一种基于Dal80p为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于Dal80p为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋水、加麦曲加发酵剂加水、拌匀、落缸搭窝、糖化、发酵和后处理；发酵剂中含有敲除了DAL80基因的酿酒酵母菌粉。本发明以转录抑制因子Dal80p为调控靶标，采用酿酒酵母DAL80敲除菌部分或全部替换传统发酵剂酒药进行黄酒酿造，能有效抑制酿造过程中氨基甲酸乙酯的形成，同时受限因素少，对成品黄酒的酒精度、风味和品质影响不显著。
【专利说明】
一种基于Da 180p为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及食品安全与发酵酿造领域，尤其涉及一种基于DalSOp为靶标抑制氨基 甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法。
【背景技术】
[0002] 黄酒是我国传统酿造的特色发酵饮品，黄酒中保留了发酵过程中的营养物质和活 性物质，对人体具有抗癌、抗衰老和保健功能，因此传统黄酒越来越受推崇。但是黄酒酿造 过程中，含氮化合物的不完全代谢使发酵液中积累大量氨基甲酸乙酯前体物尿素，尿素能 够与乙醇作用生成氨基甲酸乙酯，2007年，氨基甲酸乙酯被国际癌症研究机构提升为2A级 另IJ，即对人类具有潜在致癌性。因此控制黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯形成是当前食品生 物安全领域的研究热点。
[0003] 黄酒酿造过程中，氨基甲酸乙酯最主要前体物尿素主要来源于发酵原料和发酵过 程中酿酒酵母对精氨酸的利用。精氨酸在精氨酸酶和鸟氨酸转氨酶的连续作用下降解为尿 素，生成的尿素在脲酶作用下进一步降解为谷氨酸盐和二氧化碳。但在实际发酵过程中，氮 代谢抑制调控机制抑制尿素的进一步降解，因此发酵过程中不断积累大量尿素，并与乙醇 作用生成氨基甲酸乙酯。
[0004] 目前基于氨基甲酸乙酯形成前体物的代谢途径，黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯的 抑制途径主要包括，外源添加酸性脲酶和基因工程手段改造发酵菌株。研究报道黄酒中通 过外源添加酸性脲酶能较高水平的降低发酵液中的尿素和氨基甲酸乙酯浓度(参考文献： Jun LiujYao Nie,Guang-ao Zhao,Optimization production of acid urease by Enterobacter sp. in an approach to reduce urea in Chinese rice wine[J] .Bioprocess and biosystems engineering，2012.35(4) :651-657)，但应用该方法也受很 多因素的影响，如酒的品种、发酵过程实际应用条件及发酵液中的抑制因子，其中被证实的 抑制因子包括氟化物、苹果酸盐、乙醇及酚类等化合物。基因工程手段改造发酵菌株主要包 括敲除精氨酸酶基因和过表达脲酶编码基因，利用改造后的菌株进行黄酒酿造实验，结果 表明，发酵液中尿素浓度分别降低95.8%和86.9% (参考文献:DianhuiWu,XiaomingLi， ChaoShen,et al.Decreased ethyl carbamate generation during Chinese rice wine fermentation by disruption of CARlin an industrial yeast strain[J] .International journal of food microbiology,2014.180:19-23；Yuqing YangjZhen Kang ,Jianli Zhou , et al. High-level expression and characterization of recombinant acid urease for enzymatic degradation of urea in rice wine[J] ? Applied microbiology and biotechnology，2015,99(l) :301-308. )D应用精氨酸酶基因 敲除菌株进行黄酒酿造虽然对氨基甲酸乙酯的调控有显著作用，但精氨酸的利用途径被切 断，造成发酵液中精氨酸的积累，最终影响酿造产品的风味与品质。
