专利名称：一种番茄红素的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，特别涉及一种生物合成番茄红素的方法。
背景技术：
番茄红素是一种重要的类胡萝卜素，分子式为C4。Hs6,分子量为536. 85。 最近的研究表明，番茄红素的抗氧化性能是天然类胡萝卜素中最强的，它独特 的生理功能越来越引起人们的重视能高效猝灭单线态氧及清除过氧化自由基； 通过影响人体细胞的活性以及营养物质的吸收及循环，控制细胞的生长及其代 谢；作为一种低胆甾醇剂抑制胆固醇生物合成酶，调节胆固醇代谢，防治心jfii 管疾病。因而番茄红素在食品、化妆品以及医药领域有重要的应用。
目前番茄红素可通过化学合成、天然提取和微生物发酵3种方法来获得。将 上述三种生产方法作一比较天然提取法由于番茄的种植为季节性产物，产量 和含量受多因素控制，且番茄红素在番茄中含量不稳定，提取工艺繁瑣冗长， 成本昂贵；而化学合成法尽管成本较低，但由于污染环境及产品活性较低，产 品应用范围受到限制；采用微生物发酵法生产番茄红素，其产品质量和生理活 性完全和天然提取产品相同，且釆用发酵法能降低成本，污染相对较小。因此， 我们可以看出微生物发酵法是最具有潜力的生产方法。
虽然番茄红素在很多植物和微生物中均有分布，但由于其中所含色素的成 分复杂致使提取单一组分的成本较高。随着不同生物类胡萝卜素合成基因的相 继克隆，为利用微生物发酵来获取番茄红素提供了可能。crf/基因编码八氢番茄 红素脱氢酶，在不同的物种中这种脱氢酶的作用有所不同。研究表明，^vi/ /a 力e/^/co/s是一种革兰氏阴性菌，不属于光合细菌，其crt基因族按照以下顺 序来产生类胡萝卜素，首先八氢番茄红素经过4次脱氢形成番茄红素，然后依 次产生胡萝卜素、隐黄质、玉米黄质。而光合细菌Wocto^"er MAgeroA/"的八氢番茄红素在同样由cr〃基因编码的八氬番茄红素脱氲酶作用下只经过三次脱氢形成链孢红素，而后则生成羟化链孢红素、去甲基球状烯、
球形烯及球状菌素，并不形成番茄红素。A ^力aero^/^的突变抹TC72是在原 始菌4朱A ^ A2ero/V"的c〃/基因中插入转座子Tn5而得。研究表明，突变 林TC72内虽然crt基因族是完整的，但由于Tn5的插入而使其类胡萝卜素合成 途径停留在八氢番茄红素，"f/及以后基因的表达均被中断(如图1所示)。如 果能够利用基因工程的方法使A力erWco/a的cr〃基因在光合细菌突变抹TC72 中表达，使TC72中积累的八氢番茄红素生物合成番茄红素。同时，由于TC72 中不存在crtY和crtZ蛋白，使生物合成的番茄红素不被继续代谢成其他类胡 萝卜素，从而使得光合细菌突变抹TC72中利用A力er6/co/a的crtl蛋白生物 合成的番茄红素在细胞内大量积累并容易分离纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种番茄红素的制备方法。本发明方法将￡力er6/co" 的crZ/基因克隆并连接到含强启动子A/c的表达载体pRKR5上，结合转移到突 变抹TC72中构建工程菌，启动子户"c在厌氧条件下高效表达，通过氧浓度的调 控使工程菌生产目的产物番茄红素。为实现工业化生产番茄红素奠定了基础， 在生产实践中具有潜在的应用价值，有生产成本低，利于环保的优点。
本发明方法包括以下步骤
(1 )提取A力er&Vo"基因组DNA,通过PCR方法克隆出cr〃基因全长； (2 ) J&I酶切pMD18-crtl质粒，将切下的c"/片段连接到含强启
动子尸wc的表达载体pRKR5上，构建表达载体pRKR5-crtl;
(3) 通过接合转移的方式将表达载体pRKR5-crtl导入光合细菌 y 力6^o6a"er i7 /73ero/de5"突变林TC72中；
(4) 启动子A/c在厌氧条件下高效表达，调控氧浓度可诱导工程菌 TC72-pRKR5-crtl累积红色色素。
经HPLC和吸收光谱分析，工程菌TC72-pRKR5-crtl中合成的色素为番茄红 素，工程菌的生物量(干重)为2. 36gDCW/L,番茄红素含量可达1.52mg/gDCW。
本发明的优点是将A力e^/co/a中的cr//基因转化到光合细菌A ^A3eroA/^突变株TC72中异源表达，使原来不生产番茄红素的A ^/wero/o^ 经过改造后生产番茄红素，并且使生产的番茄红素不继续代谢成其他类胡萝卜 素，而在细胞内大量积累，有利于番茄红素产量的提高和分离纯化。此外，光
