本发明属于生物技术领域，涉及一种基于证据的胃癌预后生物标记物的筛选方法。
背景技术：
胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在我国和全球发病率及死亡率均居恶性肿瘤前列。根据GLOBOCAN的统计，2008年，全球胃癌新增发病98.9万例，中国为46.3万例，占46.8%。胃癌死亡率仅次于肺癌居第二位，每年死亡人数约73.7万，中国为35.2万，占47.8%。我国，胃癌死亡率在恶性肿瘤中排名第三，仅次于肺癌和肝癌，死亡率为24.71/10万，占所有因癌症死亡人数的18.3%，其中男性死亡率（32.46/10万）明显高于女性（16.59/10万），农村高于城市。近年来，胃癌的发病率和死亡率有轻微的下降，然而，胃癌的发病逐渐年轻化，我国青年人胃癌占全部胃癌总数的比例由1.7%上升到3.3%。近年来，随着胃癌诊断技术的不断发展，胃癌的病因学研究和以手术切除、放射治疗、化学药物和靶向药物治疗为主的综合治疗取得了一定进展，早期胃癌的总生存时间显著提高，如果能够在胃癌病变仅限于黏膜层时发现病变，5年的生存率可达到95%。但胃癌患者早期常缺乏特异的临床症状和体征，我国早期胃癌的诊断率还不到10%，导致5年生存率在20%～50%。许多因素与胃癌的预后有关，如肿瘤的发生部位、组织学分级、淋巴结转移和血管侵犯等。目前判断胃癌预后的方法，主要还是依靠传统的局部淋巴结转移和TNM分期方法，但临床中的许多问题无法通过传统的预后方法解决，如相同的TNM分期且接受相同治疗的胃癌患者，其预后往往有很大的差异。个体化差异与预后及疗效的关系越来越受到临床医生和研究者的重视。因此，需要寻找新的可与TNM分析相结合的预后指标用以更准确的预测胃癌患者预后及对不同治疗的敏感性，指导临床治疗，最终实现对患者的个体化治疗，将能提高疗效、避免过度治疗和降低患者经济负担，减少医疗资源的浪费。生物标记物是一种具有特殊分子特征的，存在于血液、体液或者组织中可以用于衡量疾病进展和治疗效果的生物化学分子，也可以叫做分子标记。根据分子的类型可以分为DNA标记、RNA标记、蛋白质标记等；按照临床应用可以分为诊断标记、筛查标记、预后标记、易感标记等。生物标记物在生物医学领域的应用很多，如疾病的易感分析、疾病的筛查、疾病的诊断、疾病的预后评估、治疗方法的选择、治疗效果的评价和药物设计等。随着生物标志物研究的进展，人体自身的生物标记物有望成为诊断和治疗的基础，并帮助实现疾病早期诊断和患者的个性化治疗。胃癌侵袭和转移分子机制研究的进展已揭示了多种分子改变和胃癌的预后有关。伴随高通量分子生物学技术广泛应用，药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的飞速发展，人类对胃癌从基因、mRNA和蛋白水平到体内、外试验进行了系统的研究。肿瘤的转移为多步骤过程，包括瘤细胞脱落、局部浸润、迁移、血管浸润和血管生成、迁移至外周血并在血液循环中存活、内皮细胞粘附、渗出血管、在不同的器官中定居和重新生长等。多种基因参与肿瘤的转移调控，如细胞周期蛋白、细胞粘附分子、蛋白酶、血管生成和生长因子等，而这些转移相关基因、mRNA和蛋白表达可作为胃癌的预后生物标记物。另外，越来越多的证据显示，抗肿瘤药物机制相关的分子是识别患者个体差异的重要分子标记物，主要包括三类：1）抗肿瘤药物的作用分子标记物，如HER2和EGFR；2）抗肿瘤药物代谢相关的分子标记物，如UGT1A1和CYP2D6等基因多态性；3）抗肿瘤药物作用通路的相关分子标记物，如KRAS基因突变和ERCC1基因mRNA表达水平。寻找和发现有价值的胃癌预后生物标记物已经成为目前胃癌研究的一个重要热点。我国十分重视生物标记物的研究，将其列入了十二五等国家重点计划项目。研究人员一直致力于发现可靠的胃癌相关生物标记，已有2万多个研究发表在国际权威杂志上，每年有数以千记的研究成果，并且呈现加速增长趋势。其中，胃癌预后生物标记物的研究尤为突出，已有上万个相关研究成果发表，约占有一半的胃癌生物标记物研究，已发现了上百个潜在的预后标记物。