专利名称：检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于检测人线粒体基因表达的实验工具，具体的说，涉及一种检测
两种状态下人线粒体基因(mtDNA)和(nDNA)差异表达的实验工具。
背景技术：
目前，表达谱芯片是目前应用最广泛的基因芯片，是将少则几十个、多则 成千上万个特异的探针固定于一块载体上，可用以检测整个基因组范围内的众 多基因转录丰度的差异。表达谱芯片可以分析2组或2组以上不同来源的mRNA 转录丰度的差异，通过计算信号的比值和统计分析来获取差异表达基因的信息。 但目前人们着重发展基因芯片的高通量，其昂贵的实验费用使人们在科学研究 中对其望而却步。同时人们对线粒体基因表达的研究仅局限于个别基因，缺乏 对mtDNA在不同状态下差异表达的整体认识和对其进行内在联系的分析。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测人体线粒体基因差异性的整体表达情况，及 分析多个基因表达之间的内部联系的基因芯片。
一种检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片，在氨基硅烷修饰的玻璃基 片上点制有检测包括人线粒体基因编码的13种mRNA， 2种rRNA和9种tRNA基 因及核DNA(nDNA)编码的5种凋亡相关基因转录丰度的探针，其关键在于
所述的13种mRNA是，氧化呼吸链酶复合体I的NADH-CoQ还原酶亚单位1 (ND1) 、 NADH-CoQ还原酶亚单位2 (ND2) 、 NADH-CoQ还原酶亚单位3 (ND3)、 NADH-CoQ还原酶亚单位4(ND4)、 NADH-CoQ还原酶亚单位4L (ND4L) 、 NADH-CoQ 还原酶亚单位5(ND5)、 NADH-CoQ还原酶亚单位6(ND6)，复合体III的细胞色素 b(Cytb)，复合物IV的细胞色素氧化酶亚单位I (Cox I )、细胞色素氧化酶亚单 位II(CoxII)、细胞色素氧化酶亚单位ni(CoxIII)，以及复合物V的ATP酶亚单 位6 (ATPase6)和ATP酶亚单位8 (ATPase8或ND6L);
所述2种rRNA是，12S核糖体RNA (12SrRNA) 、 16S核糖体RNA (16SrRNA);
所述9种tRNA是，mtDNA轻链编码的丙氨酸转运RNA(tRNA-Ala)、天氡酰 胺转运RNA(tRNA-Asn)、半胱氨酸转运RNA(tRNA-Cys)、谷氨酸转运 RNA(tRNA-Glu)、丝氨酸转运RNA(tRNA-Ser),重链编码的精氨酸转运 RNA(tRNA-Arg)、天冬氨酸转运RNA (tRNA-Asp)、甘氨酸转运RNA(tRNA-'Gly)、 组氨酸转运RNA(tRNA-His);
所述核DNA(nDNA)编码的5种凋亡相关基因是，Bad、 Bax、 Bel-2、 Bcl2-Ll、
P53。
上述氨基硅垸修饰的玻璃基片上还点制有看家基因ActingP、 GAPDH作为 阳性内参照，人为书写长度为69mer寡核苷酸序列的探针为阴性内参照，并选 择Hex(hexa-chloro- 6- carboxy fluorescein)为检测样点固定的阳性对照。
分别检测所述人线粒体基因编码的13种mRNA转录丰度的寡核苷酸探针的 序列为
ACATCACCG;<formula>formula see original document page 9</formula>ND6L :
TACCACCTAC;
分别检测所述2种rRNA转录丰度的的寡核苷酸探针的序列为:
12Sr腿:
ACTACGAGCCACA;
16Sr跳
AAAGTCCTACGTG;
分别检测所述9种tRNA转录丰度的的寡核苷酸探针的序列为
tRNA-Al: MAGGGCTTAGCTTAATTAMGTGCTGATTTGCGTTCAGTTGATGCAGAGTGGGGT
TTTGCAGTCCTTA;
tRNA-Asm TAGATTGA'AGCCAGTTGATTAGGGTGCTTAGCTGTTAACTAAGTGTTTGTGGGTT TMGTCCCATTGGT;
tRNA-Cys: AGCTCCGAGGTGATTTTCATATTGAATTGCAAATTCGAAGAAGCAGCTTCAMCC TGCCGGGGCTT;
tRNA-Glu: GTTCTTGTAGTTGAMTACAACGATGGTTTTTCATATCATTGGTCGTGGTTGTAG TCCGTGCGAGAATA;
tRNA-Ser: TTGAAAAAGTCATGGAGGCCATGGGGTTGGCTTGAAACCAGCTTTGGGGGGTTCG ATTCCTTCCTTTTTTGT;
.t薩-Ar g: TGGTATATAGTTTAAACAAAACGAATGATTTCGACTCATTAAATTATGATAATCA TATTTACCAA;.