[0005] 目前，氮代谢抑制调控机制对尿素和精氨酸降解途径的调控作用被进一步解析， 这为黄酒酿造中氨基甲酸乙酯的抑制途径提供新的靶标和思路。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种基于DalSOp为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法，能 有效抑制传统黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯的形成，同时受限因素少，对成品黄酒的酒精 度、风味和品质影响不显著。
[0007] 一种基于DalSOp为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、 淋水、加麦曲加发酵剂加水、拌匀、落缸搭窝、糖化、发酵和后处理;所述发酵剂中含有敲除 了 DAL80基因的酿酒酵母菌粉。
[0008] 尿素是黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯形成的最主要前体物，根据已有研究报道， DalSOp是一种在氮代谢阻遏条件下起抑制作用的转录调控因子，本研究在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达蛋白Da180p，并通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证了Da180p对尿素降解酶的转录 抑制作用，为此，本发明从这一角度出发，将敲除了DAL80基因的酿酒酵母添加到发酵剂中， 从而实现黄酒酿造过程中降低尿素含量、抑制氨基甲酸乙酯形成的目的。
[0009] 传统黄酒酿造工艺可以采用淋饭法，包括浸米、蒸饭、淋水、加麦曲加发酵剂加水、 拌匀、落缸搭窝、糖化、发酵和后处理。
[0010] 所述的米可以为糯米、粳米和籼米中的至少一种。浸米时，以每千克米计，水的用 量可以为1.0-1.5L，优选为1.2L。
[0011] 所述浸米温度可以为25-30Γ，浸米时间可以为1-3天，具体条件可根据米质、水温 不同而有所差异。优选地，所述浸米温度为28 °C，浸米时间为2天。
[0012] 传统黄酒酿造中多采用酒药作为发酵剂，酒药中的微生物主要为酿酒酵母，在酿 造过程中起发酵作用。本发明中，所述敲除了DAL80基因的酿酒酵母菌粉可以为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)YSC6273-201937947菌粉。酿酒酵母YSC6273-201937947购于 通用电气医疗集团生命科学部（GE Healthcare Life Sciences)，菌株编号YSC6273-201937947,为敲除了DAL80基因的酿酒酵母（DAL8〇A，Yeast MATa Knock Out Strain YKR034W，Cloneld:7047)。
[0013] 优选地，所述发酵剂可以为酿酒酵母YSC6273-201937947菌粉和酒药的混合物;更 优选地，所述发酵剂为酿酒酵母YSC6273-201937947菌粉。以敲除了 DAL80基因的酿酒酵母 菌粉部分或全部替代酒药，不但能有效抑制酿造中氨基甲酸乙酯的形成，还能保持黄酒原 有的风味和品质;特别地，全部替代时对氨基甲酸乙酯的抑制效果最好。根据本研究结果， 利用酿酒酵母YSC6273-201937947菌粉全部替代酒药进行发酵，糖化、发酵30天后，黄酒成 品中氨基甲酸乙酯的浓度降低38.5%，且酒精度、风味物质组成、和氨基酸组成差异不大。
[0014] 所述酿酒酵母YSC6273-201937947菌粉可以通过如下方法制备：将酿酒酵母 YSC6273-201937947进行发酵培养，收集菌体、冷冻干燥后制得。