虽然研究人员每年开展了大量的临床实验，花费了大量的研究人力和财力。然而，胃癌预后生物标记物的研究成果很少能被医生和企业应用于临床。其主要原因是大量科学研究的信息不经过合理的深加工，其利用价值是很低的。对同一个问题，全球不同的实验室可能同时展开研究，受试验对象、样本量，地区、实验设计等因素的限制，可能得出不一致甚至是矛盾的结论。在单个研究中，研究人员常常会对某个预后生物标记进行夸张性宣传，而包含正面结果的研究也容易被研究人员引用。由于以上的原因，临床医生和企业应用生物标记物所需要的知识积累和时间花费将是巨大的，极大的影响了胃癌预后生物标记物的研究和应用进程。如何在目前海量的生物标记物研究数据中挖掘和搜集信息，评估和处理数据，筛选出具有应用价值或潜在应用价值的预后生物标记物已经成为一个急需解决的问题。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种基于证据的胃癌预后标记物筛选方法，即是一种通过对海量的生物标记物研究数据的挖掘和信息搜集，科学评估、加工、整理和处理数据，按照评价标准筛选出胃癌预后生物标记物的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于证据的胃癌预后分子标记物筛选方法，包括以下内容：1）、为胃癌预后生物标记物的实验研究制定纳入标准：主要在研究设计、研究人群、临床效应指标、生物标记物种类等方面进行限制；2）、制定研究证据检索策略：全面而系统地检索临床研究证据数据库，包括PubMed、Embase、中国生物医学文献数据库（CBM），万方数据库和中国知识资源总库（CNKI）；只检索以人为研究对象的研究，研究类型和出版语言不受限制；检索纳入研究的参考文献；3）、初步筛选预后生物标记物：将检索到的研究证据按照纳入标准，确定胃癌预后生物标记物的种类和数量，构建生物标记物数据库；生物标记物按照研究设计方法、研究的数量和研究的样本量进行筛选，筛选出满足以下任一一个条件的生物标记物：（1）具有随机对照实验；（2）研究数量≥3并且研究样本量≥500；将筛选出来的生物标记物进行证据的扩大再搜索，丰富临床证据；4）、研究资料提取：由2名研究者按照预先制定的研究资料提取内容及标准独立进行资料提取以及交叉核对，确保研究资料提取和质量评价的结果具有一致性，意见不一致时交由第3位研究者确定；如果使用了相同的研究对象，选取样本量最大的或者包含所有相同研究对象的研究；5）、试验研究质量评估：使用Newcastle-OttawaScale对纳入的研究进行质量评估，主要评价患者选择，退出随访，确认生物标记物状态的准确性，诊断准确性，预后指标评估的准确性和控制混杂因素的准确性；6）、标准化数据处理：采用标准化统计策略，合并测量指标，评估生物标记物对胃癌预后的效能和价值；若存在系统综述和Meta分析研究，直接将数据列入最终结果，否则进行统计分析。标准化统计策略主要包括：Meta分析，亚组分析，敏感性分析，Meta回归分析，异质性评估，累积Meta分析，发表偏倚评估；7）、预后生物标记物筛选：经过标准化数据处理的胃癌预后生物标记物研究，按照研究设计方法、研究质量、样本量、预后指标结果的显著性进行筛选，获得具有潜在应用价值的胃癌预后生物标记物；筛选标准如下：（1）具有一系列随机对照实验研究，合并样本量≧500例，OS、临床病理特征、PFS、复发、毒性等预后指标显著（p＜0.05），无发表偏倚（p>0.05）；（2）只有单篇随机对照实验研究，样本量≥300例，失访率＜20%，研究质量高(患者来源明确，具有随机方案，胃癌分期等信息，分子标记物检测方法科学可靠，预后指标评估按照国际标准，随访充分，统计方法科学等)，OS、临床病理特征、PFS、复发、毒性等预后指标显著（p＜0.05）；(3)具有多个实验研究，合并样本量≥1000，OS、临床病理特征、PFS、复发、毒性等预后指标显著（p＜0.05），无发表偏倚（p>0.05）；（4）只有单个多中心大样本研究，样本量≧500例，失访率＜20%，研究质量高(患者来源明确，胃癌分期等信息，分子标记物检测方法科学可靠，预后指标评估按照国际标准，随访充分，统计方法科学等)，OS、临床病理特征、PFS、复发、毒性等预后指标显著（p＜0.05）；8）、根据筛选标准，筛选出具有潜在应用价值的胃癌预后生物标记物，并描述预后价值。