圆盘，再带动连杆上的推动轴做周期性往复运动；同时，控制部分还控制直流电 源输出脉冲电流，使亥姆霍兹线圈组产生脉冲电磁场；弹性基底膜在推动轴的带动下上下 运动，弹性基底膜与固定压縮环接触，固定压縮环使弹性基底膜上的细胞产生一个周向的 应变场，同时亥姆霍兹线圈组产生的脉冲电磁场在Z轴方向拉伸弹性基底膜上包被有磁珠 的细胞，这样就获得三维的应变场作用于细胞的效果，细胞可以实现基底膜应变的等轴拉
伸，z轴拉伸以及三维拉伸。本发明结合了现有的细胞力学基底加载装置和新型的细胞加载装置，因为单独使用基 底拉伸,与在体的三维力学环境差距很大，正如现在细胞的研究开始转向三维研究一样，单独 的磁场力拉伸对细胞的基底又没有很明显的拉伸作用,或者是很难构建一个三维拉伸的系 统,所以此方法的优点是综合了两种力学加载的方式，利用整合素和细胞骨架对细胞进行 拉伸，充分发挥两种方式的优势，它使细胞处于一个三维的力学场中，模拟细胞的在体力 学环境,并且可以模拟不同方向，不同角度的力学环境,例如，可以使细胞基底压縮，同时 其细胞空间拉伸.三维培养方法耦合细胞三维力学加载的模型，并且可以调控不同角度的力 学大小，这样，细胞所处的力学场更加接近生理力场，可以研究三维力学拉伸条件下细胞 的力学响应，包括细胞骨架的排列以及在力学场中细胞的反应。也可以通过此方法使三维 培养的细胞取向生长，提高其代谢，促进其分泌功能，以构建出具有特定形态和功能的组 织替代物的装置。本装置将为细胞力学的研究以及组织工程的构建提供一个新的思路和新 的研究手段.。
由此，本发明与现有技术相比具有如下优点
1. 通过此装置，可以研究细胞在三维力学加载下与二维加载不同的生理学反应。
2. 通过此装置，极大地增加了细胞的拉伸面积，相当于增大了细胞的黏附面积，有效地 模拟在体内组织中细胞生长的力学微环境，在一定程度上增加了细胞营养条件，提高 了组织生成效率。
3. 可以单独产生不同强度基底等轴拉伸，也可对细胞进行垂直拉伸，可以同时实现细胞的
三维拉伸。
4. 细胞在动态的三维的力学作用下大大改善了细胞的生长条件，从而加快了细胞生长过 程，使细胞培养周期縮短，代谢产物含量提高，细胞分泌胶原纤维量大，并按一定方 向排列。
5. 本发明结构简单、使用方便，应用广泛，为提高细胞的功能提供了新的方法。
图l是本装置的结构示意图。
图2本装置三个组成部分的原理框架图。
图3是控制部分的电路图。图4是部分的软件工作流程图。
具体实施例方式
以下结合附图详细说明本发明的结构
参见图1和图2，本细胞三维力学加载装置具体由控制部分、机械部分、电磁部分组
成
1、机械部分包括有步进电机2、转动圆盘4、连杆8、推动轴10、固定压縮环7、 覆盖有弹性基底膜9的细胞培养盒12和安装上述各部件的机座14;所述弹性基底膜9上 种植有进行了磁珠包被的细胞；所述步进电机2由控制部分l的微处理器控制；步进电机 2的输出与转动圆盘4偏心连接，连杆8再连接在偏心转动圆盘4上，偏心转动圆盘4由 支撑架5支撑，连杆8在步进电机2的驱动下作周期性往复运动，连杆8的上端连接推动 轴10，在推动轴10上装有覆盖有硅胶基底膜9的细胞培养盘12，弹性基底膜9的位置与 固定在机座14上的固定轴6上的固定压缩环7相对，在推动轴10上下运动时，固定压縮 环7对弹性基底膜9上的细胞形成挤压拉伸。机械部分的工作过程是通过步进电机2带动 偏心转动圆盘4驱动连杆8，带动带有运动轴承11的推动轴10作周期性往复运动，固定 在细胞培养盒12上的弹性基底膜9与推动杆一起运动，使种在基底膜上的细胞形成周期 性的等轴拉伸，设有标尺的圆盘指示材料的伸縮长度。
连杆8作周期性往复运动的幅度和频率由电机驱动的圆盘的偏心距和转速决定，电机 驱动园盘的偏心距0 、 2 、 4 、 6 、 8 、 10 、 15 、 20画，共8档，电机的转速为0-300 转/分，应变场强度0-20% ，频率0-5Hz ，应变场强度和频率独立变化，