[0015] 以每千克米计，所述麦曲的加入量为60-200g，发酵剂的加入量为l-5g，水的加入 量为1.0-1.5L;优选地，以每千克米计，所述麦曲的加入量为180g，发酵剂的加入量为2g，水 的加入量为1.2L。添加麦曲主要起糖化作用。发酵剂添加过多会大量消耗营养物质，添加过 少达不到发酵效果。
[0016] 所述落缸搭窝为米饭中加入麦曲、发酵剂和水后，在发酵缸内搭成凹形窝。
[0017] 所述糖化温度可以为25-30°C，糖化时间为4-6天;优选地，所述糖化温度为25°C， 糖化时间为5天。利于麦曲中霉菌进行糖化过程。
[0018] 所述发酵温度可以为16-20 °C，发酵时间为24-26天;优选地，所述发酵温度为18 °C，发酵时间为25天。利于发酵剂的发酵作用。
[0019] 所述后处理包括榨酒、澄清、煎酒。
[0020] 所述煎酒温度为85-90°(：，煎酒时间为25-351^11。
[0021]本发明以转录抑制因子DalSOp为调控靶标，采用敲除了 DAL80基因的酿酒酵母部 分或全部替换传统发酵剂酒药进行黄酒酿造，具有如下有益效果：
[0022] (1)采用敲除了DAL80基因的酿酒酵母对黄酒进行发酵，能降低尿素的积累，从而 有效抑制氨基甲酸乙酯的形成；
[0023] (2)该方法受酒品种、发酵条件、发酵液抑制因子等的影响较小，并且对成品酒的 酒精度、风味物质和氨基酸组成影响不大，能有效解决目前其它降低黄酒氨基甲酸乙酯方 法所存在的弊端。
【附图说明】
[0024]图1为本发明实施例3中Dal80p纯化蛋白的电泳图。
[0025] 图2为本发明实施例3中EMSA结合反应电泳图。
[0026] 图3为本发明实施例4中DAL80敲除菌替代酒药进行发酵时尿素浓度变化趋势。 [0027]图4为本发明实施例4中DAL80敲除菌替代酒药进行发酵时氨基甲酸乙酯浓度变化 趋势。
[0028] 图5为本发明实施例4中DAL80敲除菌替代酒药进行发酵产品中风味物质的测定。
[0029] 图6为本发明实施例4中DAL80敲除菌替代酒药进行发酵产品中氨基酸组成的测 定。
【具体实施方式】
[0030] 为更好理解本发明，下面结合实施例来阐释本发明。下述实施例中所用的材料、试 剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031] 以下实施例中：
[0032] BY4741代表酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)YSC1048，购于通用电气医疗 集团生命科学部（GE Healthcare Life Sciences)，菌株编号YSC1048，Yeast Parental Strain BY4741,glycerol stock；
[0033] DAL80 Δ代表酿酒酵母DAL80敲除菌，具体为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)YSC6273-201937947,购于通用电气医疗集团生命科学部（GE Healthcare Life Sciences)，菌株编号YSC6273-201937947，Yeast MATa Knock Out Strain YKR034W (Cloneld:7047)。
[0034] 实施例1转录组分析筛选潜在的氨基甲酸乙酯抑制因子
[0035] 低浓度氮源选择性合成培养基（SDl) :1.7% (w/v)酵母无氨基酸无硫酸铵氮源 (YNB)，2% (w/v)葡萄糖，2mM硫酸铵，20mM精氨酸盐酸盐。
[0036] 高浓度氮源选择性合成培养基（SD3) :1.7% (w/v)酵母无氨基酸无硫酸铵氮源 (YNB)，2% (w/v)葡萄糖，40mM硫酸铵，20mM精氨酸盐酸盐。
[0037] (1)细胞培养与RNA提取
[0038]将本实验室从黄酒体系中分离的野生型酵母细胞分别接种于SD1、SD3培养基中， 培养12h后离心收集细胞，用TRIZOL法提取酵母总RNA，其中提取过程用到的研磨具、枪头及 离心管均用DEPC水处理过夜，并且操作过程带口罩和手套，提取过程迅速，降低提取过程中 RNA的损失。
