专利名称：药物羊膜及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医疗用材料及其制备方法，具体地说，是药物羊膜及其制备方法。
背景技术：
羊膜是指人类胎盘的基底膜层，是无血管、无细胞结构的胶原组织层。羊膜上皮细胞能分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EFG)等多种活性细胞生长因子，易使上皮细胞移行长入，促进上皮细胞分化、增殖，在创伤愈合中起重要作用。此外，作为一种有活性的生物材料，羊膜具有很好的柔软性和生物相容性。因此，目前羊膜在临床上已广泛应用于外科、烧伤科、眼科等创伤修复领域。
目前临床上所用羊膜多为新鲜羊膜，或采用深低温(-80℃)保存的羊膜。新鲜羊膜具有生物活性，临床疗效好，但制好后需24小时内使用，不能长期保存，因此往往不能保证临床急需。深低温保存的羊膜虽然可较长时间的保存，但细胞活性较新鲜羊膜有明显的降低。
ZL03150838.3号中国专利公开一冷冻干燥保存羊膜的方法，将羊膜在0.1-10％的甘油保护下，采用冷冻干燥工艺，将物料置工作室经0℃～-30℃预冻1-2小时，开启冷凝室制冷，使冷阱温度达-35℃～-45℃时开启真空泵，真空冷冻3-8小时。冷冻干燥法保存处理的羊膜虽可在常温下长期保存，但细胞结构已破坏，不再具有分泌细胞生长因子的功能，仅仅起着基底膜的作用，临床疗效较差。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种可长期保存并具良好生物活性的药物羊膜。
本发明的另一目的是提供一种制备可长期保存并具良好生物活性的药物羊膜的方法。
为实现上述目的，本发明提供的药物羊膜由新鲜胎盘的羊膜制得，其含有一种或一种以上的外源性细胞生长因子。
所谓外源性细胞生长因子是相对于羊膜自身分泌的细胞生长因子而言，指后来添加到羊膜中的的主要由基因工程方法或生化提取方法制得的细胞生长因子，添加了外源性细胞生长因子的羊膜的优点在于既可长期保存又具有良好的生物活性。
由以上方案可见，本发明的关键技术手段是使临床使用时的羊膜成为含有外源性细胞生长因子的药物羊膜，这种药物羊膜即使在制备或保存过程中失去自身分泌细胞生长因子的功能，但其所添加的外源性细胞生长因子在低温保存或冷冻干燥过程中不会失去生物活性，因此药物羊膜在临床使用时仍可将吸收的外源性细胞生长因子缓释到创面，发挥促进创伤愈合的作用。
较具体的技术方案是外源性细胞生长因子采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、角质细胞生长因子(KGF)中的任意一种或几种或全部。
上述外源性细胞生长因子添加到羊膜中，有利于保护羊膜上皮细胞自身分泌细胞生长因子的功能，从而使羊膜在长期保存过程中自身仍然能保持良好的生物活性。
本发明还提供一种上述药物羊膜的制备方法，即先将新鲜胎盘的羊膜与绒毛膜剥离；再将得到的羊膜浸没于含0.01-10000IU/ml细胞生长因子的保存液中，然后置于深低温环境进行冷冻保存。经该方法制备的药物羊膜，因在保存液中含有外源性细胞生长因子，不但可长期保存，而且羊膜自身也仍然能保持良好的生物活性。
另一种制备方法是先将新鲜胎盘的羊膜与绒毛膜剥离；再将得到的羊膜浸没于含0.01-10000IU/ml外源性细胞生长因子的保存液中，然后进行冷冻干燥。
更好的方案是先将新鲜胎盘的羊膜与绒毛膜剥离；再将得到的羊膜浸没于含0.01-10000IU/ml外源性细胞生长因子的保存液中，冷冻干燥，干燥后二次浸没于含有0.01-10000IU/ml外源性细胞生长因子的保存液中，后再进行二次冷冻干燥。这种二次冷冻干燥的方法有利于羊膜更充分的吸收外源性细胞生长因子。
经上述冷冻干燥方法制备的药物羊膜呈冻干状，密封包装后，在常温下即可长期保存又具有良好的生物活性，便于储存、运输及医院临床使用。