合细菌A ^ 力ae/Y /c^y极易培养，还可用于净化高浓度有机废水，使番茄红素
的生产成本大大降^f氐，而且具有重大的环保意义。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳
实施例，并配合附图，作详细i兌明如下。
图1为s/ 力aerc(7Ve51、 A.力er/ /co/a和577力ae/Y /cfes突变4朱TC72类胡 萝卜素代谢途径；
图2为本发明的￡力er々/co/a中cr〃基因全长的PCR扩增电泳图，图中， 1: crf/基因的PCR扩增结果；2:阴性对照；3: 2000bp DNA ladder;
图3为本发明的表达载体pRKR5的构建示意图4为本发明的表达载体pRKR5-crtl的构建示意图
图5为本发明的表达载体pRKR5-crtl的酶切分析电泳图，图中，1:未酶 切的表达载体pRKR5-crtl; 2:表达载体pRKR5-crtl的i^cl和J&I双酶切结果； 3: crW基因全长的PCR扩增结果；
图6为本发明的番茄红素标准品、TC72 、 TC72-pRKR5和工程菌 TC72-pRKR5-crtl的紫外分光光度计检测图，图中,1:番茄红素标准品；2:工 程菌所产色素；3: TC72所产色素;4: TC72-pRKR5所产色素;
图7为本发明的番茄红素标准品、TC72 、 TC72-pRKR5和工程菌 TC72-pRKR5-crtl的HPLC^企测图，图中，(1):番茄红素标准品；(2):工程菌 所产色素；(3): TC72所产色素；(4): TC72-pRKR5所产色素；
图8为本发明制备方法的流程示意图。
具体实施例方式
材料
1. PrimeSTAR HS DNA聚合酶及各种限制性内切酶(Takara公司产品， 中国大连)2. 连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 ( Takara公司产品，中国大
连)
3. DNA纯化试剂盒、离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天为时代公 司产品，中国北京)
4. DNA才是取i式剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3.0 (Takara公司产品，中国大连)
5. 大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara公司产品，中国大连)
6. fr『2'/ /a力er6/co/a069菌抹(购自中国农科院植保所)
7. 大肠杆菌Sm(美国典型微生物菌种保藏中心，保藏登记号为ATCCNo. 47055，保藏时间1960)
8. 类球红细菌RS-l (英国国家菌种保藏中心，保藏登记号为UKNCC No. 8253,保藏时间1956 )
注以下试剂均为市售产品。
9. LB培养基 酵母提取物 5g 胰蛋白胨 10g NaCl 10g 固体培养基加入2 % (w/v)琼脂粉
溶于lOOOml去离子水中，并用lmol/L的NaOH调节pH值至7. 0,高压蒸汽 灭菌。
10. 金氏培养基 蛋白胨 5g， 酵母膏 3g， 葡萄糖 2. 5g, 固体培养基加入1. 5 % (w/v)琼脂粉溶于1000ml去离子水中，并用lmol/L的Na0H调节pH值至7. 2,高压蒸汽
灭菌
11. M22+培养基
将光合细菌培养基命名为M22+培养基，其配方如下
M22+固体培养基向100ml 10xM22储备液中加入900 ml去离子水和15g 琼脂粉，混匀，高压蒸汽灭菌。使用之前使固体培养基溶解，降温到60。C时加 入lml过滤灭菌的1000 x维生素混合液。
其中10xM22储备液的配制
KH2P04 K2HP04. 3H20 乳酸钠 (NH4) 2S04 NaCl
琥珀酸钠 谷氨酸钠 天冬氨酸 Solution C
30. 6g
30g
25g 5g 5g
43. 425g 2,7g 0.4g
200ml
去离子水定容到lOOOml,用Na0H调节pH值至6. 8,高压蒸汽灭菌 其中Solution C的配制
MgCl2. 6 H20 CaCl2
EDTA. Na2. 2 H20
ZnCl2
FeCl2. 4H20 MnCl2. 4H20
24g 3. 34g 0.125g 0. 261g
0.25g 0. 09g(NH4)6Mo7024 4H20 0. 009g
