专利名称：一种融合基因及其制得的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种融合基因及其制得的疫苗。
背景技术：
肿瘤是严重危害人类健康的恶性疾病之一。发展新的疗法以提高肿瘤的治 愈率一直是肿瘤研究领域的重要课题。肿瘤的形成需要血流的供应来提供养 分，其生长、浸润和转移均有赖于新生血管的形成。阻止肿瘤血管生成可切断 肿瘤的营养供应，抑制肿瘤生长。因此，抗血管生成被认为是极有希望治愈恶 性肿瘤的有力手段之一。
事实上，该领域的研究从70年代就开始了，目前已有多种基于血管生成
的治疗方案被提出用来治疗肿瘤。治疗效果比较满意的主要有以下两种方法
1)血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,艮卩VEGF)及其 受体(vascular endothelial growth factor receptor,艮卩VEGFR)的抑制剂。由于 VEGF在肿瘤血管生成中具有重要的促进作用，因此阻止VEGF或其受体的功 能可抑制肿瘤血管的生成。该策略是用合成的或从生物中提取的对VEGF或 VEGF受体具有抑制作用的分子，通过抑制血管生成受体的信号转导来阻止肿 瘤血管的生成。Semaxanib是最早进入临床实验的受体拮抗剂，在治疗AIDs 相关的Kapasi's肉瘤病人的临床实验中，其应答率可达61°/。(Rosen LS. Clinical experience with angiogenesis signaling inhibitors: focus on vascular endothelial growth factor (VEGF) blockers. Cancer Control. 2002,9(2 Suppl): 36-44); 2)抗 VEGF及其受体的抗体。其原理主要是通过VEGF及其受体的抗体来封闭 VEGF或VEGF受体功能，从而使肿瘤的血管生长受到抑制。国外已有多种 VEGF抗体上了临床实验研究。贝伐单抗(bevacizumab)是在肿瘤治疗中颇有 前景的一种抗体，在治疗转移性结肠癌病人的II期临床实验中，其应答率达到 40% (Rosen LS. Clinical experience with angiogenesis signaling inhibitors: focuson vascular endothelial growth factor (VEGF) blockers. Cancer Control. 2002,9(2 Suppl): 36-44)。
初步的治疗结果虽然令人鼓舞，但遗憾的是以上治疗方案存在着明显的不 足之处。这些具有疗效的分子都是从外界直接施加给病人的，而不是在病人体 内诱导合成的。所以当这些分子在体内被代谢后，马上得继续服用以产生持久 的疗效，这不但使病人费用增加，更为重要是，由于这些分子可溶性方面的限 制，必需大剂量静脉给药，使毒性大为增加(Bamias A， et al. Angiogenesis in human cancer: implications in cancer therapy. Eur J Intern Med. 2003 ，14(8):459曙469)。
相比之下，基于血管生成的主动免疫疗法，则是通过激发机体特异性的体 液和/或细胞免疫应答，来杀伤表达特定抗原的肿瘤血管内皮细胞。这不但可 避免以上方案中直接给药所引发的毒副作用，而且抗血管生成主动疗法是将免 疫效应细胞如细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,即CTLs)禾口/或 效应分子如抗体靶向肿瘤血管系统的内皮细胞而不直接耙向肿瘤细胞，与传统 主动免疫疗法相比，具有以下几方面优点①内皮细胞具有遗传学上的稳定 性，其MHCI和II类分子不会下调，而肿瘤细胞上MHCI分子往往下调，影 响抗原的提呈，使肿瘤细胞能逃避CTLs杀伤(Hicklin DJ, Marincola FM, Ferrone S. HLA class I antigen downregulation in human cancers: T-cell immunotherapy revives an old story. Mol Med Today. 1999,5(4): 178-86);②可避 免肿瘤细胞所触发的免疫抑制作用。肿瘤发展过程中肿瘤细胞会产生一些抑制 分子如TGF-p，从而使CTLs的活性受到抑制；◎治疗靶点是非肿瘤抗原依 赖性的，对肿瘤脉管系统增殖内皮细胞的杀伤对各种恶性肿瘤的生长均有抑制 作用； 血流中的T淋巴细胞更容易与血管内皮细胞发生接触，因此激发的 CTLs更易发挥杀伤作用；⑤抑制肿瘤生长相关的血管生成是宿主本身一个生 理机制，不会产生抗性。