tRNA-Asp: AAGGTATTAGAAAAACCATTTCATAACTTTGTCAAAGTTAAATTATAGGCTAMTCCTATATATCTTA;
tRNA-Gly: ACTCTTTTAGTATAAATAGTACCGTTAACTTCCAATTMCTAGTTTTGACAACAT TCMMAAGAGTA;
價A-His: GTMATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAGGCTTACG ACCCCTTCTTTACC;
分别检测所述核DNA(nDNA)编码的5种凋亡相关基因Bad、 Bax、 Bcl-2、 Bcl2-Ll、 P53转录丰度的的寡核苷酸探针的序列为
CTTACCGAG;
CCCTTTTCT;
GGATGCAAAGA;
Bcl2-Ll: GTGAGCAGGTGTTTTGGACAATGGACTGGTTGAGCCCATCCCTATTATAAAAATGT CTCAGAGCMCCG;
CTTCCCCTCC;
上述每种基因探针均在氨基硅烷修饰的玻片上重复点制三次。 有益效果本发明基因芯片可以同时检测整个人体线粒体mtDNA和nDNA在 两种不同状态下的差异表达情况，并分析其内在联系；将基因芯片技术小型化、 专业化，高效、便捷的完成对人体线粒体mtDNA和nDNA表达的检测。
图l是芯片点样后扫描图； 图2是芯片杂交后扫描图。
具体实施例方式
实施例1
首先选择mtDNA编码的13种mRNA， 2种rRNA， 9种tRNA及核基因(nDNA) 编码的5种凋亡相关基因。具体包括，NADH-CoQ还原酶亚单位1 (ND1) 、 NADH-CoQ 还原酶亚单位2(ND2) 、 NADH-CoQ还原酶亚单位3(ND3) 、 NADH-CoQ还原酶亚单 位4 (ND4) 、 NADH-CoQ还原酶亚单位4L (ND4L) 、 NADH-CoQ还原酶亚单位5 (ND5)、 NADH-CoQ还原酶亚单位6 (ND6)，复合体III的细胞色素b (Cytb)，复合物IV的细 胞色素氧化酶亚单位I (CoxI)、细胞色素氧化酶亚单位II (CoxII)、细胞色素 氧化酶亚单位III (Coxin)，以及复合物V的ATP酶亚单位6 (ATPase6)和ATP酶亚 单位8(ATPase8或ND6L)，丙氨酸转运RNA(tRNA-Ala)、天氡酰胺转运 RNA(tRNA-Asn)、半胱氨酸转运RNA(tRNA-Cys)、谷氨酸转运RNA(tRNA-Glu)、 丝氨酸转运RNA(tRNA-Ser)，重链编码的精氨酸转运RNA(tRNA-Arg)、天冬氨酸 转运RNA(tRNA-Asp)、甘氨酸转运RNA(t認A-Gly)、组氨酸转运RNA(tRNA-His)， 以及在线粒体内膜发挥功能的凋亡相关的nDNA编码基因Bad、 Bax、 Bcl-2、 Bcl2-Ll、 P53。共包含目标基因29个。然后涉及29个目标基因的探针，设计 原则为长度约69mer、 Tm值尽量接近42。C、尽量选取靠近3'的序列、自身 无发夹结构、序列中尽量不含AAAA序列。
分别检测所述人线粒体基因编码的13种mRNA转录丰度的寡核苷酸探针的 序列为ND1
ACATCACCG;
ND2: CTACGCC;
,: AGTTATGTC;
ND4: C嵐CTCM;
ND4L:' TACTAGTCTC;
ND5: ACCCCATT;
DN6: CCTGTGGGT;
Cytb" GCCTCAACCG;
Cox I :, AGCTGACTCGC;
CoxII: ACCATCAMTC;
CoxIII: TCCTCATACTA;
13ATPase6: TGCAGGCCACCTACTCATGCACCTAATTGGAAGCGCCACCCTAGCAATATCAACCA TTAACCTTCCCTC;
TACCACCTAC;
分别检测所述2种rRNA转录丰度的的寡核苷酸探针的序列为 12SrRNA: CACTATGCTTAGCCCTAAACCTCAACAGTTAAATCAACAAAACTGCTCGCCAGMC ACTACGAGCCACA;
16Sr隱GGATCAGGACATCCCGATGGTGCAGCCGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATT
AAAGTCCTACGTG;
分别检测所述9种tRNA转录丰度的的寡核苷酸探针的序列为