CuCl2. 2H20 0. 008g
Co (N03) 2. 6H20 0. 0124g
硼酸 0. 0057g
氮川三乙酸 10g
去离子水定容到1000ml, -20。C保存，无需灭菌。
其中1000 x维生素混合液的配制
烟酸 lg
石克胺素 0. 5g
对氨基苯曱酸 0. lg
生物素 Q. Olg
去离子水定容到1000ml,过滤灭菌，-20。C保存。
M22+液体培养基在超净工作台上向一经过高压蒸汽灭菌的1L培养瓶中分 别加入100ml高压蒸汽灭菌的10xM22储备液，1ml过滤灭菌的1000 x维生素 混合液，20ml 5%高压蒸汽灭菌的酸水解酪素和879ml灭菌去离子水，混匀后于 4°C保存备用。
其中5%酸水解酪素的配制
称取5g酸水解酪素，用去离子水溶解定容到100ml,高压蒸汽灭菌，-20°C 保存。
实施例一 A/v/zz/a力er6/co/a中cr"基因的克隆
按照DNA提取试剂盒的操作说明，从iyW/7^力e/^/coA3069中提取基因组 DNA，根据已报道的力er^'co/s pv. Milletiae中cr〃基因序列(GenBank 登录号AB076662 ),设计引物对S1/R1 ( SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9 )，分别 在S1的5，引入酶切位点，在R1的5，引入J&I的酶切位点，引物序列 如下
SI: 5， - GCGCGAGCTCCATATGAATAGAACTACAGTAATTGG -3，；Rl: 5， - GCGCTCTAGATCAAGCCAGATCCTCCAGCATCAA -3，。 以A力er6/co"069基因组DNA为模板，建立如下的PCR反应体系反应 体系为25jil,其中含引物Sl和Rl各lW , 0. 的dNTP, 0. 5 jn 1基因组DNA， 5 x PrimeSTARTM反应緩冲液2. 5 ju 1, PrimeSTAR HS DNA聚合酶0. 2W。 PCR的 反应条件为第一阶段94。C预变性4分钟；第二阶段94°C变性30秒，56。C退 火30秒，72。C延伸90秒，循环35次；第三阶段72。C延伸10分钟。所得PCR 产物经琼脂糖电泳;险测可见约1500bp大小电泳带，如图2所示。将PCR产物回 收、纯化后测序。PCR扩增出大小约1500bp的DNA片断，将PCR产物回收、纯化 后测序。序列分析表明，该片断与已报道的cr〃基因的大小一致；将其翻译成 氛基酉^f歹寸，与i>『//2/a力er6/co/a pv. Milletiae ( GenBank登录号AB076662) 氨基酸序列比较分析，结果发现二者氨基酸序列同源性为95.8%，证明所克隆 基因为Ai^力"'s Aer6/co/a069中cr"基因，并登录NCBI,登录号为DQ408590。 实施例二具有；wc强启动子的表达载体pRKR5的构建
利用DNA提取试剂盒提取类球红细菌RS-1基因组DNA，才艮据GenBank上报道的 ;w^喿纵子序列(GenBank登录号X68796 )设计两对PCR引物S2/R2 ( SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5)和S3/R3 (SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7 ),其中上游引物S2的 5，端含有保护碱基和酶切位点AcoRI,下游引物R2的5，端含有保护碱基和酶切 位点&cl，上游引物S3的5'端含有保护碱基和酶切位点J&I，下游引物R3的5' 端含有保护碱基和酶切位点户WI,引物序列如下
S2: 5' - CTCTGAATTC GCCTCGGA CACCCTCG _3，
R2: 5， -CTCTGAGCTC TGTGTCGTCT CCCAACTGG -3，
S3: 5， -ATATTCTAGA CGAATCACCA CGCCCTGCG -3， R3: 5， -ATATCTGCAG CAGTGGCAGG CAG -3，