更好的方案是把羊膜从胎盘上剥离后，首先分割成适当大小的植片，这样可将最终制得的药物羊膜植片每片单独包装，临床使用时，每次只取需要量的药物羊膜植片，使用方便且可避免浪费。
具体实施例方式
本发明药物羊膜中含有的外源性细胞生长因子可以是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)及角质细胞生长因子(KGF)。这类外源性细胞生长因子可以用基因工程方法或生化提取方法制取，也可在市场上购买成品。目前，申请人即有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的成品供应。
药物羊膜中含有的外源性细胞生长因子，一方面有利于保护羊膜在保存过程中维持其自身分泌细胞生长因子的生物活性；另一方面，这些外源性细胞生长因子在临床使用时，也会缓慢释放到创面上，发挥促进创面愈合的作用。
以下通过具体实施例详细介绍含有外源性细胞生长因子的药物羊膜制备方法。以下所涉细胞生长因子，如不做特别说明，均指外源性细胞生长因子。
实施例一取健康剖宫产产妇的胎盘组织，用含有50ug/ml青霉素、50ug/ml链霉素、100ug/ml新霉素和2.5ug/ml两性霉素B的平衡盐液(BSS)反复冲洗以去除胎盘表面的凝血块，浸泡5-10分钟后小心剥离出完整的羊膜。健康剖宫产产妇是按照国家相关标准进行判断，主要是指产前血清学检查排除乙肝、丙肝、梅毒及获得性免疫缺陷综合症的产妇。
将获得的羊膜浸没于含有细胞生长因子浓度为0.01-10000IU/ml的保存液中，使羊膜充分吸收保存液，成为含有细胞生长因子的药物羊膜，然后置于-80℃深低温冰箱中冷冻保存。使用前取出，置于4℃冰箱中解冻后，即可供临床使用。
本实施例中含有细胞生长因子浓度为0.01-10000IU/ml的保存液是通过向DMEM甘油液中加入细胞生长因子原液配制而成。表一例举了几组含细胞生长因子的保存液组成表一每100ml保存液组成成分
实施例二本实施例中羊膜的冲洗、剥离方法与实施例一相同，在此不再赘述。不同之处在于羊膜被放入含有细胞生长因子浓度为0.01-10000IU/ml的保存液中后，需进行冷冻干燥3-8小时。这样制得的药物羊膜为冻干状，可于阴凉干燥处长期保存，且运输方便。使用前将冻干状的药物羊膜置于与前述保存液所含细胞生长因子的种类和浓度相同的DMEM甘油液中浸泡复苏，即可供临床使用。
本实施例中含有细胞生长因子浓度为0.01-10000IU/ml的保存液是通过向0.01-10％(体积百分比)甘油液中加入细胞生长因子原液配制而成。表二例举了几组含细胞生长因子浓度为0.01-10000IU/ml的保存液组成表二每100ml保存液组成成分
实施例三本实施例中羊膜的冲洗、剥离的方法均与实施例一相同，在此不再赘述。不同之处在于羊膜被放入含有细胞生长因子浓度为0.01-10000IU/ml的保存液中后，先冷冻干燥约3小时，然后再重新用上述保存液浸泡，使羊膜充分吸收细胞生长因子后再进行二次冷冻干燥约3-8小时。其中保存液的组成及配制方法可参照实施例一或二。
这样制得的药物羊膜为冻干状，可于阴凉干燥处长期保存，运输、储存均较方便。使用前将冻干状的药物羊膜置于与前述保存液所含细胞生长因子的种类和浓度相同的DMEM甘油液中浸泡复苏，即可供临床使用。
上述方法经过两次冷冻干燥过程，使羊膜吸收细胞生长因子更为充分，更有利于临床使用。
实施例四因为临床使用时每次只需创面大小的羊膜，极少一次需要整个羊膜。而整个药物羊膜从深低温冰箱中取出解冻后，如不能全部使用，会造成浪费。为此，可将从新鲜胎盘上完整剥离的羊膜上皮面朝上平铺于硝酸纤维素滤纸上，首先分割成适当大小的植片，放入含有细胞生长因子浓度为0.01-10000IU/ml的保存液中浸泡，使植片充分吸收保存液成为含有细胞生长因子的药物羊膜，之后再分装于含细胞生长因子浓度为0.02-10000IU/ml的保存液的小瓶中，每瓶一片，置于-80℃深低温冰箱中冷冻保存。本实施例中保存液的组成及配制方法可参照实施例一或二。
