专利名称：：小型猪细胞色素p450的基因的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域，特别涉及小型猪细胞色素P450的基因。技术背景细胞色素P450(cytochromeP450,CYP)是一组结构和功能相关的含铁血红素同工酶，参与许多外源化合物的转化过程，对生物体内的新陈代谢起着非常重要的作用。CYP是重要的药物代谢I相酶，现有超过9(T/。的药物都需要CYP的参与才能进行代谢。CYP主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族，其中CYP3A亚家族是CYP家族的主要成员，约占肝内CYP含量的30%,肠壁CYP含量的70%,是人类肝脏含量最高和代谢药物最广泛的P450酶。CYP在每一物种中均有多种亚型，且不同物种相应CYP的代谢特性具有不同差异。在药物研究中，为了能将动物实验的结果推广到人，针对不同性质的药物，需要根据动物相应CYP的药物代谢特性选择不同的实验动物，但猪相应CYP3A的药物代谢特性尚缺乏研究。近年来，随着动物保护运动的兴起和"3R，，原则的逐渐推广，非人灵长类及犬等高等动物的实验用途受到限制，猪由于其食性、解剖生理特点及药物代谢特点等与人的相似性，以其进行药物研究的应用逐渐增多。小型猪具有遗传特性稳定、体型小，詞养成本低，易于标准化质量控制，实验操作方便等优点，是目前医学生物学研究中的常规实验用猪，其作为新药安全性、有效性评价的实验动物具有良好的应用前景。因此，猪相应CYP3A的药物代谢特性具有重要的研究价值。获得异源表达的CYP是研究CYP药物代谢特性及体外药物筛选的基础，目前人、大鼠、小鼠、犬、牛等多种动物的CYP基因已经被克隆，各种CYP也已经在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等宿主中表达，但迄今为止，关于猪相应CYP3A的基因克隆及异源表达方面的报道极少。此外，在兽医临床上，兽药使用非常广泛，这些药物往往具有一定的毒性和蓄积性，带来潜在的食品安全问题，明确其在动物体内的消除特性将极大地提高对其最大残留量及休药期限制的准确性。而大多数兽药在动物体内的消除依赖于CYP，CYP的活性及其同工酶组成在很大程度上决定这些药物在动物体内的残留水平及在不同组织中的残留状况。由于CYP活性受到诱导、抑制等影响而导致药物之间相互作用引起的副作用在兽药中也同样存在。在新兽药的开发研究阶段，通过定量构效关系(QSAR)等预测化合物和猪CYP的相互作用并进行实验验证，了解何种CYP参与药物代谢及药物对CYP的影响，可预测其和其它药物间的相互作用。因此，克隆猪与人CYP3A亚家族相对应的基因，并进行异源表达，再进一步研究CYP3A亚家族在猪体内的药物代谢特性，对于药物代谢研究、体外药物筛选、兽药残留研究、兽药之间的相互作用研究以及新兽药研发等具有重要意义。
发明内容有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种小型猪细胞色素P450,具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本发明的目的之二在于提供编码所述小型猪细胞色素P450的基因。进一步，所述基因具有SEQIDNo.1中第56-1564位核苷酸序列；进一步，所述基因具有SEQIDNo.1中第1-1965位核苦酸序列。本发明的有益效果在于本发明首次克隆出一种小型猪细胞色素P450(在本发明中命名为CYP3A88)的cDNA全长序列，识别出其开放阅读框，并推导出其编码蛋白质(即CYP3A88)的氨基酸序列。CYP3A88为CYP3A亚家族的新成员，该酶可通过参与外源药物的I相代谢中的氧化反应，决定药物在小型猪体内的代谢动力学特性、毒副作用及药物相互作用特性。本发明获得的CYP3A88的基因，可以用于CYP3A88mRNA的表达水平研究，以评估小型猪是否适宜于作为人CYP3A介导的药理学研究动物模型，同时，通过测定CYP3A88mRNA的表达水平，还可以进行药物对小型猪CYP3A88基因表达的诱导或抑制作用研究；采用本发明获得的CYP3A88的基因，利用基因重组技术可异源表达CYP3A88，并制得CYP3A88的特异性抗体，用于药物在小型猪体内的代谢特性、毒理作用和药物相互作用研究，可为新药的有效性和安全性评价提供充分的基础数据；因此，本发明具有突出的实质性特点和显著的进步。