以上述S2/R2为引物可扩增出/wc启动子和SD序列，以上述S3/R3为引物 可扩增出/^c终止子序列。PCR的反应体系为100ji 1,其中含引物S2和R2各 20pmo1, 200 jaraol的dNTP, 1 ju 1 RS-1基因组DNA， 5 x PrimeSTAR反应緩沖液 20jul,高保真的PrimeSTAR HS DNA聚合酶5U。 PCR的反应条件为:第一阶段 95。C预变性5分钟；第二阶段94。C变性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸30秒，循环30次；第三阶^殳72。C延伸5分钟。所得PCR产物(；wc启动子和SD的核 苷酸序列为SEQ ID NO: 1),经1. 5°/ 琼脂糖电泳检测可见约360bp大小电泳带， 将PCR产物回收、纯化。同上述PCR反应体系和条件，以RS-1基因组DNA为模 板，以引物对S3/R3进行PCR扩增，回收、纯化一约479bp的PCR产物(/wc终 止子的核香酸序列为SEQ ID NO: 2)。
取适量纯化约360bp的PCR产物进行fcoRI和AcI分步酶切，然后利用DNA纯 化试剂盒过柱纯化酶切产物。同时，按照上述酶切策略将广宿主性表达载体 pRK"5质粒DNA进行AcoRI和&cI分步酶切并纯化(pRK415质粒DM序列可从NCBI 查阅，GenBank登录号:EF437940, pRK415质粒来源:Keen, N. T. ， S. Tamaki, D. Kobayashi， and D. Trollinger. 1988. Improved broad-host—range plasmids for DM cloning in Gram-negative bacteria. Gene 70:191 - 197.)。
按照连接试剂盒的才喿作说明将适量经AcoRI和5^cI酶切的pRK415质粒DNA 和约360bp的PCR产物进行连接。连接产物通过CaCl2转化法转化顶109大肠杆菌感 受态细胞，经10jug/ml四环素抗性筛选阳性重组质粒pRKP,并测序验证。
取适量纯化约479bp的PCR产物进行i7^I和A d分步酶切，然后利用DNA纯化 试剂盒过柱纯化酶切产物。同时，将重组质粒pRKP进行AcoRI和&cI分步酶切并 纯化。按照连接试剂盒的操作说明将适量经i^I和户Wl酶切的pRKP质粒DNA和约 479bp的PCR产物进行连接。连接产物通过CaCl2转化法转化顶109大肠杆菌感受态 细胞，经10jug/ml四环素抗性筛选阳性重组质粒pRKR5，并测序验证。pRKR5的 核苷酸序列为SEQ ID NO: 3。表达载体pRKR5的构建策略见图3。 实施例三表达载体pRKR5-cr 11的构建
将表达载体pRKR5和克隆载体pMD18-crtl分别用^cl和i^l进行双酶切，其 酶切体系为4jul 10xT緩沖液，1.5jal AcI和J^al酶液，4 ju 1 %BSA，加灭菌 双蒸水到40 Jil， 3rC酶切2小时，DNA纯化试剂盒过柱纯化&cI-i^3l双酶切产物。
按照连接试剂盒的操作说明将适量经^cl和J&I酶切的pRKR5质粒DNA 和cr/7片断进行连接。连接产物通过CaCl2转化法转化JM109大肠杆菌感受态 细胞，经10jug/ml四环素抗性筛选后，挑取LB平板上的白色菌落于含有IOm g/ml四环素的LB液体培养基中，37°C， 250rpm,振荡培养过夜，次日提取质粒DNA,用SAcl和XBAI进行双酶切鉴定，酶切体系同上，酶切图语如图5所示， 酶切下约1500bp的片断，大小与cr〃基因一致。对于酶切正确的表达载体进 行测序，测序结果表明，cr纟/基因已连接到表达载体pRKR5上，该表达载体命 名为pRKR5-crtl (载体构建策略见图4)。
实施例四表达载体转化大肠杆菌SiH (i)s!W感受态细胞的制备
取-80。C保藏的大肠杆菌S^划线于LB平板上，37 。C过夜培养；挑单菌落 接种于10ml LB培养液中，37 °C, 250 rpm,振荡培养过夜；取lml过夜培养 物加入100ml LB培养液中，37 。C, 250 rpm，振荡培养2小时；将100 ml培 养物置于冰水中10分钟4吏细菌冷却到0 °C;然后于4。C, 2500 rpm，离心7分 钟；弃上清，用10ml冰浴预冷的0. 1M CaCL重悬；4 °C ， 2000 rpm，离心5分 钟；弃上清，用2 ml冰浴预冷的0. 1M CaCL重悬，冰水中静置2小时备用。
(2 )转化
取100 jj 1冰浴的Sn」感受态细胞加到预冷的1. 5ml EP管中，再加入1 ja l构建好的表达载体pRKR5-crtl质粒顧a，轻轻地混合均匀，冰水中放置30分 钟；然后于42 。C热激90秒，迅速置于冰水中，^L置2分钟；加入500jal LB 培养液，37 。C, 150 rpm，振荡培养1小时；取50 ju 1菌液均匀涂布于含有 10 jig/ml四环素的LB平板上，37 。C,倒置培养过夜。次日，于四环素抗性平 板上正常生长的为S^转化菌。同时，按照上述转化方法将pRKR5质粒DNA转入
