专利名称：利用dreb2b基因培育耐旱甘蔗品种的方法
利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗品种的方法 技术领域 本发明涉及一种运用基因工程技术培育甘蔗品种的方 法，特别是利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗品种的方法，属于植物基因工 程技术领域。
背景技术：
甘蔗是我国乃至全世界最重要的糖料作物，也是理想 的可再生能源作物和转基因安全植物。我国甘蔗85%以上种植在丘陵旱 地，千旱成为制约我国甘蔗产业发展的主要限制因素。因此抗旱优质高 产甘蔗新品种的设计、选育和推广具有广泛的前景。
二十世纪九十年代初，国内外开始从事抗非生物胁迫基因的研究， 抗逆转基因的研究取得了很大进展，如将编码胆碱脱氢酶基因^e"转化 到烟草和马铃薯中，获得了抗盐和耐低温的转基因材料(Lilius et al,1996);通过转基因手段增加烟草中甜菜碱的含量，可明显提高烟草对 盐和寒冷胁迫的忍耐能力(Nakamuraetal.， 1997);将烟草的Mn-SOD基 因转入M. saliva中，使M. saliva在干旱胁迫下的产量和存活率都有提高 (McKersie et al., 1999)。但植物的抗逆性往往是由多基因控制的数量性 状，植物对干早、高盐及低温抗性的强弱往往不取决于某单一基因，而 是受许多基因的共同调控。抗旱信号关键因子可以调控许多相关功能基 因的表达(刘强，2000)，因此，通过增强某些抗旱信号关键因子的作用 可使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良，与导入或改良个别功能 基因提高某种抗性的传统方法相比，导入抗旱信号因子基因将是提高作 物抗逆性的更为有效的方法和途径。
DREB转录因子(Dehydration responsive element binding protein )是一 种特异性的转录因子，当植物在高盐、低温及干旱逆境胁迫下，DREB 转录因子被诱导表达，然后与DRE元件特异结合，启动下游与抗逆性相 关的功能基因表达，调节植物体内各种生理生化反应，最终使植物对环 境胁迫的抗逆性得以提高。DREB转录因子可以激活具有DRE顺式作用 元件的一系列抗性基因，如W2^4, cw!5a、 m^)、 h'"7、 W〃、 W22等。 这些基因的表达产物在植物抗逆反应中发挥着不同的功能，从而使植株 的抗逆性获得提高(Jaglo-ottosen等，1998; Liu等，1998; Gilmour等，2000; Jaglo-Ottosen等，2001; Park等，2001; Dubouzet等，2003; Kasuga等，2004)。因此，DREB在植物的逆境应答过程中充当"总开 关"的角色 一个转录因子的过量表达可以促使多个功能基因发挥作用， 使植株耐逆性得到综合改良。抗逆相关转录因子DREB与细胞发育 (Drews, 1991 )、激素(Ohme, 1995)、抗病(Zhou, 1997)、抗低温(Kasuga, 1999)以及干旱、高盐(Liu, 1998)等信号传递有关，在各种基因表达 中起重要调控作用。自Stockinger (1997)通过农杆菌转化法把DREB基 因导入拟南芥中，现已获得许多抗逆转DREB基因植物。
申请号为200710008719.X的发明专利"利用p肌'基因快速获得转基 因甘蔗的方法"，介绍了一种通过构建含p啦'基因的植物表达载体，利用 甘露糖作为选择剂、氯酚红法快速检测抗性植株获得转基因植物的方法。
本发明就是针对以上背景技术，通过构建含"y&^^基因的植物表达载
体，利用基因枪转导的方法，通过潮霉素(/7_ygram_y"'")或甘露糖筛选以 及快速、高效的转基因检测技术，大幅度提高甘蔗抗旱育种效率，为甘蔗 抗旱品种的培育奠定良好技术基础