图1为小型猪CYP3A88cDNA片段RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；图2为小型猪CYP3A88cDNA5'RACE扩增产物的琼脂4唐凝胶电泳鉴定图；图3为小型猪CYP3A88cDNA3'RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；图4为小型猪CYP3A88基因开放阅读框PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；图5为人、小型猪、犬、大鼠、小鼠CYP3A家族基因的邻接法(NJ)系统聚类树。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、小型猪CYP3A88基因的克隆1.小型猪CYP3A88cDNA部分序列的预测从CYP网站(http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html)下载主要哺乳动物(包括人、大鼠、小鼠、犬、牛)CYP3A亚家族的所有氨基酸序列，转换成FASTA格式，构建CYP3A种子序列库；从GenBank数据库下载猪的所有表达序列标签(expressedsequencetags,EST),构建猪UniGene序列库；采用BLAST程序(版本2.2.15),以CYP3A种子序列库中的所有氨基酸序列对猪UniGene序列库进行TBLASTN同源性检索，获得2条相似性最高的猪CYP3A同源EST(GenBank登录号分别为AJ958861和CB479861);将所得猪CYP3A同源EST用DNASTAR软件(版本7.1.0)进行电子拼接，得到1条922bp的重叠克隆群(contig)序列，即预测的小型猪CYP3A88cDNA部分序列；2.总RNA的提取将巴马香猪(4-6月龄，体重约10kg,由中国人民解放军第三军医大学实验动物学教研室提供)经戊巴比妥钠麻醉后，活体取出肝脏中叶左侧部分组织，用生理盐水沖洗后切成小块，迅速置液氮中冻存，备用；取50-100mg液氮冻存肝脏组织，采用TripureRNA提取试剂盒(ROCHE/>司)^是取总RNA,按照试剂盒说明书操作；提取的总RNA用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性，并用核酸蛋白定量仪测定浓度,取28SrRNA条带强烈且Aw，位于1.8-2.0之间的RNA样品用于后续实验；3.小型猪CYP3A88cDNA片段的克隆3.1引物的设计与合成根据步骤1预测的小型猪CYP3A88cDM部分序列，设计并合成l对引物Pl如SEQIDNo.3所示、P2如SEQIDNo.4所示；3.2小型猪CYP3A88cDNA片段的RT-PCR扩增采用反转录试剂盒(Promega公司)和PCR试剂盒(TaKaRa公司)两步法进行小型猪CYP3A88cDNA片段的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增逆转录制备cDNA，以步骤2提取的总RNA为模板，以01igo(盯)15为逆转录引物，反应过程为按质量比2:1加入总RNA和逆转录引物，使反应总体积为15(al，混匀，温度70。C水浴5分钟，立即冰浴5分钟，瞬时离心，再加入5xAMV緩冲液5pl、浓度为1Ommol/L的dNTPs2.5pl、浓度为40U/pl的RNasin1^1、浓度为10U/(al的AMV逆转录酶l.5总体积为25混匀，瞬时离心，温度42°C反应60分钟，95°C变性10分钟终止反应；PCR扩增双链cDNA，以逆转录制备的cDNA为才莫板，以步骤3.1合成的引物Pl、P2为上下游引物，反应体系为10xPCR反应緩沖液2.5jil、浓度为10mmol/L的dNTPs2.5pl、浓度为10^mol/L的上、下游引物各2[xl、冲莫4反2|11、浓度为5U/pl的DNA聚合酶0.5|il、浓度为50mmol/L的MgCl2溶液2pl、双蒸水补充至总体积为25pi;反应条件为温度96。C预变性5分钟，然后95°C变性30秒、58。C退火30秒、72。C延伸1分钟，共12个循环，每循环1次退火温度降低O.5°C;再95。C变性30秒，52'C退火30秒，72。C延伸1分钟，共33个循环；最后72。