Sn-i做为对照。
实施例五表达载体经接合转移到兄^力aero2Ves突变林TC72
按照Coomber等(Coomber SA,—Chaudhri M, Connor A， Britton G, Hunter CN. Localized transposon Tn5 mutagenesis of the photosynthetic gene cluster of Rhodobacter sphaeroides. Mol Microbiol. 1990;4(6):977-989 )报道的方法，将转座 子Tn5插入类球红细菌RS-1 cW/基因中获得类球红细菌突变抹TC72。突变抹 TC72内虽然crt基因族是完整的，但由于Tn5的插入而使其类胡萝卜素合成途 径停留在八氯番茄红素，该代谢途径crf/基因及下游基因的表达均被中断。将TC72划线于含有20 jag/ml新霉素的M22+培养基上，34°C,黑暗，倒置 培养3天；挑取TC72单菌落接种于10ml含有20 ju g/ml新霉素的M22+培养液 中，34°C， 250rpm,黑暗振荡培养过夜；次日，4°C, 6000rpm，离心10分钟收 集菌体，lml LB培养液重悬菌体；刮取S17—i转化菌单菌落加入100 jn 1 LB细菌 重悬液中，充分混匀，然后滴到充分干燥的LB培养基上，34°C,培养6h-8小 时，从LB培养基上刮取细菌，1 ml M22+重悬菌体，取100 ju 1重悬菌液涂布于 M22+培养基上(含有四环素2jug/ml，新霉素20 ju g/ml )， 34 。C ，黑暗培 养3 -4天左右即可看到红色菌落；由于表达载体pRKR5-crtl和pRKR5上含有 四环素抗性基因，类球红细菌突变株TC"基因组中含有新霉素抗性基因，只有 含有表达载体pRKR5-crtl或pRKR5质粒DNA的类球红细菌才能在具有这两种抗 生素的培养基中正常生长，所以这些红色菌落即为含有表达载体pRKR5-crtl或 pRKR5质粒DNA的类球红细菌；挑取单菌落接种到10 ml M22+培养液(四环素 2ng/ml，新霉素20ng/ffll)中，34°C， 250rpm，黑暗振荡培养过夜；次曰， -8(TC菌种保藏。
实施例六调控氧浓度诱导表达载体的表达
将含有表达载体pRKR5-crtl的工程菌TC72-pRKR5-cr11划线培养于M22+ 培养基(四环素2jug/ral，新霉素20 Mg/ml)上，34°C,黑暗倒置培养4 天；挑取单菌落接种到10ml M22+培养液(四环素:2 |ag/ml,新霉素20 |ng/ml ) 中，34°C， 220rpm，黑暗条件下振荡培养过夜；取lml过夜培养物接种到100 ml M22+培养液中(四环素2jug/ml,新霉素20jug/ml,培养液体积为容器的20 % )， 34°C， 220rpm，黑暗条件下振荡培养20小时；加入相同抗生素浓度的M22+ 液体培养基，直至培养基与培养瓶体积比为60%， 34°C，转速170rpm,诱导培 养20h。同时，按照上述条件培养TC72 (M22+培养基内不添加四环素)和包含 表达载体pRKR5的TC72估文为阴性对照。
含有表达载体pRKR5-crtl的工程菌TC72-pRKR5-crtl经调控氧浓度诱导后， 菌体呈红色，而TC72和包含pRKR5的TC72经诱导后没有发生颜色变化，仍然是绿 色，这说明工程菌中的crtl基因在TC72中实现了表达，表达的重组酶具有生物 活性，使得一条新的代谢途径在工程菌内建成，该途径完成了一种红色天然色 素的合成。实施例七番茄红素的提取及鉴定 (l)番茄红素的提取
番茄红素易溶于氯仿、苯等有机溶剂，可溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醚、石 油醚、己烷，难溶于曱醇、乙醇，不溶于水。选取丙酮从光合细菌破壁细胞中 提取番茄红素。另外番茄红素非常容易被氧化，因此经历破碎与提取几个工程 后，它的损失比较严重，而且在保存工程中，也要采用必要的防氧化措施。在 萃取的有机溶剂中加入合适的抗氧化剂，可以对萃取液中的番茄红素起到保护 作用，延緩它被氧化的时间。因而选择在萃取液中选择加入1%的二丁基羟基甲
苯(BHT )。