本发明的创新点在于：1.相对于单个实验研究筛选生物标记物，本方法能在海量的研究数据中剔除不相关研究，最大限度地利用已有研究证据，能综合地评估生物标记物的价值，筛选出胃癌预后生物标记物。2.相对于通过传统的多中心大样本试验研究来发现预后标记物的方法，本方法能以更快的速度、更少的人力和财力筛选到具有潜在应用价值的预后生物标记物，方便研究人员、医生和企业应用。综上所述，本发明利用了一种基于研究证据的生物标记物筛选方法，来进行胃癌预后生物标记物的筛选，以降低筛选成本，缩短筛选时间，降低专业门槛，提高预后生物标记物的应用价值。具体实施方式实施例1、一种基于证据的胃癌预后分子标记物筛选方法，依次进行以下步骤：1.制定研究证据纳入标准：（1）研究人群为胃癌患者；（2）评估生物标记物与临床效应指标之间的关系，临床效应指标必须是总体生存期（OS）、无进展生存期（PFS）、化疗药物敏感性、复发、毒副作用、临床病理特征等中的一种或几种；（3）生物标记物为基因突变、基因多态性、mRNA表达水平、蛋白表达水平、microRNA和微卫星中的一种或几种；（4）提供明确的生物标记物检测方法；（5）研究设计必须随机对照实验、横截面研究、队列研究或者系统综述（满足上述至少一种），分为前瞻性研究和回顾性研究。排除下列研究：（1）没有对照组；（2）无分子标记物检测方法；（3）重复的研究；（4）细胞或者动物实验；（5）综述文章；（6）没有研究生物标记物与胃癌预后关系。2.系统性检索胃癌预后生物标记物相关的研究证据，数据库包括PubMed、Embase、CBM、CNKI和万方数据库。PubMed和Embase数据库的检索式为：("Stomach"OR"Gastric")AND("cancer"OR"cancers"OR"tumor"OR"tumors"OR"neoplasm"OR"neoplasms"OR"adenoma"OR"adenomas"OR"carcinoma"OR"carcinomas"OR"adenocarcinoma"OR"adenocarcinoma"OR"malignant"OR"malignancy")AND("response"OR"survival"OR"outcome"OR"resistance"OR"outcomes"OR"recurrence"OR"relapse"OR"toxicity"OR"responder"OR"responders"OR"adverseevents"OR"adverseevent"OR"adverseeffect"OR"adverseeffects"OR"prognosis"OR"prognostic"OR"predictive")AND("polymorphism"OR"polymorphisms"OR"polymorphic"OR"geneticvariant"OR"geneticvariants"OR"mutation"OR"muton"OR"mutations"OR"mutons"OR"expression"OR"expressions"OR"express"OR"mrna"OR"biomarker"OR"biomarkers"OR"microsatellite"OR"microsatellites"OR"allele"OR"gene"OR"protein"OR"MicroRNAs"OR"miRNAs"OR"miRNA"OR"MicroRNA"OR"RNA,Micro"OR"MicroRNA"OR"pri-miRNA"OR"RNA,SmallTemporal"OR"TemporalRNA,Small"OR"stRNA"OR"SmallTemporalRNA"OR"pre-miRNA")；CBM，CNKI和万方数据库的检索式为：(