发明内容
本发明的目的是提供一种利用"/ ^H2^基因培育抗旱甘 蔗品种的方法。所解决的技术问题是一种利用转基因技术改良甘蔗抗旱的 方法。具体地说，利用具有潮霉素或磷酸甘露糖异构酶筛选标记的载体， 构建含有zw^s怨基因的植物表达载体，利用基因枪转导将其插入到甘蔗 品种福农95-1702的基因组中，经过转基因筛选体系以及分子检测技术获 得抗性转基因甘蔗。
本发明利用"v fiS^堪因培育抗旱甘蔗品种的方法，包括含有/^5S2^ 因的植物表达载体的构建、抗旱转/^￡^2 因材料的培育以及抗旱转基因 甘蔗新材料的筛选鉴定，其特征在于包括以下步骤
1、 构建植物表达载体，所述植物表达载体为pRD29A-DREB-Hyg和 pRD29A-DREB-pmi;所述的pRD29A-DREB-Hyg是以/^E^幼目的基因，W/^划 为启动子，T^s-7^7州为终止子，场^为筛选标记基因的植物表达载体；所 述的pRD29A-DREB-pmi是以/W^fiS2^为目的基因，巡K划为启动子，Mw-尸o/;;J 为终止子，pm/为筛选标记基因的植物表达载体；
2、 通过基因枪转导的方法把上述的含有pRD29A-DREB-Hyg和 pRD29A-DREB-pmi的载体转入甘蔗外植体中；3、 经过在含潮霉素或甘露糖的培养基中继代、分化、生根获得抗性
植株；所述含有潮霉素或甘露糖的培养基，即分别在继代培养基、分化培 养基和生根培养基中添加10 50g.L—'潮霉素，或者添加20 70% (w/v) 的甘露糖替代蔗糖；所述继代培养基成分为MS+2,4-D2.0mg'L"，调节 pH5.8;所述分化培养基成分为MS+6-BA1.0mg丄"+NAA0.1 mg'L—'+KT 2.0 mg丄"+蔗糖30g丄"+琼脂7 g丄—1 ，调节pH5.8;所述促根培养基成分为 1/2MS+NAA3.0 mg.L"+6-BA 0.1 mg.L"+蔗糖40 g丄"，调节pH5.8。
4、 通过PCR、 southern dot-blotting检测获得转ZW朋2感因的甘蔗植株。 根据上述培育方法获得的转DREB2B基因抗旱品种，其抗旱性、光合
能力、产量、糖份都优于甘蔗受体品种福农95 — 1702及其组培后代。已获 得的转DREB2B基因甘蔗品种分别为DR4、 DR13、 DR!5和DR44。
本发明的转基因甘蔗品种具有以下优点甘蔗在干旱胁迫下诱导抗旱 基因的表达，其抗旱性明显优于受体品种，而且不同无性世代间基本保持 稳定；在干旱条件下，生长快于受体品种，株高增加20%以上，有效茎数 增加30%以上，每公顷蔗茎产量增加30%，甘蔗糖份(绝对值)提高1. 5% 以上。
具体实施方式
实施例是为了更详细地解释本发明利用">^^^ 因 培育耐旱甘蔗品种的方法，但本发明不局限于此。 本发明所用的主要仪器设备
(1) AB204N电子分析天平瑞士梅特勒公司；
(2) EPS 301电泳仪安发玛西亚公司；
(3) Ultrospec 2100型核酸蛋白测定仪瑞典APBiotech公司；
(4) 生物安全柜上海力新有限公司；
(5) 基因枪(PDS-1000He):美国Bio-Rad公司；
(6) Master Cyclergradient 96 PCR仪德国Eppendorf公司；
(7) BIO-PROFIL凝胶成像及分析系统法国VL公司；
(8) Model 400型杂交箱美国的Robbin公司；
(9) UVC500紫外交联仪美国Hoefer公司；
(10) 5810 R型台式高速冷冻离心机德国Eppendorf公司；
(11) RC-5C PLUS落地式高速冷冻离心机美国Kendro公司；
(12) 真空离心浓縮系统德国Eppendorf公司。常用内切酶和试剂盒