由于机体免疫系统对肿瘤的识别是通过肿瘤表达的特定抗原(耙标)来实 现的，因此，选择合适的治疗靶标是主动免疫方案成败的关键。由于血管生成 在肿瘤中的重要地位，肿瘤新生血管内皮细胞上过度表达的抗原在既往的抗管生成疫苗中被大量采用作为靶抗原(Niethammer AQ et al. A DNA vaccine against VEGF receptor 2 prevents effective angiogenesis and inhibits tumor growth. Nat Med. 2002,8(12): 1369-75; Liu JY， et al. Immunotherapy of tumors with vaccine based on quail homologous vascular endothelial growth factor receptor-2. Blood. 2003,102 (5): 1815-23)，以此为靶标的疫苗可激发机体产生针对该分子的特异 性免疫应答，可有效杀伤表达该抗原的血管内皮细胞，从而抑制肿瘤的血管生 成。在这些抗原中，其中血管内皮细胞生长因子受体-2 (VEGFR-2，小鼠 VEGFR-2即FLK-1)，目前被公认为是肿瘤抗血管生成治疗中最佳靶抗原。① VEGFR-2限制性低水平表达于静息血管内皮细胞，但在血管生成过程中内皮 细胞发生增殖时表达密度急剧升高；②研究发现，基于同源VEGFR-2的DNA 疫苗，可在小鼠体内诱发持久的抗血管生成的CTLs应答，而对正常组织没有 损伤作用。③VEGFR-2不仅可诱发针对VEGFR-2的CTLs应答，而且可诱导 特异性的抗体应答(Liu JY, et al. Immunotherapy of tumors with vaccine based on quail homologous vascular endothelial growth factor receptor-2. Blood. 2003,102 (5): 1815-23)。④以基于VEGFR-2的DNA疫苗，通过腺病毒载体导入细胞 可有效地抑制人前列腺癌的生长(Fengshuo Jin， et al. Cotargeting tumor and tumor endothelium effectively inhibits the growth of human prostate cancer in adenovirus-mediated antiangiogenesis and oncolysis combination therapy. Cancer Gene Therapy. 2005,12(3): 257-267)。这些证据充分表明VEGFR-2是一个理想 的治疗耙标。
但令人遗憾的是，由于VEGFR-2是人自身抗原，在通常情况下，机体对 自身抗原是耐受的，因而，基于VEGFR-2分子的疫苗免疫原性不强。虽然在 佐剂存在的情况下，如沙门氏杆菌(Niethammer AG et al. A DNA vaccine against VEGF receptor 2 prevents effective angiogenesis and inhibits tumor growth. Nat Med. 2002,8(12):1369-75)、弗氏佐剂(Liu JY， et al. Immunotherapy of tumors with vaccine based on quail homologous vascular endothelial growth factor receptor-2. Blood, 2003，102 (5): 1815-23)或腺病毒载体(Fengshuo Jin, et al. Cotargeting tumor and tumor endothelium effectively inhibits the growth of human prostatecancer in adenovirus画mediated antiangiogenesis and oncolysis combination therapy. Cancer Gene Therapy. 2005,12(3): 257-267)等能够打破自身耐受，机体能对 VEGFR-2产生一定程度的免疫应答，但这些在动物上效果较理想的佐剂由于 其毒副作用而不可能用于临床。因此要发展一种适用于人的安全且有效的抗血 管生成疫苗，选择理想的佐剂提高免疫效果，这己成为抗血管生成主动免疫治 疗方案中的迫切需要解决的问题。