2、电磁部分采用亥姆霍兹线圈组13，所述亥姆霍兹线圈组13固定在架座上对应弹性 基底膜9的位置，亥姆霍兹线圈组13由控制部分的微处理器发出脉冲信号控制直流电源3 输出脉冲电流进行驱动，形成电磁场，电磁场的强度与流过亥姆霍兹线圈的电流成正比， 通过调节直流电源输出电流大小来调节电磁场强度，通过调节触发脉冲信号的频率来调节 电磁场频率，同时，亥姆霍兹线圈组13与种植有细胞的弹性基底膜9之间距离为2cm。 输出电流的直流电源的电流I与亥姆霍兹线圈产生的电磁场强度B的关系是4R
R、 n分别为亥姆霍兹线圈半径和匝数，R=20mm， nl=0-20000安匝，u。=0. 411*10—6牛/米2 电磁场强度0-0.4特拉斯(T)，频率O-lkHz，电场强度和频率无依赖性。 3、控制部分是由硬件部分和软件部分组成
参见图3，硬件部分是由一片低功耗8位单片微处理器， 一个液晶显示器。 一个键盘 监控接口， 一个过零检测位置的光电信号检测电路，步进电机各相组分值锁存器，功率放 大器，以及触发脉冲信号的驱动电脑，VMSO开关管，直流电源及亥姆霍兹线圈组成
软件工作原理参见图4，开机后执行初始化程序，随后在LCD上显示开机的初始状态， 等待键盘输入电机工作参数设定值和电磁场参数设定值，此后启动微处理器发出启动微处 理器发出启动脉冲驱动步进电机及触发VMOS开关管，分别使电机按预设转速转动和使直 流电源输出脉冲电流，电机工作时间结束后，由过零光电开关电路。电机工作时间结束后， 由过零检测光电开关电路发出位置检测脉冲与设定位置比较，使电机停到预设位置，停机 时间结束，电机又重新开始工作，直至总的工作时间和电磁场作用时间结束后，程序结束。
本发明对细胞的磁珠包被采用以下方法
1、 细胞细胞包括成骨细胞、类骨细胞、破骨细胞、逼尿肌细胞、肌腱细胞、成肌
细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、肺上皮细胞、软骨细胞、心肌细胞、骨髓间
冲质干细胞或肺腺癌癌细胞。
2、 包裹的细胞磁性物质选用
铁氧体磁性物质四氧化三铁，三氧化二铁等
包被磁珠的基质I型胶原，HI型胶原，纤维粘连蛋白，层粘连蛋白，混合胶原 蛋白，或者是鼠尾胶原蛋白。3、 过程将I型胶原(美国Sigma公司)加入0 . 1 mol /L醋酸中，室温下搅 拌1 h至完全溶解，调节终浓度为1 g/L的胶原溶液。1 ml胶原溶液中加入0 . 4 g磁 珠，磁粉的平均粒径为0.05-0. 2um ，用100 ul的NaOH (0 . 1 mol /L)调pH至7.4, 于37°C下孵育2h。此条件下，胶原即吸附在磁珠上。磁珠悬液置于磁力架上洗涤3次， 最后在PBS中平衡24 h。使用前以振荡器混匀。每升培养液中加入10 ml磁珠悬液，为 附壁生长的细胞换液，37'C下孵育30 min。 PBS洗去未结合的磁珠颗粒，为细胞施加垂 直方向磁场。
4、 培养条件本试验设计的培养条件可以根据要求设计，把整个装置放置在孵箱 里，C02浓度5。/。，温度37 °C ，相对湿度90%以上。
本装置的具体使用例
例1、使用本细胞三维力学加载装置对成纤维细胞在无应变场(强度为0 % )和无 电磁场(场强为0特斯拉)的情况下进行静态三维细胞培养。
例2、使用本细胞三维力学加载装置对包被有磁珠的成纤维细胞在场强为0.2特拉斯、 频率为100Hz的磁场力作用做周期性的Z轴拉伸，同时用未包被磁珠的成纤维细胞种在相 邻的细胞培养盒作对照排除磁场对细胞的作用。
例3、使用本细胞三维力学加载装置对包被有磁珠的成纤维细胞在场强为0. 2特拉斯、 频率为100Hz的磁场力作用下做周期性的Z轴拉伸，同时基底施加10%的应变，1Hz的周 向周期性拉伸，研究三维应变场对细胞的作用。
例4、使用本细胞三维力学加载装置对包被有磁珠的平滑肌细胞在场强为0. 2特拉斯、 频率为100Hz的磁场力作用下做周期性的Z轴拉伸，同时基底施加10%的应变，1Hz的周 向周期性拉伸，研究三维应变场对细胞的作用。
例5、使用本细胞三维力学加载装置对包被有磁珠的平滑肌细胞在基底施加10%的应 变，lHz的周向周期性拉伸，同时在场强为0.2特拉斯、频率为100Hz的磁场力作用下做 周期性的Z轴拉伸，以没包被磁珠同时加载同样周期性基底应变以及磁场的细胞为对照研 究三维应变场的作用。