[0039]提取的RNA样品保存在-80 °C冰箱，并取少量用于Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳检测 RNA样品的浓度、纯度及完整性。
[0040] (2)构建文库并上机测序
[0041 ] RNA样品上机前的处理具体为:纯化并片段化mRNA，获得155bp左右的片段;合成双 链cDNA; DNA双末端修复;3 '端引入"A"碱基;连接接头;纯化连接产物；富集DNA片段;验证文 库;均一化并混合文库;上机测序。
[0042] (3)转录组生物信息分析
[0043] 首先原始数据序列经过质量分析去除低质量序列和接头序列后，得到可供 进行后续分析的序列。数据过滤标准为：1、去除Reads接头序列；2、从Reads 3 '端向5 ' 端去掉平均质量小于Q20的部分（5bp窗口）； 3、去除最终长度小于50bp的序列；4、 序列中没有不确定碱基。原始数据通过质量过滤后，我们通过FastQC (http:// www. bio informat i cs · babraham. ac .uk/project s/fastqc/)进行质量过滤质控分析，过滤 后的序列信息通过分析软件:bowtie2/tophat2http: //tophat · cbcb · umd · edu/进行比对， 其中参照基因组为（http: //www · yeastgenome · org/download-data/sequence)。每个基因 在样本中的表达量用RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)值表不，具体计算 方法如下：
[0044]
[0045] 其中表达差异基因通过DESeq分析http : //wwwhuber · embl .de/users/anders/ DESeq，最后按照表达量倍数差异和表达差异显著性p-value筛选出差异基因。表达差异GO (Gene Ontology)富集分析和表达差异K0(KEGG orthology)分析分别通过SGD网站和 http: //www. genome · jp/kegg/tool/map_pathway2 ·html来分析。
[0046] 众所周知，酿酒酵母氮代谢抑制调控机制主要是通过GATA家族四个转录因子 (0&180?，6 2€3?/附12?，6&七1?/附11?和61113?)起调控作用。在实施例1中，四个转录调控因 子中仅有DAL80的转录水平在低氮组中均显著提高，其中在低氮组vs高氮组中，log2(差异 倍数)为7.59,另外结合实施例1中脲酶编码基因在低氮水平下转录水平比高氮水平下高， 以及报道中DalSOp在氮阻遏条件下起转录抑制作用，我们推测，低氮水平下，脲酶转录水平 的抑制是受Dal80p的调控。该推测结论在实施例3中进行验证。
[0047] 实施例2构建Dal80p表达菌株并纯化蛋白
[0048] DAL80在NCBI中的ID为：853904。能够表达Dal80p蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)的构 建方法为:构建含有DAL80基因 、Hi s标签和SUMO标签的融合片段，将融合片段连接到表达载 体PET-28中NcoI和Xho頂每切位点之间，以及将构建的载体进行转化、筛选、诱导表达等步 骤。
[0049] 1、构建Dal80p表达菌株
[0050] 根据酿酒酵母S288c中DAL80基因序列，采用primer 5.0设计上下游引物，并根据 同源重组试剂盒要求及载体与融合蛋白序列分别在5'和3'引入15bp左右同源重组序列，弓丨 物序列如下表：
[0056]琼脂糖凝胶电泳鉴定并胶回收PCR产物。
[0057]将纯化的目的基因片段、融合标签片段及载体用Nano Drop 2000进行浓度测定， 按照Cl〇nE?cpress?MultiS One Step Cloning Kit试剂盒说明书进行重组。
[0058] 重组反应体系为：