C延伸5分钟；PCR产物采用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，其中1泳道为DL200GPCR分子量标准(Takara/>司)，2泳道为PCR产物，从图可知，在约600bp的位置出现一条特异性DNA条带，与小型猪CYP3A88目的cDM片段(608bp)大小相符；鉴定正确的PCR产物采用凝胶回收试剂盒(Promega公司)进行纯化，按照试剂盒说明操作，选择约600bp的目的片段进行切胶回收，获得纯化的小型猪CYP3A88c腿片段；3.3小型猪CYP3A88cDNA片^殳的克隆及序列测定将步骤3,2所得纯化的小型猪CYP3A88cDNA片段与pMD18-T载体(TaKaRa公司)进行TA连接，连接方法为浓度为50ng/Vl的DNA片段4jal、浓度为50rig/pi的载体1^1、连接缓冲液5ji1，置温度为16。C孵育8小时，构建重组克隆载体pMD18-T/CYP3A88;将所得重组克隆载体转化入CaCl2法制备的DH5cc大肠杆菌感受态细胞，转化方法为将上述重组克隆载体IOnl加入到感受态细胞100pi中，水浴30分钟，42。C水浴热^木克90秒，立即冰浴2分钟，再加入液体LB培养基，于温度为37。C，150r/min振摇l小时，制得转化细胞；将所得转化细胞涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，于温度37。C倒置过夜，从平板上随机挑取数个白斑，接种于液体LB培养基中，于温度37。C、150r/min振摇过夜，采用质粒提取试剂盒(Promega公司)小量提取质粒，按照步骤3.2所述方法进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆质粒；取所得阳性克隆质粒，委托上海基康生物技术有限公司测定插入片段的序列，获得608bp的DM序列，与小型猪CYP3A88cDNA部分序列的预测值一致；4.小型猪CYP3A88cDNA全长的克隆采用cDNA末端快速扩增4支术(rapidamplificationofcDNAends,RACE),以SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech公司)对小型猪CYP3A88cDNA片段的5'和3'末端进行快速扩增，以获得小型猪CYP3A88cDNA全长。4.1引物的设计与合成根据步骤3.3测得的小型猪CYP3A88cDNA部分序列，分别i殳计5'和3'末端基因特异性引物(genespecificprimer，GSP)和嵌套基因特异性引物(nestedgenespecificprimer,NGSP):5'GSP如SEQIDNo.5所示，5'NGSP如SEQIDNo.6所示，3'GSP如SEQIDNo.7所示，3'NGSP如SEQIDNo.8所示；4.2小型猪CYP3A88cDNA片段的RACE扩增4.2.1cDNA第一链的制备以步骤2提取的总RNA为模板，按照试剂盒说明书逆转录制备5'和3'cDNA第一链；4.2.25'RACE扩增第一轮RACEPCR:以步骤4.2.1制得的5'cDNA第一链为模板，以通用引物(universalprimer,UPM)和步骤4.1合成的5'GSP为上下游引物，反应体系为5xPCR反应緩冲液5nl、浓度为10隨ol/L的dNTPs0.5pl、上、下游引物各0.5(!l、模板0.5(il、浓度为2.5U/(il的PrimeSTARDNA聚合斷TaKaRa公司)0.25nl、双蒸水补充至总体积为25反应条件为温度94。C预变性5分钟；然后94。C变性30秒，68。C退火30秒，72。C延伸1.5分钟，共31个循环，每循环1次退火温度降低0.5°C,31个循环后降至53°C;再94。C变性30秒，53。C退火30秒，72。C延伸1.5分钟，共10个循环；最后72""C延伸10分钟；反应起始时加入5'GSP,扩增10个循环后再加入UPM;第二轮RACE巢式PCR:以步骤4.1合成的5'NGSP、嵌套通用引物(nesteduniversalprimer,NUP)为上下游引物，反应条件与第一轮5'RACE相同，反应起始时加入5'NGSP,扩增10个循环后再加入NUP;5'RACE扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示，其中1泳道为DL2000PCR分子量标准(Takara公司)，2泳道为PCR产物，从图可知，在约1500bp的位置出现一条特异性DNA条带；将鉴定正确的5'RACE扩增产物进行切胶回收纯化；4.2.33'RACE扩增第一轮RACEPCR:以步骤4.2.1制得的3'cDNA第一链为模板，以UPM和步骤4.1合成的3'GSP为上下游引物，反应条件与第一轮5'RACE基本相同，不同之处在于每个循环中72。