近年来在补体领域有一个重要发现补体裂解片段C3d在促进免疫应答方 面显示了极其重要的作用，这为解决该难题提供了一种有效途径。实验发现， 将3个C3d片段和鸡蛋溶菌酶(HEL)的C-末端融合后，融合蛋白的免疫原性较 以完全佛氏佐剂(CFA)(注:CFA是目前动物实验中效果最理想的佐剂，但该佐 剂不能用于人)为佐剂时提高了 1000倍(DempseyPW,etal.C3d of complement as a molecular adjuvant: bridging innate and acquired immunity. Science, 1996， 271(5247): 348-350)。随后在多种传染病的预防研究，如HIV (Green TD, et al. Enhancement of antibodies to the human immunodeficiency virus type 1 envelope by using the molecular adjuvant C3d. J Virol. 2003,77(3): 2046-55)、麻疹病毒 (Green TD， et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 2001, 20(1-2): 242-248)、流感病毒(Watanabe I, et al. Protection against influenza virus infection by intranasal administration of C3d-fosed hemagglutinin. Vaccine. 2003, 21(31): 4532-8; Ross TM， et al. C3d enhancement of antibodies to hemagglutinin accelerates protection against influenza virus challenge. Nat Immunol. 2000， 1(2): 127-131)和牛腹汚病毒 (Wang L, et al. Fusion to C3d enhances the immunogenicity of the E2 glycoprotein of type 2 bovine viral diarrhea virus. J Virol. 2004,78(4): 1616-22)等疫苗的研制 中，也进一步证实了 C3d的强效佐剂效应。C3d在促进免疫应答中作用机制为 C3d与抗原共价结合后，通过B细胞表面的受体CD21 ，使CD19与BCR交联， 从而促进B细胞的活化。由于B细胞同时也是一种专职抗原递呈细胞，所以 可通过对CTL活化的促进作用来提高机体对肿瘤的杀伤作用。由于补体分子 为人体自身成分，对人体无负作用。如果将补体分子C3d与VEGFR-2分子相连，有可能在基于VEGFR-2的肿瘤抗血管生成治疗中产生如同在预防和治疗 传染病中一样的理想效果，产生有效的抗肿瘤免疫。
发明内容
本发明基于以上分析，利用基因工程手段，将VEGFR-2胞外段编码基因 FLKl256-2269与三个串联的C3d编码基因融合(注C3d3即三个串联的C3d基 因)，构建FLK1265_2 493/C3d3融合基因重组表达载体，该重组载体作为核酸疫 苗用于治疗和预防肿瘤。既可打破肿瘤的自身免疫耐受，又是一种安全的疫苗 方式。
本发明的一个目的是提供一种融合基因，其包括小鼠血管内皮细胞生长因 子受体-2胞外段编码基因和三个串联的补体裂解片段C3d编码基因。
本发明的一个较佳实施例中，所述的融合基因结构为，小鼠血管内皮细胞 生长因子受体-2胞外段和三个串联的补体裂解片段C3d之间无连接子，所述小 鼠血管内皮细胞生长因子受体-2胞外段基因位于所述融合基因的氨基端，三个 串联的补体裂解片段C3d位于所述融合基因的羧基端。
所述的融合基因，其具有
a) SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；或
b) 不同于上述l)所述的核苷酸序列但其编码的氨基酸序列与SEQIDNO:l 所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列相同的序列。
本发明的另一目的是提供所述的融合基因的制备方法，其主要包括以下步
1) 根据小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2的cDNA序列，设计并合成克 隆小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2胞外段编码基因FLK1265.2493的引物；
2) 使用上述步骤l)获得的引物进行PCR扩增小鼠血管内皮细胞生长因 子受体-2胞外段编码基因FLK1265.2 493，得PCR扩增产物；
3) 鉴定和纯化回收步骤2)获得的PCR扩增产物；
4) 纯化后的PCR扩增产物与载体进行连接反应后转化感受态细菌，得含有小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2胞外段编码基因FLK1265.2493的重组子；