t腿-Al: MAGGGCTTAGCTTMTT嵐GTGCTGATTTGCGTTCAGTTGATGCAGAGTGGGGT
TTTGCAGTCCTTA;
tRNA-Asn: TAGATTGAAGCCAGTTGATTAGGGTGCTTAGCTGTTAACTAAGTGTTTGTGGGTT TAAGTCCCATTGGT;
tRNA-Cys: AGCTCCGAGGTGATTTTCATATTGAATTGCAAATTCGMGAAGCAGCTTCAAACC TGCCGGGGCTT;
tRNA-Glu: GTTCTTGTAGTTGAAATACAACGATGGTTTTTCATATCATTGGTCGTGGTTGTAG TCCGTGCGAGMTA;
t腿-Ser: TTGAAAAAGTCATGGAGGCCATGGGGTTGGCTTGAMCCAGCTTTGGGGGGTTCG ATTCCTTCCTTTTTTGT;
t腿-Arg: TGGTATATAGTTTAAACAAAACGAATGATTTCGACTCATTAAATTATGATAATCATATTTACCAA;
tRNA-Asp: MGGTATTAGAAAMCCATTTCATAACTTTGTCAMGTTAAATTATAGGCTAAAT CCTATATATCTTA;
t腿-Gly: ACTCTTTTAGTATAMTAGTACCGTTAACTTCCAATTAACTAGTTTTGACAACAT TCMAAAAGAGTA;
t腿-His: GTAMTATAGTTTAACC嵐ACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAGGCTTACG ACCCCTTCTTTACC;
分别检测所述核DNA(nDNA)编码的5种凋亡相关基因Bad、 Bax、 Bcl-2、 Bcl2-Ll、 P53转录丰度的的寡核苷酸探针的序列为
Bad:
CTTACCGAG;
CCCTTTTCT;
Bcl-2: GGATGCAAAGA;
Bcl2-Ll: GTGAGCAGGTGTTTTGGACAATGGACTGGTTGAGCCCATCCCTATTATAAAAATGT CTCAGAGCMCCG;
CTTCCCCTCC;. .
寡核苷酸探针常温溶解于灭菌双蒸水中，使探针分子终浓度为40Pmol/L，并与含有1/20万Cy3的DMSO 1 : 1混合。用美国Genomic Solution公司的 Genemachines芯片点样仪按照预先设计矩阵将探针混合液点至氨基硅烷修饰的 玻璃基片上，样点的直径150jum，间距25pm。除目标基因外，芯片上还包括阳 性内参照(Acting 3 、GAPDH)、阴性内参照Negative (人为书写的寡核苷酸序列)、 空白对照(不含寡核苷酸的样点)、芯片洗脱检测点荧光素Hex，每个探针作3个 重复点，整个芯片上共包含132个样点。下例表1为各探针在芯片上的位置:
基因靶基因定位
名称(行、歹U)
Acting P(1，1)(1,2)(1,3)
tRNA-ffis(1'4)(1邻，6)
觀A-Cys(1,7)(1,8)(1，9)
薩A-Gly(1,10)(1,11)(1,12)
tRNA-Glu(2,1)(2,2)(2,3)
觀A-Ser(2，4) (2，5)(2,6)
tRNA-Ala(2,7) (2,8)(2,9)
應A-Asp(2,10) (2,11 )(2， 12)
tRNA-Asn(3，1) (3，2)(3,3)
tRNA-Arg(3,4) (3,5)(3,6)
GAPDH(3,7) (3,8)(3,9)
Cox I(3,10) (3,11)(3，12)
Cox II(4，1) (4，2)(4,3)
CoxIII(4,4) (4,5)(4,6)
Cytb(4,7) (4，8)(4,9)
ND1(4， 10) (4,11 )(4， 12)
ND2(5,1)(5，2)(5,3)
ND3(5，4) (5,5)(5,6)
ND4(5,7) (5，8)(5,9)
ND4L(5,10) (5，11)(5,12)
ND5(6，1)(6,2)(6,3)
ND6(6,4) (6,5)(6,6)
Negative(9,4)(9,5)(9,6)
ND6L(9,7) (9,8)(9,9)
ATPase6(9,10) (9,11 )(9， 12)
Bax(10,1)(10,2)(10,3)
Bad(10,4) (10，5)(10,6)
Bcl2(10,7) (10,8)(10,9)
Bcl2-U(10,10) (10,11)(10,12)