限制性内切酶、Access RT-PCR System试剂盒购自Promega公司； M-MLV逆转录酶、Trizol试剂盒购自Gibico-BRL公司； Southern杂交试剂盒购自Clontech公司；
PCR片段回收试剂盒、Ex Tag DNA聚合酶购自宝生物(大连)公司； 引物、测序工作由上海生物生工工程有限公司完成。 常用化学试剂
尼龙膜购自Millipore公司； RNaseA购自北京华美生物工程公司； CaCl2 2H2O(C-7902)、亚精胺(S-0266)购自Sigma公司 IPTG、 X-Gal、等购自宝生物工程(大连)有限公司； 潮霉素、甘露糖等抗生素购自北京欣经科生物技术有限公司； DNAMarker、 dNTPs混合物、DEPC购自上海生物工程有限公司； 其它试剂购自上海生工生物工程有限公司或国产分析纯试剂。 实施例 一种利用"A^Sa^因培育耐旱甘蔗品种的方法，包括以下步骤 --、抗旱转DREB2B基因植物表达载体的构建
用7VcoI和5^I双酶切PC-hyg，将切下的nos终止子插入到用NcoI和Sphl 双酶切的TDREB载体中，得到TDREB-NOS中间载体。用EcoRI和SacI双酶 切pGreen-hyg，将切下的35s-hyg-polyA结构单元插入到用EcoRI和SacI双酶 切的T-Prd29a质粒中，得到rd29a-hyg中间载体。然后用PstI和SphI双酶切 TDREB-NOS中间载体,将切下的DREB-Nos插入到用PstI和SphI双酶切的 rd29a-hyg中间载体中，得到rd29a-dreb-hyg植物表达载体，用PstI和SphI单 双酶切鉴定该重组体。操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细 胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定为分子生物学的常规方法。 二、用于遗传转化受体的获得
供试品种为福建农林大学甘蔗研究所培育的甘蔗新品种福农 95-1702。首先进行消毒处理，选取生长旺盛的福农95-1702梢部30cm，去 其叶片及顶端5cm。用70%酒精表面消毒2 3 min后，超净工作台上剥去其 最外层，再用70%酒精表面消毒1 2 min后剥去次外层，然后小心切取直 径为0.4 0.8cm，厚为l 2mm的新叶，接种于诱导培养基上，于暗室中培 养，培养温度为(25士rC)。每15天在继代培养基中继代一次。选取生长良好，富有光泽，颜色鲜黄，组织块颗粒致密的胚性愈伤为遗传转化的受 体材料。
三、抗旱转DREB2B基因材料的培育
(1) 受体材料预处理在基因枪轰击前先将受体材料转入继代培养基 中预培养2d，然后转入含渗透剂0.2 moH/1甘露醇和0.2 moH/1山梨醇 的继代培养基中预处理4 6 h。
(2) 基因枪轰击将预先准备好的装有愈伤组织的小培养皿放入基因 枪室的托盘上，关闭基因枪门，利用气压1100psi和射击距离6cm直接轰 击甘蔗胚性愈伤组织。
(3) 过渡培养轰击后的愈伤组织仍放回预处理培养基(MS+2，4-D2 mg.L"+Sorbito1 0.2 mol.L"+Mannito1 0.2 mol.L/1)上继续处理18h，其后接 入MS+2,4-D 2 mg丄-1的培养基上25。C暗恢复培养5 8 d。
(4) 筛选继代培养:恢复后的愈伤组织转移至继代培养基中继代筛选， 15d继代一次。继代筛选培养基成分为培养基MS+2，4-D 2.0 mg丄—'+50 mg丄—'潮霉素或40%甘露糖替代蔗糖的培养基，调节pH5.8。
(5) 筛选分化培养选择继代二次后仍存活的愈伤组织，转接入含有 潮霉素(35g.L—1)或30%甘露糖替代蔗糖的分化培养基进行筛选分化。筛 选分化培养基成分为MS+6-BA 1.0 mg-L"+NAA 0.1 mg丄"+KT 2.0 mg.L"+蔗糖30g.L"+琼脂7 g.L" +35 mg丄"潮霉素(35g.L—1)或30%的甘 露糖替代蔗糖，调节pH5.8。