C延伸40秒，反应起始时同时加入UPM和5'GSP;第二轮RACE巢式PCR:以步骤4.1合成的3'NGSP、NUP为上下游引物，反应条件与第一轮3'RACE相同；3'RACE扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结杲如图3所示，其中l泳道为MarkerVPCR分子量标准(TianGen公司)，2泳道为PCR产物，从图可知，在约600bp的位置出现一条特异性DNA条带；将鉴定正确的3'RACE扩增产物进4亍切"交回收纯^:;4.3RACE扩增片段的克隆、序列测定及小型猪CYP3A88cDNA全长序列拼接按照步骤3.3所述方法，分别将步骤4.2所得纯化的5'和3'RACE扩增产物与pMD19-T载体连接，定向构建重组克隆载体pMD19-T/5'RACE、pMD19-T/3'RACE,将所得重组克隆载体转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，用PCR方法鉴定阳性克隆质粒并进行序列测定；测序结果显示，去除载体序列后，5'RACE扩增获得1541bp片段，3'RACE扩增获得606bp片段，5'和3'RACE扩增片段的序列用Pregap4软件进行拼接，重叠区域为184bp，得到全长为1965bp的拼接contig，说明已经获得完整的小型猪CYP3A88cDNA全长序列，如SEQIDNo.1所示；5.小型猪CYP3A88基因开放阅读框(ORF)的克隆根据小型猪CYP3A88cDNA全长序列，设计并合成如下引物P3如SEQIDNo.9所示、P4如SEQIDNo.IO所示；按照步骤3.2所述方法，以步骤2提取的总RNA为模板，以Oligo(dT)15为逆转录引物，以引物P3、P4为上下游引物，RT-PCR扩增小型猪CYP3A88基因ORF;PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图4所示，其中1泳道为WideRangeDNAMarker(500-12000bp,TaKaRa公司),2泳道为PCR产物,在约1600bp的位置出现一条特异性DNA条带，与引物设计的预测扩增大小(1613bp)相符，说明目的基因4并接正确；PCR产物经切胶回收纯化；按照步骤3.3所述方法，将所得纯化的PCR产物与pMD19-T载体连接，转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，用PCR方法鉴定阳性克隆质粒并进行序列测定，获得1613bp的cDNA序列，分析结果表明该序列包含长1509bp的小型猪CYP3A88基因0RF(SEQIDNo.1中第56-1564位核苷酸序列)，其编码有503个氨基酸的蛋白质(序列如SEQIDNo.2所示)，即CYP3A88。二、小型猪CYP3A88基因的序列分析和同源性比较将小型猪CYP3A88基因在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上进行BLAST同源序列比对，结果表明，小型猪CYP3A88基因为新发现的猪CYP3A亚家族基因，GenBank登录的猪CYP39v2(登录号为EF625354),CYP3A46(登录号为AB052266.1)均为该基因的片段。小型猪CYP3A88基因(SEQIDNo.1中第1-1965位核苷酸)全长1965bp,其0RF为1509bp(第56-1564位核苷酸)，编码有503个氨基酸的蛋白质(如SEQIDNo.2所示)；5'非编码区长55bp(第1-55位核苷酸)；3，非编码区长396bp(第1565-1965位核苷酸)，其中polyA长度为29bp(第1937-1965位核苷酸)。经SignalP3.0信号肽分析,小型猪CYP3A88的第1-29位氨基酸序列为信号肽序列。将CYP3A88氨基酸序列与小型猪其它3个CYP3A家族成员(CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22)进4亍对比，其相似性分别为92。/。，89%，80%。上述4个猪CYP3A家族成员与人CYP3A家族成员(CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A43)序列比对结果见表l,从表l中可看出，小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性最高，为77%。