将培养好的菌液4。C, 6000 rpm离心15min收集菌体。用灭菌水洗涤两次， 得到的菌体按1:5的比例加入磷酸緩冲液进行超声波破碎(60瓦，破碎15s,间 隔5s，工作20次)。破碎后的菌液按照一定的配比加入含BHTl。/。的丙酮进行萃取， 不断振荡使之充分混合，静置10min后4。C, 6000rpm离心15min使之分层，取上 清液即为萃取出的色素溶液。
(2)番茄红素的鉴定
1)紫外分光光度计鉴定
对于番茄红素而言，它用紫外分光光度计检测会有特征峰出现，其中在 472nm处有一强吸收峰。根据这一性质，我们将得到的色素溶液以丙酮为对照， 将从工程菌TC72-pRKR5-crtl、 TC72和TC72-pRKR5中提取的色素溶液以及番茄 红素标准品分别用分光光度计(UV-2450日本岛津)在380 600nm波长范围内 扫描，得到的吸收光镨如图6。图中，1为番茄红素标准品，2为工程菌所产色素， 3为TC72所产色素，4为TC72-pRKR5所产色素。从图中看出工程菌与番茄红 素标准品的吸收峰基本相同，均具备番茄红素的三指形特征吸收峰，3个吸收峰 分别为446nm、 472nm、 508nm，最大吸收峰都在472腿处，而TC72和TC72-pRKR5 由于不产番茄红素因而不具备其三指形特征吸收峰。测定样品在472nm下的吸 光值，样品类胡萝卜素的含量按照以下公式计算番茄红素(mg)—昆合液体积x混 合液在472腿下的吸光值xl0+2500。根据以上公式计算出番茄红素含量为 1. 52mg/gDCW，每升发酵液可得2. 36g干菌体。
2 ) HPLC鉴定首先精确称取5mg番茄红素标准品，用二氯曱烷溶解后定容至25ml，使其 质量浓度为0. 2mg/ml，经HPLC测定后作为标准参照。
取破碎菌体萃取上清液12000rpm离心5min，再次取上清液，上柱前经过 0.45nm孔径的无菌滤膜过滤除菌，进样量为20j^l,每个样品的分析时间设为 20min,得到色素的HPLC分析图谱。色谱条件为Diamonsi 1 C18色谱柱(5 p ， 250 mm x 4.6mm );流动相为曱醇乙腈二氯曱烷(40 : 30 : 30 ， V/V)，检 测波长472 nm,柱温为25°C，流速为1 ml/rain,进样量为2(^1。测定结果如图7 所示，图中，(l)为番茄红素标准品，(2)为工程菌所产色素，(3)为TC72所 产色素，(4)为TC72-pRKR5所产色素。从图中可以看出工程菌所产色素的保留 时间为8. 741min，和番茄红素标准品的保留时间9.178相近，而TC72-pRKR5和 TC72所产色素在此保留时间内没有特征峰，从吸收光谱和HPLC分析可以推断， 工程菌中合成的红色的天然色素为番茄红素。
本发明所述的番茄红素的制备方法的流程示意图如图8所示，本发明的实 验结果表明，利用PCR技术扩增出fi^/"/s力er々/coh的cr〃基因并连接到含 强启动子Pi/c的表达载体pRKR5上，构建表达质粒pRKR5-crtl，通过接合转移 的方式将其导入光合细菌y /w^7&cfei" ^/^ei^A/es突变抹TC72中，由于启动 子/^c在厌氧条件下高效表达，调控氧浓度可诱导工程菌累积红色色素，经HPLC 和吸收光谱分析，工程菌中合成的色素为番茄红素，工程菌的生物量(干重) 为2. 36gDCW/L，番茄红素含量可达1.52mg/gDCW，该发明为实现工业化生产番
茄红素奠定了初步的基础，在生产实践中具有潜在的应用价值。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所 属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动 与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表
〈110>重庆大学
〈120〉 一种番茄红素的制备方法
〈130>
<160> 3
<170〉 Patent In version 3.2
<210> 1
<211〉 360
<212〉 DNA
〈213〉以S2/R2为引物扩增出；wc启动子和SD的核苷酸序列
<400> 1
ctctg33ttcgcctcggsc3ccctcgtttttgcsgcsgcgsgsggctgcgggscggccct60
gtggggccgggscsggcagcgtcsatttcccgcgcgcctgcggcaaaattgtcccttttc120