5) 从所述步骤4)中获得的重组子中获得小鼠血管内皮细胞生长因子受体 -2胞外段编码基因FLK1 265-2 493 的基因片段；
6) 补体裂解片段C3d基因片段的获取；
7) 将步骤5)和6)中分别获得的基因片段连接后克隆入真核表达载体， 得到所述的融合基因表达质粒；
8) 鉴定并提取所述的融合基因表达质粒。
上述的融合基因的制备方法中步骤1)中所述的引物为SEQ ID NO:3和 SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列；
步骤2)中所述的PCR扩增反应的条件为95"C预变性5分钟；94"C变 性45秒，7(TC退火45秒，7(TC延伸45秒，扩增30个循环后，72'C延伸10分钟。
本发明还提供一种重组表达载体，其含有上述步骤5)中的小鼠血管内皮 细胞生长因子受体-2胞外段编码基因FLK1265.2 493的基因片段和步骤6)中所 述的补体裂解片段C3d基因片段。
本发明还提供一种含有上述的重组表达载体的宿主细胞。
本发明所述的融合基因可用于制备用于肿瘤预防和治疗的核酸疫苗。
本发明还有一个目的是提供一种核酸疫苗，其含有所述的融合基因。
本发明所述的疫苗与目前基于VEGFR-2的治疗策略和疫苗相比，在治疗 和预防肿瘤时具有以下优点1.可激发强大的免疫应答，打破肿瘤抗原自身耐 受现象；2.可持续在病人体内诱导合成高滴度的抗VEGFR-2抗体，而不是直 接给病人注射这种具有疗效的分子，从而不但可避免大剂量静脉给药引起的毒 副作用，并且减低了病人的费用；3. C3d和VEGFR-2均为人体自身存在的 组分，对人体无毒，可安全用于人体。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳 实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图1为FLKl265-2 493 PCR扩增产物和重组质粒pMDT-18-FLKl265-2 493限制性酶切电泳图1) X-EcoT14 I酶切 DNA分子量标准；2) PCR产物；3) pMDT画18國FLK265_2 493/Bgl II +Bam HI; 4) pMDT-18-FLKl265.2 493/Bgl II; 5) pMDT國18-FLK1265_2 493/Bam HI; 6) pMDT-18-FLK1265-2 493质粒；图2为重组质粒pSG.SS.FLKl265.2493.C3d3.YL构建示意图；图3为重组质粒pSG.SS.FLKl265.2 493.C3d3.YL的限制性酶切电泳图1) pSGSS.YL质粒；2) pSG.SS.YL/EcoR I ; 3) pSG.SS.FLKl265_2 493.YL/ EcoR I ; 4) pSG.SS.FLKl2,93.C3d3.YL/ EcoR I ; 5) pSG.SS.YL/ EcoR I十Hind III; 6) pSG.SS凡Kl脂柳.YIV EcoR I十Hind III; 7) pSG.SS.FLKl脂 493.C3d3.YL/ EcoR I +Hind III; 8) X-EcoT14 I酶切DNA分子量标准；图4和图5为FLK1265.2493/C3d3基于的DNA疫苗对小鼠生育能力的影响；图6为重组质粒pSG,SS.FLKl265-2柳.C3d3.YL转染Hela细胞培养上清液中 表达产物的Western blot分析1) pSG.SS.YL转染Hela细胞；2) pSG.SS.FLKl265.2493.YL转染Hela细胞; 3) pSG.SS.FLKl265-2493.C3d3.YL转染Hela细胞；图7A、图7B、图7C重组质粒pSGSS.FLKl265-2 493.C3d3.YL转染Hela细 胞表达产物的免疫细胞化学分析(x200)依次分别为pSGSS.YL 、pSG.SS.FLK1265-2493.YL 、 pSGSS凡K1265國2493.C3d3.YL;图8为FLK1265.2 493/C3d3基于的DNA疫苗对肿瘤的预防作用；图9为FLK1265.2493/C3d3基于的DNA疫苗对肿瘤的治疗作用；图10和图11为FLK1265.2 493/C3d3基于的DNA疫苗对荷瘤小鼠的存活作用。图12为FLKl265-2493/C3d3基于的DNA疫苗对抗体应答的激发作用。图13和图14为FLKl265-2493/C3d3基于的DNA疫苗通过激发抗体应答对 肿瘤生长的抑制作用。
具体实施方式