表l、小型猪CYP3A与人CYP3A的氨基酸序列相似性比较(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用Phylip3.66软件将小型猪和其它4种哺乳动物(人、犬、大鼠、小鼠)的CYP3A家族基因作系统聚类分析，结果如图5所示，图中H代表人、D代表犬、R代表大鼠、M代表小鼠，从图5可知，各物种的CYP3A基本各自为一分支，提示细胞色素P450具有较明显的种属差异性，在选择药物代谢模型的实验动物时应重视种属差异；小型猪CYP3A88首先与猪CYP3A其他成员聚为一类；然后猪与犬聚为一类，再和人聚为一类，而大鼠和小鼠聚在另一分支，说明猪、犬和人的细胞色素P450基因具有较近的遗传关系，从而推测在CYP3A亚家族参与的药物代谢中，猪与犬比大鼠和小鼠作为模型动物更为合适，由于小型猪的诸多应用优势，其作为CYP3A亚家族的药物代谢模型具有良好的应用前景。三、小型猪CYP3A88基因的用途小型猪CYP3A88基因编码相应的P450单酶CYP3A88,该酶通过参与外源药物的I相代谢中的氧化反应，决定药物的药代动力学特性、毒副作用及药物的相互作用特性。小型猪CYP3A88基因具有如下多种用途1、小型猪CYP3A88基因可用于CYP3A88mRNA的表达水平研究，这对于评估小型猪是否适宜于作为人CYP3A介导的药理学研究动物模型具有重要意义；同时，通过测定CYP3A88mRNA的表达水平，可进4亍药物对小型猪CYP3A88基因表达的诱导或抑制作用研究。2、以小型猪CYP3A88基因构建重组表达载体，转化入宿主细胞，诱导宿主细胞表达可获得小型猪CYP3A88，用于小型猪体内的药物代谢特性研究、毒理作用研究、药物相互作用研究等，一方面评价小型猪作为人类药物代谢模型的适用性；另一方面为评估兽药残留、兽药之间的相互作用、新兽药研发等提供基础依据。3、根据小型猪CYP3A88基因序列，可通过基因沉默、抗原抗体反应等抑制该基因表达或CYP3A88代谢酶活性，用于研究猪CYP基因的代谢特性。4、通过基因重组技术以小型猪CYP3A88基因制得小型猪CYP3A88后，可进一步制备小型猪CYP3A88的特异性抗体，用于CYP3A88基因的表达定量检测，为研究药物对小型猪CYP3A88基因的诱导或抑制作用提供必要的检测技术。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。<110>中国人民解放军第三军医大学<120>小型猪细胞色素P450的基因<160〉10<210〉1<211〉1965<212〉DM<213>猪(Susscrofa)<220><221>CDS<222〉(56)…(1564)<400〉1gggcacaaccagctaaaaggaaaatccgaggagagaatcacggaggacagtggccatg58Met1gacctgateccaggcttttecacagaaacctgggUetcctggetacc106AspLeulieProGlyPheSerThrGluThrTrpValLeuLeuAlaThr51015agectggtgetcetctatetatatgggactUtteacatggccttttt154SerLeuValLeuLeuTyrLeuTyrGlyThrTyrSerHisGlyLeuPhe202530aagaagctggggattcctgggccaagacctctgccttattUggaaat202LysLysLeuGlylieProGlyProArgProLeuProTyrPheGlyAsn354045atectgggctaccgtaagggtgttgaccatUtgacaaaaagtgtttt250lieLeuGlyTyrArgLysGlyValAspHisPheAsplysLysCysPhe50556065caacagtatgggaaaatgtgggggUttttgatggteggcagcccgtg298GinGinTyrGlyLysMetTrpGlyPhePheAspGlyArgGinProVal707580ttggetateaccgatccagacatgateaaaacggtcetcgtgaaagaa346lxuAlalieThrAspProAspMetlieLysThrValLeuValLysGlu859095tgttattctgtcUcacaaaceggeggtcttttggtccacgtggtget394CysTyrSerValPheThrAsnArgArgSerPheGlyProArgGlyAla100105110atgagaagtgetgtctctctggetgaggatgaagagtggaaaagaate442MetArgSerAlaValSerLeuAlaGluAspGluGluTrpLysArglie115120125cgaacgttgctgtctccgaccttcaccagtggaaagetcaaggagatg490ArgThrLeuLeuSerProThrPheThrSerGlyLysLeuLysGluMet130135140145ttccccateattagecattatggagacttgttggtgageaacctgagg538PheProlielieSerHisTyrGlyAspLeuLeuValSerAsnLeuArg150155160aaggaagcagagaaaggcaaacctgtgaccatgaaagacatetttggg586LysGluAlaGluLysGlyLysProValThrMetLysAspliePheGly165170175gcctacageatggacgtgateactageacagcatttggagtgaacgtc634AlaTyrSerMetAspVallieThrSerThrAlaPheGlyValAsnVal180185190gattecetcaacaacccacaagacccctttgtggaaaacageaggaag682AspSerLeuAsnAsnProGinAspProPheValGluAsnSerArgLys195200205etcttaaaatttagtttcUcagtccattcUtetcteaataatattc730LeuLeuLysPheSerPhePheSerProPhePheLeuSerlieliePhe210215220225tttccattcUgaccccgateUggaagtattaaacateactctgttt778PheProPheLeuThrProlieLeuGluValLeuAsnlieThrLeuPhe230235240cccaaaagtgttgtgaattttttcacgagatecataaaaaggatgaaa826ProLysSerValValAsnPhePheThrArgSerlieLysArgMetLys245250255gaaagtcgcetcaaagatacacaaaagcaccgagtggaccUcUcag874GluSerArgLeuLysAspThrGinLysHisArgValAspLeuLeuGin260265270ctgatgattaacteccagaattecaaagaaatggacgcccataaaggt922LeuMetlieAsnSerGinAsnSerLysGluMetAspAlaHisLysGly275280285ctgtecaatgaagaacttgtggcccaaggtgttatttttatttttget970LeuSerAsnGluGluLeuValAlaGinGlyValliePheliePheAla290295300305gggtatgagaccactageagttctetctecetccttgtgtatgaattg1018GlyTyrGluThrThrSerSerSerLeuSerLeuLeuValTyrGluLeu310315320gccactcaccctgacgtccagcagaagctgcaggaggagattgatgcg1066AlaThrHisProAspValGinGinLysLeuGinGluGlulieAspAla325330335accttccccaataaggcgcctcctacctaxgatggtctggcgcaaatg1114ThrPheProAsnLysAlaProProThrTyrAspGlyLeuAlaGinMet340345350gagtatcUgacatggtggtgaacgaatctetcagaatattcccagtt1162GluTyrLeuAspMetValValAsnGluSerLeuArgliePheProVal355360365actcctagagttgagagggtctgtaagaaggatgtggaaatecatggc1210ThiProArgValGluArgValCysLysLysAspValGlulieHisGly370375380385gtgttcValPhegttValcccProaaaLys390gggGlyactThrgtgValatgMetatgMet395gtgValccaProatelietttPhegcgAla400cttLeu1258cac3gaHisArggccAlaccgPro405gagGluetcLeutggTrpcc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