“胃癌”OR“stomachcancer”OR“gastriccancer”)AND(“敏感性”OR“生存期”OR“生存”OR“PFS”OR“OS”OR”survival”OR“response”OR“responder”OR“outcome”OR“复发”OR“recurrence”OR“relapse”OR“毒性”OR“副作用”OR“预后”OR“预测”OR“prognosis”OR“prognostic”OR“predictive”OR"adverseevent"OR"adverseeffect"OR“淋巴结转移”OR“疗效”OR“药物反应”)AND(“多态性”OR“突变”OR“微卫星”OR“表达”OR“生物标记物”OR“分子标记物”OR"polymorphism"OR"mutation"OR"expression"OR"mrna"OR"biomarker"OR"microsatellite"OR"MicroRNAs"OR"miRNA")。只检索以人为研究对象的研究，研究类型和出版语言不受限制。检索纳入研究的参考文献。3.初步筛选预后生物标记物（1）根据研究证据检索结果（即上述步骤2所得的结果），按照证据纳入标准，构建胃癌预后生物标记物数据库。（2）筛选出具有随机对照实验研究或者研究数量≥3并且研究样本量≥500的标记物。其中随机对照实验研究通过直接对检索式限定进行多个数据库检索后获得，研究数量和研究样本量由检索结果的统计分析获得。如Cdx2表达水平与胃癌预后相关的研究有13个，总样本量大于1500例。备注说明：此步骤是初步筛选标记物，根据这个步骤，筛选到了其中一个Cdx2，后面以Cdx2为例进行分析。（3）紧接着对筛选到的Cdx2进行PubMed、Embase、CNKI、CBM和万方数据库的研究证据再检索，检索式只包括胃癌和Cdx2标记物两块内容，以获得更全的研究证据。检索式为：((("Stomach"OR"Gastric")AND("cancer"OR"cancers"OR"tumor"OR"tumors"OR"neoplasm"OR"neoplasms"OR"adenoma"OR"adenomas"OR"carcinoma"OR"carcinomas"OR"adenocarcinoma"OR"adenocarcinoma"OR"malignant"OR"malignancy"))OR"胃癌")AND("CDX2"OR"CDX-2"OR"caudaltypehomeobox2"OR"CDX3"OR"CDX-3")。检索结果获得616个相关文献，其中符合研究证据纳入标准的共有13项研究。4.由2名研究者独立对13项符合纳入标准的研究，进行研究资料提取。对提取的资料内容进行核对，采用一致的内容，若出现不一致情况，交由第3位研究者确定。提取的主要资料包括：研究作者，发表时间，研究对象来源（医院、地区、国家和种族等），患者的基线情况（年龄、性别等），研究样本量，胃癌是否经过组织或病理确认，胃癌的分期和分化状况，试验研究设计，检测Cdx2表达水平的方法，是否采用了盲法，Cdx2阴性和阳性表达的标准，是否实施放疗或化疗治疗，OS、复发、临床病理参数（性别、年龄、肿瘤位置、临床分期、肿瘤分化、血管浸润、淋巴结转移）等预后指标，随访时间，统计分析方法等。备注说明：步骤4将步骤3筛选到的符合标准的研究，提取数据，用于后续步骤5和6的分析。5.使用Newcastle-OttawaScale对纳入的13项研究（即根据检索结果，符合第1步纳入标准的Cdx2的13项研究）进行质量评估，主要评价病人选择，退出随访，确认生物标记物状态的准确性，诊断准确性，疗效评估的准确性和控制混杂因素的准确性。Newcastle-OttawaScale针对研究样本选择、可比性和研究结果三类指标，共8个项目进行研究质量评估。其中，研究样本选择有4个项目，研究结果有3个项目，每个项目各1分；可比性有1个项目，最高可得2分。在总共9分中，得到6分及以上的研究为高质量的研究，否则为低质量研究。若研究为高质量研究，进行标准化数据处理和分析；若研究为低质量研究，直接将此研究舍弃。