33gccgtt3cgcsgg3ttcccggccgaitctggcggccsst33gtcgc3cccaasscggcc180
ttgtcsgcc33csctgsc3ttgwtctgtcsgcgc33tgtatgcgagccg240
gggcgg3tcsgM3tcgccgccsggtctctccggtctcgtcgssgcccgc300
gtgc3ggcccccgtcgstttscc3gttggg360
〈210〉 2 <211〉 479 〈212〉 醒
<213〉以S3/R3为引物扩增出/wc终止于的核tr酸序列
<400〉 2
atattctagacg33tc3cc3cgccctgcgtgcccgcttcccggsggtgcssaaggctact60
cctttgggggtctttgsastctcsgcctgcaggttcgcgccctcggcgcgcttcgccgca120
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ggcgssacccttggtt33ca33gsccttccctgccccgacttgtcc3C33240
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ttagccgggtttgcgtccc3ggscsgsttgtgstgwtcsttcgaccgac420
tctttttcgaaatctttgaat3ccctsggcsgcgscctgcctgcc3ctgc479
<210> 3
<211〉 11489
〈212〉 DNA
<213〉表达载体pRKR5质粒腿序列
<400> 3
ctgccatttt tggggtgagg ccgttcgcgg ccgaggggcg cagcccctgg ggggstggga 60
ggcccgcgtt agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg cacccccctt cggcgtgcgc 120
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gcsggtt33s sgscsggtts gcggtggccg 33333cgggc ggsssccctt gc333tgctg 240gattttctgcctgtggac3gCCCCtC333tgtcaataggtgcgcccctc3tctgtcagca300
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C333sctttgtttagccgggtttgcgtccc1980
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ctgccctcgggcggaccscgccc3tc3tg3ccttgccssgctcgtcctgcttctcttcg32520
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ccstccgcttgccctcstctcggtsgccggccsgcctcgc2880
tcccgttgsgcsccgcc3ggggacagtgaaccgctcgcgg2940gtgggcctscttC3CCt3tCctgcccggctgacgccgttgg3t3C3CC333000
cacg33ccctttggcas33tCCtgt3t3tCggstggstait3060
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cgc3gccgsacg3ccgsgcgc3gcg3gtc3gtgsgcgagggcgccsgasg'3480
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cttcccatcgact33gscgccccgcgct3tctcgstggtctgctgccccscttccsgccc10980
ctggstcgcctcctgg33ctggctttcggt33gccgtttc3C3CCC3t3311040tttgctccgc gccttggttg aacatagcgg tgacagccgc cagcacatga gagaagttta 11100