本实施例中羊膜植片的大小可根据临床使用习惯确定不同规格，如用于创伤及烧伤的羊膜植片可以大一些，用于眼科的羊膜植片可以相对小一些，通常可为3cm×4cm大小的长方形。这样，一个完整的羊膜可制备多片药物羊膜，在临床使用时，每次可只从深低温冰箱中取出需要量的药物羊膜，在4℃冰箱中解冻后直接使用，不但使用更为方便，且可避免无谓的浪费。
实施例五本实施例与实施例四基本相同，不同之处在于羊膜被分割成适当大小植片后，先被放入含有细胞生长因子浓度为0.01-10000IU/ml的保存液中浸泡，后进行冷冻干燥3-8小时。本实施例中保存液的组成及配制可参照实施例一或二。
经这样处理的药物羊膜为冻干状，每片药物羊膜可独立包装。使用时，可先将冻干状的药物羊膜置于与前述保存液所含细胞生长因子的种类和浓度相同的DMEM甘油液中浸泡复苏后，即可供临床使用。
在参考一些优选的实施例描述本发明时，本领域的技术人员会意识到在不偏离本发明精神原则下，可能会做出各种不同的修改、变化、省略和取代。例如，上述例中一次冷冻干燥及二次冷冻干燥的时间并不囿于实施例中给出的范围，只要它们所取得的效果是相同的，这些简单的变化仍属本发明的保护范围。
权利要求
1.药物羊膜，由新鲜胎盘的羊膜制得，其特征在于含有一种或一种以上外源性细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的药物羊膜，其特征在于所述外源性细胞生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)和角质细胞生长因子(KGF)。
3.根据权利要求1所述药物羊膜的制备方法，包括如下步骤将新鲜胎盘的羊膜与绒毛膜剥离；将得到的羊膜浸没于含0.01-10000IU/ml细胞生长因子的保存液中；置于深低温环境进行冷冻保存。
4.根据权利要求3所述药物羊膜的制备方法，其特征在于所述深低温环境的温度控制在-80℃。
5.根据权利要求3所述药物羊膜的制备方法，其特征在于所述保存液为DMEM与甘油液体积比为1∶1的混合液。
6.根据权利要求1所述药物羊膜的制备方法，包括如下步骤将新鲜胎盘的羊膜与绒毛膜剥离；将得到的羊膜浸没于含0.01-10000IU/ml细胞生长因子的保存液中；进行冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述药物羊膜的制备方法，包括如下步骤将新鲜胎盘的羊膜与绒毛膜剥离；将得到的羊膜浸没于含0.01-10000IU/ml细胞生长因子的保存液中；进行冷冻干燥；将冷冻干燥后的羊膜第二次浸没于含0.01-10000IU/ml细胞生长因子的保存液中；二次冷冻干燥。
8.根据权利要求6或7所述药物羊膜制备方法，其特征在于所述保存液为0.01-10％(体积百分比)甘油液。
9.根据权利要求3至7任一项权利要求所述药物羊膜制备方法，其特征在于所述羊膜从胎盘上剥离后，首先被分割成适当大小的植片。
10.根据权利要求3至7任一项所述药物羊膜的制备方法，其特征在于所述保存液中加入的细胞生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)和角质细胞生长因子(KGF)。
全文摘要
本发明公开了一种药物羊膜及其制备方法，药物羊膜含有外源性细胞生长因子，其制备方法是通过将羊膜浸没于含有外源性细胞生长因子的保存液中，经深低温冷冻保存或冷冻干燥制得。不但可以使羊膜在长期保存后具有生物活性，而且还可在使用时将从保存液中吸收的外源性细胞生长因子缓释到创面上，有利于创伤愈合。
文档编号A01N1/02GK101040616SQ20061007137
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月24日 优先权日2006年3月24日
发明者方海洲, 陈咏, 郑赞顺, 李海才 申请人:珠海亿胜生物制药有限公司