纳入的Cdx2表达水平相关的13项研究，都是高质量研究，用于标准化数据处理。6.标准化数据处理采用标准化统计策略，合并测量指标，综合地评估生物标记物对胃癌预后价值。数据处理分为两部分：首先评估Cdx2表达水平与总体生存期之间的关系；然后分析Cdx2表达水平与临床病理参数的关系，包括性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、组织分化、侵入深度、血管浸润、淋巴结状态、远处转移和TNM分期。（1）Cdx2表达水平与胃癌预后之间的关系用RR和HR及95%置信区间来评估，其中RR用来评估二分类指标，HR用来评估生存期指标。HR通过原始研究数据或者Kaplan-Meier生存曲线计算获得。（2）Q统计量检验研究间的异质性。由于统计效力较低，将显著性水平定位0.10。若研究间存在显著异质性，采用固定效应模型(倒方差方法或者Mantel–Haenszel方法)对RR或者HR值进行合并，若研究之间有显著异质性，采用随机效应模型（DerSimonianandLaird方法）。合并RR或者HR值的检验使用Z统计量。（3）进一步用I2统计量来检验研究之间的异质性。Q值的大小取决于合并方差、效应值的离散程度以及纳入研究的证据数量，随着证据数目的变化而变化，I2统计量是利用了自由度校正了研究证据数目对Q值的影响。因此I2统计量揭示的异质性检验结果更为稳健可靠，特别是对于研究数量较少的分层分析。当I2=0时，表明研究间的变异仅由抽样误差引起；当I2<0.25时，则认为存在轻度异质性；当I2在0.25和0.5之间时，则认为存在中度异质性；当I2>0.5时，将被认为存在高度异质性。（4）亚组分析和Meta回归寻找异质性来源。Meta回归利用限制性最大似然法来估计权重系数，能同时整合研究内部和研究之间的差异。由于Meta回归分析的统计效力较低，将统计显著性水平定为0.10。（5）敏感性分析通过评估单项研究或单个因素对于Meta分析结果的影响，来衡量合并结果的可靠性。累积Meta分析用来分析合并RR或者HR值随着发表时间推移的趋势。使用漏斗图对文章发表偏倚进行评估，进一步用Egger提出的t检验来定量评估漏斗图的对称性。7.预后生物标记物筛选经过标准化数据处理的Cdx2表达水平与胃癌预后关系的研究结果，按照研究设计方法、研究质量、样本量、预后指标结果的显著性进行筛选。（1）研究共纳入了13个独立试验，包括1513例胃癌患者，各个研究质量较好，评估了Cdx2表达水平与5年总体生存期和临床病理学参数之间的关系。（2）Cdx2阳性表达与提高的5年总体生存期显著性相关联，合并HR为2.22（95%CI：1.78-2.75，P<0.001）。（3）Cdx2表达水平与胃癌的侵袭性生物表性显著相关（性别、肿瘤分期、肿瘤分化、血管浸润和淋巴结转移）。Cdx2阳性表达患者具有更低的血管浸润和淋巴结转移风险。（4）敏感性分析显示Cdx2表达水平与胃癌预后的关系可靠，发表偏倚可能性很小（P>0.05），表明了结果的可信度。8.根据筛选标准，筛选得到Cdx2表达水平是一个具有潜在应用价值的胃癌预后生物标记物。Cdx2阳性表达与更低的血管浸润和淋巴结转移、提高的5年总体生存期显著关联。此外，通过本方法还筛选到了多个胃癌预后生物标记物，如E-cadherin表达水平，TYMS2R/3R多态性，GSTP1Ile105Val多态性，telomerase活性，VEGF表达水平，MMP-9表达水平，HER-2/neu表达水平等。9.开展验证试验，对Cdx2表达水平作为胃癌预后生物标记物进行验证。回顾性的连续纳入100例胃癌患者，分析其Cdx2表达水平与5年总体生存期之间的关系。采用Cox比例分配模型统计分析，结果显示Cdx2阳性表达与提高的5年总体生存期显著性相关联，HR为1.99（95%CI：1.27-3.13）。此结果与筛选方法得出的结果一致，表明本方法的可靠性。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。