权利要求
1.一种细胞三维力学加载装置，其特征在于它具有控制部分、机械部分和电磁部分所述机械部分包括有步进电机(2)、转动圆盘(4)、连杆(8)、推动轴(10)、固定压缩环(7)、覆盖有弹性基底膜(9)的细胞培养盒(12)和安装上述各部件的机座(14)；所述弹性基底膜(9)上种植有进行了磁珠包被的细胞；所述步进电机(2)由控制部分(1)的微处理器控制；步进电机(2)的输出与转动圆盘(4)偏心连接，连杆(8)再连接在偏心转动圆盘(4)上，连杆(8)在步进电机(2)的驱动下作周期性往复运动，连杆(8)的上端连接推动轴(10)，在推动轴(10)上装有覆盖有硅胶基底膜(9)的细胞培养盘(12)，弹性基底膜(9)的位置与固定在机座(14)上的固定压缩环(7)相对，在推动轴(10)上下运动时，固定压缩环(7)对弹性基底膜(9)上的细胞形成挤压拉伸；所述电磁部分采用亥姆霍兹线圈组(13)，所述亥姆霍兹线圈组(13)固定在架体上对应弹性基底膜(9)的位置，亥姆霍兹线圈组(13)由控制部分的微处理器发出脉冲信号控制直流电源输出脉冲电流进行驱动，形成电磁场。
2、 根据权利要求1所述的细胞三维力学加载装置，其特征在于所述连杆(8)作周 期性往复运动的幅度和频率由步进电机驱动的转动圆盘(4)的偏心距和转速决定，步进 电机(2)驱动转动园盘(4)的偏心距为0 、 2 、 4 、 6 、 8 、 10 、 15 、 20mm，共8档， 步进电机(2)的转速为0-300转/分。
3、 根据权利要求l所述的细胞三维力学加载装置，其特征在于所述电磁部分的应 变场强度0-20% ，频率0-5Hz ，应变场强度和频率独立变化。
4、 根据权利要求1所述的细胞三维力学加载装置，其特征在于所述亥姆霍兹线圈 组与种植有细胞的弹性基底膜(9)之间的距离为2cra。
5、 根据权利要求1所述的细胞三维力学加载装置，其特征在于所述磁珠包被的细 胞包裹的磁性物质是四氧化三铁或三氧化二铁等铁氧体磁性物质，包被磁珠的基质是纯I 型胶原、III型胶原、纤维粘连蛋白或层粘连蛋白，混合胶原蛋白，或者是鼠尾胶原蛋白。
6、 根据权利要求1所述的细胞三维力学加载装置，其特征在于所述的细胞包括成 骨细胞、类骨细胞、破骨细胞、逼尿肌细胞、肌腱细胞、成肌细胞、成纤维细胞、平滑肌 细胞、内皮细胞、肺上皮细胞、软骨细胞、心肌细胞、骨髓间冲质干细胞或肺腺癌癌细胞。
7、 利用权利要求1至6任一项所述的装置进行细胞三维力学加载的方法，首先由控 制部分(1)控制步进电机(2)带动偏心转动圆盘(4)，再带动连杆(8)上的推动轴(10) 做周期性往复运动；同时，控制部分(1)还控制直流电源(3)输出脉冲电流，使亥姆霍兹线圈组(13)产生脉冲电磁场；弹性基底膜(9)在推动轴(10)的带动下上下运动，弹性基底膜(9)与固定压縮环(7)接触，固定压縮环(7)使弹性基底膜(9)上的细胞 产生一个周向的应变场，同时亥姆霍兹线圈组(13)产生的脉冲电磁场在Z轴方向拉伸弹 性基底膜(9)上包被有磁珠的细胞，这样就获得三维的应变场作用于细胞的效果。
全文摘要
一种细胞拉伸加载装置，涉及医学仪器中的细胞力学加载装置，具有控制部分、机械部分和电磁部分，它是将细胞种在弹性硅胶膜上，然后通过动力系统使细胞进行周向的拉伸/压缩加载，同时，使用包被四氧化三铁的磁珠胶原通过整合素家族粘附到细胞表面，再在细胞培养盒子的上下底部加载一个交变的磁场，使细胞除了在基底应变场中受周向应力外还可以在磁力作用下拉伸细胞，控制Z轴方向细胞的形变，并且可以控制细胞的形态。本发明是模拟生理条件下细胞所承受的机械应力，可以在不同的力学作用下进行不同维数的力学加载，具有结构简单、使用方便，应用广泛，重复性好等优点。
文档编号C12M3/00GK101298592SQ20081006983
公开日2008年11月5日 申请日期2008年6月16日 优先权日2008年6月16日
发明者玉 王, 王贵学, 罗向东, 邱菊辉 申请人:重庆大学