(6) 筛选促根培养抗性苗长到2-4cm后，转入含有潮霉素(30g.L-') 或30%甘露糖替代蔗糖的生根培养基上筛选和生根培养。生根培养基的成 分为1/2MS+NAA 3.0 mg'L"+6-BA 0.1 mg.L"+蔗糖40 g.U1 +潮霉素 30g，L"或30X的甘露糖替代蔗糖，调节pH5.8。
(7) 炼苗和移栽当幼苗的根长至2.5cm长时，移到室外炼苗2d， 然后将小苗取出，用流水洗净附着的培养基，移栽到小花盆中(草木灰: 砂子:耕作土=1:1:1，混合后高压灭菌)定时喷浇稀释10倍的MS无机盐液。
(8) 转基因植株的分子检测根据所转导的启动子^29J基因和 Z)/^B2S基因分别设计上下游特异引物，分别进行PCR、 Southern,对转 基因植株进行目的基因分子检测。Southern杂交采用Roche公司DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I的试剂盒，操作过程严格按照试剂盒提供的指南方法。
四、抗旱高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定
根据国家转基因安全管理条例，将获得的转基因植株及相应的对照
(空载体轰击获得的植株以及受体品种福农95 — 1702)分别在盆栽水分胁 迫和大田生长条件下进行抗旱性和生长、产量和糖份的筛选鉴定，结合抗 旱、增产的生理生化指标，筛选评价转基因无性系。在转基因中间试验阶 段，进行温室盆栽和大田进行人工干旱胁迫鉴定；在环境释放试验阶段进 行工农艺性状的评价；在生产试验示范阶段进行较大面积的田间鉴定和工 农艺性状的评价，筛选抗旱转基因甘蔗新种质材料。
(1)抗旱性评价 * 株高伤害率检测
采用田间鉴定方法，试验区设3次重复，小区面积不小于33.3m2。根 据各地常年的降水分布和旱情，当旱季开始时，每5天调査10株甘蔗的 茎、叶生长速度，连续调査一个月。当土壤含水量下降到临界萎蔫点，或 蔗叶整天处于萎蔫状态、清晨无吐水时，试验区二个重复继续干旱胁迫， 一个重复浇水灌溉，以保持正常生长。
株副储率(昏且靴水，，-:，迫的株高x腦
正常供水的株咼
*丙二醛含量的检测
采用人工水分胁迫试验。试验分水分胁迫处理组和正常供水对照组， 每组每份品系种植20株，定量供水以保持土壤水分的一致性。甘蔗伸长 初期时，除正常供水对照组继续供水外，水分胁迫处理组开始停止供水处 理，停水后当全国统一对照种(ROC10)蔗叶相对含水量下降10 20%或 蔗叶整天处于萎蔫状态，清晨无"吐水"时，每隔2天测定分析丙二醛含 量，共四次。
从蔗株上取+l叶5片，迅速带回实验室，用自来水漂洗叶片以除去表 面沾污物，再用去离子水冲洗一次，用干净纱布轻轻吸干表面的水分。称 取甘蔗叶片0.5g，加入5 mL 10%TCA (三氯醋酸)溶液研磨成匀桨，3000 rpm离心10min，取上清夜2 mL，加入等体积0.67% TBA (硫代巴比妥 酸)，沸水浴中反应20min ，冷却后离心，上清液分别在532nm和600nm 处测定吸光值。丙一醛含量(w,〃Z) =-x — xlOOO
e x 6 v2
式中e=155 L/mmoL*cm ; b为比色杯光程；vl为加入提取液的 体积；v2为吸取上清夜的体积。
*相对质膜透性的检测