P53(1U)(11，2)(1U)
12SrRNA(11,4)(11，5)(11,6)
16S濯A(11，7) (11,8)(11,9)
Hex(11,10)(1U1)0U2)
各探针在芯片上的位置，各探针在芯片上的位置可以任意排列，也可以不同 与表1的排列方式，同样属于本发明的保护范围之内。
17图1为检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片整体扫描图，芯片上各绿 色圆点即为将不同基因探针点制在氨基硅烷修饰玻片上的样点，点样液中含有
40pmol/L浓度的探针，并含有1/20万Cy3，故扫描后可显示芯片的点样情况， 可见所有基因样点分布规整，点样均匀，无漏点。样点的直径15(^m，间距25pm。 所含29个目标基因及阳性对照、阴性对照依次分布于点阵中。
图2为芯片与待测样本杂交后的扫描图，来自两种不同样本的RNA分别标 记红色荧光与绿色荧光，根据不同荧光比值，可检测出两种状态下mtDNA的相 对差异表达情况。
权利要求
1、一种检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片，在氨基硅烷修饰的玻璃基片上点制有检测包括人线粒体基因编码的13种mRNA，2种rRNA和9种tRNA基因及核DNA(nDNA)编码的5种凋亡相关基因转录丰度的探针，其特征在于所述的13种mRNA是，氧化呼吸链酶复合体I的NADH-CoQ还原酶亚单位1(ND1)、NADH-CoQ还原酶亚单位2(ND2)、NADH-CoQ还原酶亚单位3(ND3)、NADH-CoQ还原酶亚单位4(ND4)、NADH-CoQ还原酶亚单位4L(ND4L)、NADH-CoQ还原酶亚单位5(ND5)、NADH-CoQ还原酶亚单位6(ND6)，复合体III的细胞色素b(Cytb)，复合物IV的细胞色素氧化酶亚单位I(Cox I)、细胞色素氧化酶亚单位II(Cox II)、细胞色素氧化酶亚单位III(Cox III)，以及复合物V的ATP酶亚单位6(ATPase6)和ATP酶亚单位8(ATPase8或ND6L)；所述2种rRNA是，12S核糖体RNA(12SrRNA)、16S核糖体RNA(16SrRNA)；所述9种tRNA是，mtDNA轻链编码的丙氨酸转运RNA(tRNA-Ala)、天氡酰胺转运RNA(tRNA-Asn)、半胱氨酸转运RNA(tRNA-Cys)、谷氨酸转运RNA(tRNA-Glu)、丝氨酸转运RNA(tRNA-Ser)，重链编码的精氨酸转运RNA(tRNA-Arg)、天冬氨酸转运RNA(tRNA-Asp)、甘氨酸转运RNA(tRNA-Gly)、组氨酸转运RNA(tRNA-His)；所述核DNA(nDNA)编码的5种凋亡相关基因包括Bad、Bax、Bcl-2、Bcl2-L1、P53。
2、 根据权利要求l所述的检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片，其特征在于所述氨基硅烷修饰的玻璃基片上还点制有看家基因ActingP、 GAPDH 作为阳性内参照，人为书写长度为69mer寡核苷酸序列的探针为阴性内参照， 并选择Hex (hexa-chloro- 6_ carboxy fluorescein)为检测样点固定的阳性对 昭。
3、根据权利要求1所述的检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片，其特 征在于分别检测所述人线粒体基因编码的13种mRNA转录丰度的寡核苷酸探针 的序列为NDl:. ACATCACCG;ND2:, CTACGCC;ND3:」 AGTTATGTC;ND4: CAAACTCAA;ND4L:' TACTAGTCTC;ND5:」 ACCCCATT;DN6: CCTGTGGbT;Cytb"GCCTCAACCG;Cox I :AGCATATTTCACCTCCGCTACCATAATCATCGCTATCCCCACCGGCGTCAAAGTATTT AGCTGACTCGC;Cox II: CGCCCTCCCATCCCTACGCATCCTTTACATAACAGACGAGGTCAACGATCCCTCCCTT ACCATCAAATC;CoxIII: TCAGCCCTCCTAATGACCTCCGGCCTAGCCATGTGATTTCACTTCCACTCCATAACGC TCCTCATACTA;ATPase6: TGCAGGCCACCTACTCATGCACCTAATTGGAAGCGCCACCCTAGCAATATCAACCA TTAACCTTCCCTC;ND6L : TTACCCCCATACTCCTTACACTATTCCTCATCACCCMCTAAAAATATTAAACACAAAC TACCACCTAC畺。