gctaaacstt tctcgcscgt caacaccttt agccgctaaa actcgtcctt ggcgt3aca3 11160
aacassagcc cggssaccgg gctttcgtct cttgccgctt atggctctgc scccggctcc 11220
atcsccaaca ggtcgcgcac gcgcttcact cggttgcgga tcgacactgc cagcccaaca 11280
sagccggttg ccgccgccgc caggatcgcg ccgatgstgc cggccacscc ggcc3tcgcc 11340
caccsggtcg ccgccctcsc tgcccggcac ctggtcgctg astgtcgatg ccsgcscctg 11400
cggcacgtcs atgcttccgg gcgtcgcgct cgggctgatc gcccstcccg ttsctgcccc 11460
gatcccggca atggcaaggs ctgccagcg 11489
<210〉 4
<211> 26
<212> 廳
<213> PCR引物S2
〈400〉 4
ctctgaattc gcctcggaca ccctcg 26
<210〉 5
<211〉 29
<212> DNA
<213〉 PCR引物R2
<4()0〉 5
ctctgsgctc tgtgtcgtct cccssctgg 29
<210> 6
<211> 29
〈212〉 DM
〈213〉 PCR引物S3
<400> 6
atattctaga cgaatcacca cgccctgcg 29
<210〉 7 .
<211〉 23
<212〉 DM
<213> PCR引物R3
<400〉 7
ststctgcsg csgtggcsgg csg 23210〉 8 〈211> 36 <212> 腿
<213> crt/基因引物Sl的序列 <400〉 8
gcgcgagctc catatgaata gaactacagt aattgg 36
210> 9 <211> 34 <212〉 DNA
〈213〉 crt/基因引物Rl的序列 〈400> 9
gcgctctaga tcasgccsgs tcctccagca tcaa 3权利要求
1. 一种番茄红素的制备方法，其特征在于有步骤(1)提取E.herbicola基因组DNA，通过PCR克隆出crtI基因全长；(2)构建pRKR5载体；(3)将crtI基因片段连接到pRKR5载体上，构建表达载体pRKR5-crtI；(4)将pRKR5-crtI质粒导入光合细菌Rhodobacter sphaeroides突变株TC72中构建工程菌TC72-pRKR5-crtI；(5)将步骤(4)得到的工程菌TC72-pRKR5-crtI调控氧浓度诱导表达，得到细胞内累积红色色素的番茄红素。
2. 根据权利要求1所述的番茄红素的制备方法，其特征在于所述pRKR5表 达载体的构建有以下步骤以S2/R2为引物扩增出/wc启动子和SD序列，pwc启动子和SD序列具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，以S3/R3为引物扩增出/wc终止子，；wc终止 子具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；将所述；wc启动子基因和SD序列插入到pRK415的AcoRI和^cl之间，p〃c 终止子基因插入到pM415的J&I和尸WI之间，构建策略见图3 。
全文摘要
本发明公开了一种番茄红素的制备方法，利用PCR技术扩增出Erwinia herbicola的crtI基因并连接到含强启动子Puc的表达载体pRKR5上，构建表达质粒pRKR5-crtI，通过接合转移的方式将其导入光合细菌Rhodobacter sphaeroides突变株TC72中，由于启动子Puc在厌氧条件下高效表达，调控氧浓度可诱导工程菌累积红色色素，经HPLC和吸收光谱分析，工程菌中合成的色素为番茄红素，工程菌的生物量(干重)为2.36gDCW/L，番茄红素含量可达1.52mg/gDCW，该发明为实现工业化生产番茄红素奠定了初步的基础，在生产实践中具有潜在的应用价值。
文档编号C12P5/02GK101285076SQ20081006980
公开日2008年10月15日 申请日期2008年6月5日 优先权日2008年6月5日
发明者宇 潘, 胡宗利, 姣 薛, 赵志平, 陈国平 申请人:重庆大学