从上述干旱胁迫的蔗株上取+1叶5片，迅速带回实验室，用自来水漂 洗叶片以除去表面沾污物，再用去离子水冲洗^次，用干净纱布轻轻吸干 表面的水分。用孔径为lcm的钻孔器打取圆片(避开中脉)；每个处理分 甲乙两组，每组重复3次，每份1.0g;放入编号的玻璃小烧杯中，用带+ 字头的小玻璃棒把材料轻轻压住，立即加入20mL去离子水，使样品完全 浸没于水中。甲组样品集中放置于真空干燥器中，用真空泵反复抽气，真 空压强为0.04 0.05 MPa，放气3 4次，除去水与叶片表面之间的空气， 使叶片与水接触紧密而电解质易于渗出。减压浸渗30min后可恢复常压， 在26~30 °C间保温2h;烧杯中的乙组样品盖上玻璃球后直接置沸水浴 上加温15min ，杀死组织。甲组样品保温后和乙组样品杀死冷却后，把组 织外渗液分别倾入洁净的小烧杯中，用电导率仪测定电导率(y Q/cm)。
相对质膜透性(％) = §§%|$xl00
煮沸电导率
*抗旱性评价
抗旱品种在水分胁迫30天或盆栽中度水分胁迫下要求丙二醛含量低 于7.0"mol'g"FW，质膜透性低于30%，株高伤害率低于30% *结果转基因甘蔗的抗旱性明显高于受体品种，其在中度水分胁迫下， 叶片丙二醛(MDA)含量在3. 5 5. 5umo1 g"FW，质膜透性在5 24%， 株高伤害率都小于300%。 (2)生长和工农艺性状筛选
田间甘蔗出苗率达到50%以后，开始调査出苗率，每周调查一次，直 至稳定；甘蔗生长速度调査分蘖结束后开始，每30天调査一次直到11月份。 在甘蔗工艺成熟期，测量其锤度、株高、茎径并计算有效径数；糖份分析 在ll月中旬开始，每隔15天采样分析蔗糖份、蔗汁纯度、锤度、纤维分等。
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权利要求
1、一种利用DREB2B基因培育抗旱甘蔗品种的方法，包括含有DREB2B基因植物表达载体的构建、抗旱转DREB2B基因材料的培育以及抗旱转基因甘蔗新材料的筛选鉴定，其特征在于包括以下步骤(1)构建植物表达载体，所述植物表达载体为pRD29A-DREB-Hyg和pRD29A-DREB-pmi；(2)通过基因枪转导的方法把pRD29A-DREB-Hyg和pRD29A-DREB-pmi转入甘蔗外植体中；(3)经过在含潮霉素或甘露糖培养基中继代、分化、生根获得抗性植株；(4)通过PCR、southern dot-blotting检测获得转DREB2B基因的甘蔗植株。
2、 根据权利要求1所述的一种利用"A^S^應因培育抗旱甘蔗品种的方法，其特征在于所述的pRD29A-DREB-Hyg是以ZMSS2^J目的基因，WZ)2^4为启动子，Mw-Po/^为终止子，T/j;g为筛选标记基因的植物表达载体；所述的pRD29A-DREB-pmi是以ZW朋2幼目的基因，WD"^为启动子，7Vw-尸o/;^为终止子，pm/为筛选标记基因的植物表达载体。
3、 根据权利要求1或2所述的一种利用Z^^S怨基因培育抗旱甘蔗品种的方法，其特征在于所述的含潮霉素培养基是分别在继代培养基、分化培养基和生根培养基中添加10 50g L—、潮霉素。
4、 根据权利要求1或2所述的一种利用/W^S怨基因培育抗旱甘蔗品种的方法，其特征在于所述的含甘露糖培养基是分别在继代培养基、分化培养基和生根培养基中添加20 70%的甘露糖替代蔗糖。
全文摘要
一种利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗品种的方法，包括含有DREB2B基因的植物表达载体的构建、抗旱转DREB2B基因材料的培育以及抗旱转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。根据上述培育方法，甘蔗在干旱胁迫下诱导抗旱基因的表达，其抗旱性明显优于受体品种，而且不同无性世代间基本保持稳定；在干旱条件下，生长快于受体品种，株高增加20％以上，有效茎数增加30％以上，每公顷蔗茎产量增加30％，甘蔗糖份(绝对值)提高1.5％以上。
文档编号A01H1/00GK101503692SQ20081007062
公开日2009年8月12日 申请日期2008年2月5日 优先权日2008年2月5日
发明者杨 吴, 张木清, 陈如凯 申请人:福建农林大学