4、 根据权利要求l所述的检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片，其特 征在于分别检测所述2种rRNA转录丰度的的寡核苷酸探针的序列为-12SrRNA: CACTATGCTTAGCCCTAAACCTCAACAGTTAAATCAACAAAACTGCTCGCCAGAAC ACTACGAGCCACA;16SrRNA: GGATCAGGACATCCCGATGGTGCAGCCGCTATTAAAGGTTCGTTTGTTCAACGATT AAAGTCCTACGTG,。
5、 根据权利要求l所述的检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片，其特 征在于分别检测所述9种tRNA转录丰度的的寡核苷酸探针的序列为tRNA-Al: AAAGGGCTTAGCTTAATTAAAGTGCTGATTTGCGTTCAGTTGATGCAGAGTGGGGT TTTGCAGTCCTTA;tRNA-Asn: TAGATTGAAGCCAGTTGATTAGGGTGCTTAGCTGTTAACTAAGTGTTTGTGGGTTTAAGTCCCATTGGT;tRNA-Cys: AGCTCCGAGGTGATTTTCATATTGAATTGCAMTTCGAAGAAGCAGCTTCAAACC TGCCGGGGCTT;tRNA-Glu: GTTCTTGTAGTTGAAATACAACGATGGTTTTTCATATCATTGGTCGTGGTTGTAG TCCGTGCGAGAATA;tRNA-Ser: TTGAAAAAGTCATGGAGGCCATGGGGTTGGCTTGAAACCAGCTTTGGGGGGTTCG ATTCCTTCCTTTTTTGT;tRNA-Arg: TGGTATATAGTTTAMCMAACGAATGATTTCGACTCATTAAATTATGATAATCA TATTTACCM;tRNA-Asp: AAGGTATTAGAAAAACCATTTCATAACTTTGTCAMGTTAAATTATAGGCTAMT CCTATATATCTTA;tRNA-Gly: ACTCTTTTAGTATAAATAGTACCGTTMCTTCCAATTAACTAGTTTTGACAACAT TCMAAAAGAGTA;t薩-Hi sGTAAATATAGTTTAACCAAAACATCAGATTGTGAATCTGACAACAGAGGCTTACG ACCCCTTCTTTACC,
6、根据权利要求1所述的检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片，其特 征在于分别检测所述核DNA(nDNA)编码的5种凋亡相关基因Bad、 Bax、 Bel-2、 Bcl2-Ll、 P53转录丰度的的寡核苷酸探针的序列为CTTACCGAG;<formula>formula see original document page 6</formula>
7、根据权利要求l所述的检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片，其特 征在于所述每种基因探针均在氯基硅烷修饰的玻片上重复点制三次。
全文摘要
本发明公开了一种检测人线粒体基因差异性表达的基因芯片，在氨基硅烷修饰的玻璃基片上点制有检测包括人线粒体基因编码的13种mRNA，2种rRNA和9种tRNA基因及核DNA(nDNA)编码的5种凋亡相关基因转录丰度的探针，本发明基因芯片可以同时检测整个人体线粒体mtDNA和nDNA在两种不同状态下的差异表达情况，并分析其内在联系；将基因芯片技术小型化、专业化，高效、便捷的完成对人体线粒体mtDNA和nDNA表达的检测。
文档编号C12Q1/68GK101440397SQ200810070109
公开日2009年5月27日 申请日期2008年8月13日 优先权日2008年8月13日
发明者孙恒文, 孙玉兰, 胡义德, 钱海洪 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院