实施例l小鼠FLK-1胞外段编码基因FLKl265-2 493的获取(其序列见SEQ ID NO:2)① 根据小鼠FLK-1 cDNA序列，设计并合成一对针对FLK-1胞外段编码基因FLKl265-2 493的引物(由上海生工生物技术公司合成)，在上下游引物5'端分别添加Bg/ II和^m7/1限制性内切酶识别序列。 上游引物序列为SEQIDNO:3 :5 ，-GAAGATCTGCCTCTGTGG GTTTGC CTG GCG ATTTTC-3 ，； 下游引物序列为SEQIDNO:4:5，-CGGGATCCTTCCAAGTTGGTCTTTTCCTGGGCACC國3 ，；② 以pcDNA3.1(+)-FLKl重组质粒(由美国学者Reisfeld博士惠赠，其序 列和构建详见Nature Medicine, 2002。)为模板，采用上述引物进行PCR扩增。 扩增反应的条件为95'C预变性5分钟；9fC变性45秒，70。C退火45秒， 7(TC延伸45秒，扩增30个循环后，72'C延伸10分钟；◎ PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳，鉴定大小和纯化回收； 将纯化回收的PCR产物与T载体pMDT-18进行连接反应，然后转化 感受态DH5a细菌，筛选出重组子pMDT-18-FLKl265-2493。PCR产物与重组质粒pMDT-l 8-FLKl265.2 493限制性酶切电泳图参见附图1 。该实施例成功获取了 FLK-1胞外段编码基因FLK1265_2 493，并构建出含有 基因FLK1265_2493片段的质粒pMDT-18-FLKl265-2 493。实施例2FLK1265_2 493/C3d3融合基因的制备(其编码序列见SEQ ID NO:l) 重组质粒pSG.SS.FLKl265-2493.YL和pSG.SS,FLKl265-2493.C3d3.YL的构建 ①用限制性内切酶j5g/II和Baw/n对质粒pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL(其构建方法见美国专利6,238,670, Fearon等，2001)进行双酶切，使其成线 状；② 用Ag/II和I将FLK1265.2 493片段从质粒pMDT-18-FLKl265.2 493 上切下；③ 将扩增的两端分别带^am/n和限制性酶切位点的FLK1265.2 493 片段分别与上述酶切过的线状质粒pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL连接、转化 并筛选出重组质粒pSG.SS.FLKl265_2 493.C3d3.YL和pSG.SS.FLKl265-2W.YL。质粒pSG.SS.FLKl265.2柳.C3d3.YL和pSG.SS.FLKl265-2 493.YL构建示意图 及限制性内切酶鉴定结果分别参见附图2和3。重组质粒的序列测定采用的载体含有通用引物T7P，在371A自动测序 仪测定。结果表明重组质粒的序列与设计的完全一致。重组质粒 pSG.SS.FLKl265國2 493.C3d3.YL和pSG.SS.FLKl265-2柳.YL的序列如SEQ IDNO:5 和SEQ ID NO:6所示。该实施例成功构建了含有融合基因FLK1265.2 493/C3d3的重组表达质粒 pSG.SS.FLKl265.2 493.C3d3.YL及只含FLK1265_2 493基因片段的对照表达质粒 pSG.SS.FLKl265-2493.YL。实施例3FLKl265.2 493/C3d3融合基因的纯化和鉴定重组质粒的大量制备、纯化及其表达鉴定1. 制备用于免疫的质粒DNA将重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5a，铺琼脂LB培养基平板，挑取单 菌落，于液体LB培养基中大量扩增后，收集菌体，采用Qiagen质粒大量抽提 试剂盒抽提质粒，去除内毒素，以消除非特异因素对研究的影响，然后定量。2. pSG.SS.FLKl265-2493.C3d3.YL质粒在真核细胞中的表达和鉴定①将处于对数期的Hela细胞接种于细胞培养瓶和6孔培养板(孔内放盖 玻片)，在单层细胞上加入适量Lipofectamine2000-质粒混合物，轻轻混匀，置 C02培养箱中培养48小时。② 免疫印迹法检测转染细胞培养上清中的融合蛋白收集转染48小时的细胞培养上清，离心后装入透析袋，置于PEG6000固体中将上清浓縮50倍， 按常规方法进行SDS-PAGE和Western blot分析，其中一抗为大鼠抗小鼠 VEGFR-2单抗，二抗为HRP标记的羊抗大鼠IgG。加入化学发光试剂后，压 X-光片，显影，定影，结果见附图6;③ 免疫细胞化学实验检测胞浆中的融合蛋白取6孔板内的铺有转染细 胞的盖玻片，PBS洗涤后，免疫细胞化学法检测转染细胞胞桨中目的分子经 40g/L多聚甲醛固定和5 g/LTriton-X 100通透细胞膜后，依次加入一抗和二抗， DAB显色后于光镜下观察，并照相，结果见附图7A、图7B、图7C。