[0060]将重组好的质粒直接转化大肠杆菌BL21(DE3)，在培养过夜的平板上挑取转化子， 并转接到含有Kana抗生素的液体LB培养基中，于37°C，220rpm条件下培养3-4h，分别从每管 中取出200yL保存在4°C。剩余菌液中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度ImM继 续培养3h，取40yL菌液并加入IOyL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)，煮沸lOmin，并进行聚丙 烯酰胺凝胶电泳，其中未加 IPTG的菌液作为阴性对照。对比蛋白Marker及阴性对照，筛选出 有蛋白表达的目标菌株。并进行测序。
[0061 ] 2、纯化蛋白 Dal80p
[0062] 将筛选到的表达Dal80蛋白的阳性转化子保存液转接到20mL含有Kana抗生素的液 体LB培养基中，于37°C、220rpm条件下培养至OD值为0.3-0.4，将培养液转接至IL含有Kana 抗生素的液体LB培养基中，于37 °C、220rpm条件下培养至OD值为0.4左右，加入IPTG至终浓 度ImM，并降低培养温度至18°C，继续培养18h后，于4°C，5000g离心20min收集菌体，去掉上 清液，加入40mL非变性裂解液，并加入含PMSF(苯甲基磺酰氟)至终浓度为I mM。放置冰上超 声破碎20min，4°C，10000g离心30min，将上清液转移到新的管子中，保存在冰上。
[0063] 将BeyoGoldTM His-tag Purification Resin填充到亲和层析空柱管中，用30mL 双蒸水冲洗柱子，采用30mL非变性裂解液平衡Ni柱，采用流动栗缓慢上样，上样结束后，用 IOOmL非变性洗涤液冲洗Ni柱，最后用50mL含有50mM咪唑的缓冲液分管(每管IOmL)收集洗 脱样品，每管样品中取40yL并加入IOyL蛋白上样缓冲液，煮沸IOmin，加样至SDS-PAGE预制 胶中，连接电泳装置，并加入IX SDS-PAGE电泳缓冲液，200v条件下，电泳30min。洗脱后的Ni 柱先用IOOmL 1 % SDS溶液冲洗，然后用IOOmL双蒸水冲洗。电泳结束后，对胶片进行染色以 及脱色。
[0064] 将含有目的蛋白的洗脱液转移到IOkDa的透析袋中，并放到IL透析液中，于4°C透 析4h以上，将透析袋和其中的蛋白转移到新的透析液继续透析，共透析3遍去除其中的咪 唑。
[0065] 将透析过的蛋白加入适量SUMO蛋白酶及IOX SUMO缓冲液，4°C酶切过夜，将Ni柱先 用IOOmL透析液平衡，然后将酶切液加入到Ni柱中并密封，4 °C摇晃30min，将Ni柱打开，收集 未结合的蛋白。并用IOOmL 1%SDS溶液和IOOmL双蒸水冲洗Ni柱。
[0066]将收集的未结合蛋白加入适量的含有His-Tag的核酸酶4 °C酶切过夜，将酶切液加 入到Ni柱中并密封，4°C摇晃30min，将Ni柱打开，收集未结合的蛋白，重复结合Ni柱并收集 未结合蛋白。将收集的蛋白用SDS-PAGE电泳鉴定，用IOkDa超滤管浓缩样品至ImL左右，分管 (每管20yL)保存在-80°C。
[0067] 实施例3EMSA试验验证Da 180p对脲酶的降解作用 [0068] 1、核酸退火处理及EMSA结合反应
[0069]分别合成CARl和DURl，2的预测结合区域的互补核苷酸序列，按照合适的浓度溶解 于TEN缓冲液（lOmmol/L Tris，l mmol/L EDTA，0 · lmol/L NaCl，pH8 · 0)中，互补的核酸序列 按照1:1的比例混合，用PCR仪器按照如下程序退火处理。
[0075] 将结合反应溶液混匀后，25°C条件下孵育30min。
[0076] 2、非变性凝胶电泳：
[0077] 1)结合反应液加 3yL 50%甘油混合均匀上样，用0.5X TBE作为电泳缓冲液，在多 余的空中，分别加入核酸marker和蛋白上样缓冲液。
[0078] 2)整个电泳由于发热，在冰上进行，电泳至胶的下缘1/4处，停止电泳。
[0079] 3)泡染:将native胶取下，水洗两遍，放至20-30yL核酸染料每IOOyL TBE缓冲液中 染色半小时，然后在双蒸水中脱色30min。
[0080] 4)在紫外条件下观察胶并拍照保存。