从附图6可以看出在械81 730和183 040处有1明显的条带，大小分 别与FLK1 265-2 493 和融合分子(FLK1265_2 493/C3d3)理论值相符。为进一步直观 分析目的分子的表达和定位，我们对表达产物进行了免疫细胞化学分析。从附 图7可以看出，转染部分细胞胞浆和胞膜呈明显的棕褐色，表明目的片段在 Hda细胞中被正确表达，在胞浆中合成后，向胞外分泌，最后分泌到细胞培养 上清液。该实施例证实所构建的pSG.SS.FLKl265.2493.C3d3.YL真核表达质粒能够表 达具有天然生物学活性的融合蛋白。实施例4 FLKl265—2493-C3d3DNA疫苗的抗肿瘤效应① 将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分组，每组10只，分别经股四头 肌注射pSG.SS.FLKl265.2柳.C3d3.YL、pSG.SS.FLKl265.2柳.YL(对照)、pSG.SS.YL(对照)三种质粒，剂量为100ug/只。每周一次，连续免疫三次。在最后一次免 疫1周后，皮下注射5xl04 B10F16黑色素瘤细胞(该细胞接种小鼠后，小鼠 形成黑色素瘤)；② 为观察该疫苗对肿瘤的治疗作用，先给小鼠皮下注射5xl()SCT-26结肠 癌细胞以形成肿瘤，10天后将其随机分为三组，分别注射pSG.SS.FLKl265.2 柳.C3d3.YL、 pSG.SS.FLKl265-2柳.YL(对照)、pSG.SS.YL质粒(对照)，剂量为 100ug/只。每周一次，连续三次。 肿瘤大小的测量和估算按以下公式进行长度/2x宽度2。FLK1265_2 493/C3d3基于的DNA疫苗对肿瘤的预防与治疗作用结果分别见 附图8和附图9。FLKl265-2493/C3d3基于的DNA疫苗对荷瘤小鼠的存活影响见附图10和附 图11。结论与对照质粒pSG.SS.FLKl265-2 493.YL或pSG.SS.YL相比，FLKl265-2 493/C3d3基于的DNA疫苗对肿瘤具有很好的预防与治疗作用，并能显著延长 荷瘤小鼠的存活时间。实施例5 FLK1265.2493-C3d3 DNA疫苗抗肿瘤作用的免疫效应机制分析此部分研究的目的在于1) 测定免疫血清抗体滴度，证实FLK1265.2493-C3d3 DNA疫苗能够有效 激发抗体应答；2) 通过过继性转移实验，观察FLK1265_2493-C3d3 DNA疫苗诱导的免疫 血清能否有效抑制未免疫小鼠肿瘤的生长。具体实验方法如下1) 免疫血清的抗体滴度测定采用常规ELISA方法测定免疫小鼠血清中抗VEGFR-2抗体的滴度。即在 酶联板上包被重组纯化的VEGFR-2 ，500ng/孔，4。C过夜，用PBS冲洗3次后， 用封闭液37"C阻断lh。漂洗后，依次加入二倍稀释的免疫血清，37t孵育lh 后，漂洗，加入酶标二抗，显色，酶联仪检测。2) 过继性转移实验小鼠注射"105到lxl0l中瘤细胞一天后，注射免疫血清，100 L/只，每 周2次，连续三次，然后观察免疫血清对肿瘤生长的抑制作用。基于FLKl265-2 493/C3d3的DNA疫苗有效激发抗体应答结果见附图12。基于FLK1265_2 493/C3d3的DNA疫苗激发抗体应答抑制肿瘤生长的结果见 附图13和附图14。结论与对照质粒pSG.SS.FLKl265-2柳.YL或pSG.SS.YL相比，FLK1265_2 493/C3d3基于的DNA疫苗可有效激发抗体应答，并且其诱导的抗体对肿瘤具 有很好的抑制作用，能显著延长荷瘤小鼠的存活。实施例6检验FLKl26S-2493-C3d3 DNA疫苗是否存在副作用对生育能力的影响在最后一次免疫两周后，将免疫的雌性小鼠与雄性小鼠放置同一笼里，观 察各组小鼠生育幼仔的平均天数及幼仔的数目。FLK1265.2493-C3d3 DNA疫苗对小鼠生育能力的影响见附图4和附图5。结论与对照质粒口8&88丕00265-2 493.孔或？8688.孔相比，FLK1265.2 493/C3d3基于的DNA疫苗对小鼠生育没有影响，说明该疫苗是一种安全的疫 苗形式。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所 属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动 与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学 <120> —种融合基因及其制得的疫苗 <130> <歸 6<170> Patentln version 3. 