[0081] 在实例3中，DURl，2和CARl启动子结合区域的互补核酸序列如下表所示。
[0083]其中下划线标注的碱基为DalSOp可能的结合位点
[0084] 蛋白纯化过程获得的Dal80p与SUM0、His-tag融合蛋白，以及添加 SUMO蛋白酶获得 的Da 180p蛋白见附图1中A和B所示。
[0085] 不同纯化水平的Dal80p与DURl，2的结合水平如附图2中A所示。去除SUMO标签蛋 白、去除核酸的Dal80p分别与DURl，2，CAR1的结合水平如附图2中B所示。
[0086] EMSA结果表明Dal80p对DURl，2启动子区域的结合能力比较强，对CARl启动子区域 的结合能力较弱。说明DalSOp对尿素降解酶有转录抑制作用，而对精氨酸酶的调控作用不 强。敲除DAL80有利于脲酶活性提高，对精氨酸酶活性影响不大。
[0087] 实施例4应用DAL80 Δ进行酿造试验并检测酿造产品中氨基甲酸乙酯降低水平 [0088] 1、菌粉制备
[0089]将BY4741或DAL80 Δ培养至对数生长期，离心收集菌体，冷冻干燥得到菌粉，保存 至 4。。。
[0090] 2、黄酒酿造
[0091]以0.5kg糯米为原料，于28°C下浸米2天，加水量为0.6L;蒸饭后摊开，淋水，冷却， 使米饭的品温保持在30 °C左右;加入90g麦曲和Ig发酵剂及0.6L水，搅拌均匀，落缸搭窝；放 置在25°C恒温箱开始糖化作用，5天后调节温度至18°C进行发酵作用，期间每隔10天取样 I OOmL冻存于-80°C冰箱;发酵25天后取样，进行榨酒、澄清、煎酒，避光4 °C保存。
[0092] 其中，设置不同处理组，发酵剂中酒药及酵母添加量如下表所示。
[0094] 3、尿素浓度测定方法
[0095]柱前衍生：分别配制终浓度为1.5mol/L的盐酸和0.02mol/L的9-羟基吨溶液作为 衍生试剂，取ImL发酵液作为样品，样品及衍生试剂均需经0.22μπι滤头进行过滤。
[0096]流动相:Α相为0.02Μ乙酸钠溶液，B相为乙腈。洗脱梯度如下表所示。
[0098] 控制柱温在35°C并进行荧光检测（213nm，308nm)〇
[0099] 4、氨基甲酸乙酯测定方法
[0100] 样品前处理：取50mL黄酒样品与50mL乙酸乙酯混合均匀并萃取氨基甲酸乙酯，将 萃取后的液体置于真空旋转蒸发仪中进行浓缩，蒸干后用5mL 30%甲醇溶解，样品中氨基 甲酸乙酯浓度浓缩至原来样品的10倍。柱前衍生:配制1.5mol/L盐酸和0.Olmo VL占吨醇/ 正丙醇溶液备用，取ImL标样或浓缩样品，加入0.1 mL盐酸和0.2mL占吨醇溶液混合均匀，室 温避光放置30min，经0.22μηι滤头进行过滤，进样。
[0101] 色谱条件：色谱柱为C18反相柱（250mm X 4.6mm，4μπι)，进样量为20μ1，激发波长为 233nm，发射波长为600nm，洗脱程序如下表，A为甲醇，B为水。
[0103] 5、风味物质检测
[0104] 萃取头准备：萃取头（SPME Fiber Assembly，50/30ym，24Ga，自动进样针）在第一 次使用前，先在气相色谱口 270°C条件下活化1小时，以后每次使用前活化30min。
[0105] 样品处理:将4mL酒样和Ig Nacl加入顶空瓶中，旋紧盖子并密封。加热至50°C搅拌 并充分吸附，将萃取头插入顶空瓶中50°C保持30min。
[0106] GC-MS分析:色谱条件:载气为氦气，流速为lmL/min，采用无分流进样;程序升温： 初始柱温40 °C，保持5min，以5°C/mL的速率升温至230°C，保持IOmin。进样口温度为250 °C， GC解析时间2.5min。
[0107] 质谱条件：电子轰击离子源(EI)，电子能量为70eV，离子源温度为200°C，接口温度 为250°C，检测口电压为350v。扫描方式为全扫描，质量范围为35-350。
[0108] 6、游离氨基酸含量测定
[0109]对糖化、发酵30天并煎酒后的4组发酵黄酒采用日本日立L-8900氨基酸分析仪进 行游离氨基酸的检测(天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨 酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸），检测原理为 采用茚三酮作为衍生剂与氨基酸发生衍生，经检测器进行检测分析。样品前处理方法为:精 确量取IOmL样品，加0. lmol/L盐酸溶液超声波振荡5min，加5%磺酸水杨酸5mL去除蛋白，在 13000转/分钟，4°C离心10min，取上清液，氮吹仪浓缩赶酸，加0.02mol/L盐酸2mL，旋涡振 荡，过0 · 22μηι孔径水膜，上机。
[0110] DAL80敲除菌替代酒药进行发酵时尿素浓度变化趋势见附图3所示。结果表明， DAL80敲除菌发酵组中尿素浓度均比酒药发酵组和ΒΥ4741发酵组中尿素浓度低。
[0111] DAL80敲除菌替代酒药进行发酵时氨基甲酸乙酯浓度变化趋势见附图4所示。在发 酵30d左右DAL80敲除菌发酵组中氨基甲酸乙酯的浓度明显比酒药发酵组低，其中DAL80敲 除菌部分替代或者完全替代酒药发酵时，氨基甲酸乙酯浓度分别降低19.6%和38.5%。 [0112] DAL80敲除菌替代酒药进行发酵产品中风味物质的测定结果见附图5,结果表明， DAL80敲除菌替代酒药进行发酵时，发酵产品中主要风味物质组成成分差异不大，包括乳 酸、乙酸、异戊醇、苯乙醇、十六酸乙酯、癸酸乙酯等。各组成成分的含量差异不大。
[0113] DAL80敲除菌替代酒药进行发酵产品中氨基酸组成的测定结果见附图6,结果表 明，DAL80敲除菌替代酒药进行发酵时，发酵产品中十种主要氨基酸的含量差异不大。
[0114]综合上述研究结果，DAL80敲除菌完全替代酒药进行发酵时，糖化、发酵30天后酿 造产品中氨基甲酸乙酯比酒药发酵组降低38.5%。同时利用DAL80敲除菌完全替代酒药进 行酿造对风味物质和氨基酸组成影响不大。
【主权项】
1. 一种基于DalSOp为靶标抑制氨基甲酸乙酯形成的黄酒酿造方法，包括浸米、蒸饭、淋 水、加麦曲加发酵剂加水、拌匀、落缸搭窝、糖化、发酵和后处理，其特征在于:所述发酵剂中 含有敲除了 DAL80基因的酿酒酵母菌粉。2. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于:所述浸米时，以每千克米计，水的用 量为 1.0-1.5L。3. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于:所述浸米温度为25-30Γ，浸米时间 为1_3天。4. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于:所述敲除了DAL80基因的酿酒酵母 菌粉为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)YSC6273_201937947菌粉。5. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于：所述发酵剂为酿酒酵母YSC6273-201937947菌粉和酒药的混合物。6. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于：所述发酵剂为酿酒酵母YSC6273-201937947 菌粉。7. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于：以每千克米计，所述麦曲的加入量 为60-200g，发酵剂的加入量为l-5g，水的加入量为1.0-1.5L。8. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于:所述糖化温度为25-30Γ，糖化时间 为4-6天。9. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于:所述发酵温度为16-20°C，发酵时间 为24-26天。10. 如权利要求1所述的黄酒酿造方法，其特征在于:所述后处理包括榨酒、澄清、煎酒。
【文档编号】C12G3/02GK105861221SQ201610367465
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】陈启和, 焦志华, 周万怡
【申请人】浙江大学