2<210> 1<211> 4992<212> DNA<213>融合基因的序列<400> 1gcctctgtgggtttgcctggcgattttctcC3tCCCCCC8agctcagcac￡LC￡Lgaa￡Lg￡LC60atactgacaattttggcsaatacaacccttcagattacttgC8gggg3cagcgggacctg120gactggctttggcccaatgctceigcgtg3tgggteittggtg3Ctg33tgC180ggcggtggtgacagtatcttctgcaaaacactcaccattcccagggtggttggaaatgat240actggagcct8C犯gtgCtCgt3CCggg3Cgtcg3cata^gcctccactgtttatgtctat300gttcgagattacagatcaccattcatcgcctctgtcagtgacc3gcatggcatcgtgtec360aeictgtggtgatcccctgccg鄉gtcgatttcaaacctc420aatgtgtctctttgcgctagttccggatgg480tcctgggacagcg卿t鄉ctttactctccccagttacatgatcagctatgccggcatg540gtcttctgtgacctatcagtctatcatgtacat兆ttgtg600gttgtaggattgatgtgaittctgagccccccgcatgaaattgagctatct660gccgg卿犯aacttgtcttgCg卿ElC3gagctcaatgtggggcttgst720ttcacctggcactctccaccttc犯agtctca/tcataagaCCggg3tgtg780aaaccctttcctgggactgtggCg犯g3tgtttttgagcaccttgac犯t卿犯gtgtg840acc犯g3gtg3CC卿ggg3atacacctgtgtagcgtccagtgg3Cgg3tgatcaagaga900ttgtccgagttcacacaaagccttttattgctttcggtagtgggatgaaa960tctttggtggaagccacagtgggc敏c犯gtccgaatccctgtg犯gtatctcagttac1020ccagctcctggta_c8gaaatgg3鄉CCC3ttgeigtcc犯ctacacaatg1080fittgttggcgatg犯ctcacC3tcatggaagtgactg犯ag卿tgc鄉aaactacacg1140gtcatcctcacca^ccccatttc組ggaga犯cagagccacatggtctctctggttgtg體aatgtcccaccccagatcggtgeig肌agccttgatctcgcctatggattcctaccagtat函gggaccatgc3gac3ttg3catgcacagtctacgcc^ccctcccctgcaccac3tccaig1320tggtactggcagcctgctcct3C3g8CCCggCC犯3C冊gcccgtatgct1380tgta犯g犯tgg卿C8Cgtgg郷atttcc鄉gggg犯acaagatcgaagtcaccaaa1440犯ccaatatgccctgattgsgtscgctggtcatccaagct1500gccaacgtgtcagcgttgtagccatcaacs卿cgggacg1560gtcatctccttccatgtgatc鄉ggtcctgaaattectgtgc犯cctgctgcccagcca1620卿gtgtgtccctgttgtgcga犯tacgtttgagaacctc讓acgtggtacaagcttggctcacaggcaacatcggtccacatgggcg组c1740gtttgcaaga3Cttgg3tgCtctttgga犯ctgaatggcaccatgttttc1800犯tgac3tcttgattgtggcatttcag犯tgcctctctgcCg3Ct3tgtt1860tgctctgctcgacc肌g肌aagacattgccgctcatcatc1920ctagagcgcatggcacccatgatcax:cgga犯tctgg3gaiatcagacaac犯ccattggc1980
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权利要求
1.一种融合基因，其特征于包括小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2胞外段编码基因和三个串联的补体裂解片段C3d编码基因。
2. 根据权利要求l所述的融合基因，其特征在于小鼠血管内皮细胞 生长因子受体-2胞外段编码基因和三个串联的补体裂解片段C3d编码基 因之间直接连接，所述小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2胞外段基因位于 所述融合基因的氨基端，三个串联的补体裂解片段C3d基因位于所述融合 基因的羧基端.
3. —种权利要求1或2所述的融合基因，其特征在于具有a) SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；或b) 不同于上述l)所述的核苷酸序列但其编码的氨基酸序列与SEQID NO: 1所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列相同的序列。
4. 一种权利要求1或2所述的融合基因的制备方法，其特征在于包 括以下步骤1) 根据小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2的cDNA序列，设计并合 成克隆小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2胞外段编码基因FLK1265.2493的 引物；2) 使用上述步骤l)获得的引物进行PCR扩增小鼠血管内皮细胞生 长因子受体-2胞外段编码基因FLK1265.2493，得PCR扩增产物；3) 鉴定和纯化回收步骤2)获得的PCR扩增产物；4) 纯化后的PCR扩增产物与载体进行连接反应后转化感受态细菌， 得含有小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2胞外段编码基因FLK1265.2493的 重组子；5) 从所述步骤4)中获得的重组子中获得小鼠血管内皮细胞生长因 子受体-2胞外段编码基因FLK1265.2493的基因片段；6) 补体裂解片段C3d基因片段的获取；7) 将步骤5)和6)中分别获得的基因片段连接后克隆入真核表达载 体，得到所述的融合基因表达质粒；8) 鉴定并纯化所述的融合基因表达质粒。
5. 根据权利要求4所述的融合基因的制备方法，其特征在于步骤l) 中所述的引物为SEQIDNO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6. 根据权利要求4所述的融合基因的制备方法，其特征在于步骤2) 中所述的PCR扩增反应的条件为95'C预变性5分钟；94"C变性45秒， 7(TC退火45秒，70。C延伸45秒，扩增30个循环后，72。C延伸10分钟。
7. —种重组表达质粒，其特征在于含有权利要求书4所述的步骤5) 中的小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2胞外段编码基因FLKlw^93的基 因片段和步骤6)中所述的补体裂解片段C3d基因片段。
8. —种宿主细胞，其特征在于含有权利要求7所述的重组表达质粒。
9. 权利要求1或2所述的融合基因在制备用于肿瘤预防和治疗的核 酸疫苗中的应用。
10. —种核酸疫苗，其特征在于含有权利要求1或2所述的融合基因。
全文摘要
本发明涉及一种融合基因，包括小鼠血管内皮细胞生长因子受体-2胞外段编码基因和三个串联的补体裂解片段C3d编码基因，本发明还涉及该融合基因的制备方法，本发明所述的融合基因可用于制备用于肿瘤预防和治疗的核酸疫苗，本发明还涉及一种核酸疫苗，其含有所述的融合基因本发明所述的核酸疫苗与VEGFR-2 DNA疫苗相比，在治疗和预防肿瘤时具有以下优点1.打破免疫耐受激发强大的免疫应答；2.C3d是人体自身存在的一种组分，对人体无毒副作用，可安全用于人体。
文档编号C12N5/10GK101314777SQ20081006988
公开日2008年12月3日 申请日期2008年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者吴玉章, 许桂莲, 波 郭 申请人:中国人民解放军第三军医大学