治疗及预防关节炎的方法

专利名称：：治疗及预防关节炎的方法
技术领域：
：本发明是关于通过向有需要的患者投与某些硫代阿拉伯呋喃糖基化合物来治疗或预防患者的关节炎(包括类风湿性关节炎)。本发明所使用的化合物呈现良好抗关节炎活性以及展示预防或至少基本上预防关节炎的预防性效果。本发明所使用的化合物呈(3构型，而非a构型。
背景技术：
：尽管已研发出许多种关节炎药物，但由于老年人口日益增多关节炎依旧是世界上非常严重的疾病。虽然关节炎导致的死亡率较低，但患有所述疾病的个体由于活动水平及生产力降低而生活质量受损。在众多关节炎类型中，最为严重者是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是由自身反应性T淋巴细胞作用而引起的自身免疫性疾病。T淋巴细胞经由迟发型超敏反应而引起类风湿性关节炎。我们并不完全了解何种抗原被T淋巴细胞识别而引起所述疾病。II型胶原是已知最可能的抗原，但并不能排除其它可能性。已发现抗组蛋白自身抗体，但还不确定所述抗体是病因。已使用多种药物来治疗类风湿性关节炎，但均不能完全消除症状。传统药物包括非类固醇抗炎药(NSAID、阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen))、金盐、青霉胺及类固醇激素。类固醇激素最具有效能且有效，但长期服用时会产生副作用。最近，临床上正在试用在炎症机制中起重要作用的肿瘤坏死因子(TNF)的重组可溶性受体作为新颖类风湿性关节炎治疗方法。然而，我们期望得到治疗类风湿性关节炎症状(例如炎症)的改良调配物。已使用胶原诱发的关节炎(CIA)作为T淋巴样类风湿性关节炎的动物模型(II型胶原的自身免疫关节炎实验模型(AutoimmunitytoTypeIIcollagen:Experimentalmodelofarthritis),实验医学期刊(J.Exp.Med.)146;857-868(1977))。当将II型胶原注射到易于发生关节炎的小鼠中时，在2周内诱发关节炎，具有诸如血管翳形成、软骨及骨糜烂等症状。与类风湿性关节炎一样，CIA对胶原也具有体液及细胞免疫应答。
发明内容本发明是关于治疗或预防关节炎的方法，其包含向有需要的宿主投与可有效治疗或预防关节炎的量的至少一种由式1表示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中X选自由下列组成的群组氢、卤基、垸氧基、垸基、卤代垸基、烯基、卤代烯基、炔基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、氰基及硝基。所属领域的技术人员自下文详细说明容易明了本发明的其它目的及优点，其中仅经由例示所涵盖的最佳方式来显示及阐述优选实施例。应了解，本发明能够具有其它及不同实施例，且其数个细节能够在各个显而易见方面进行修改，而所有这些皆不背离本发明。因此，应将本说明视为具有例示性而非限定性。图1显示整个试验期间的平均小鼠重量。图2显示在20mg/kg/天组中一只小鼠上出现皮疹。图3显示高剂量(60mg/kg/天)组的所有小鼠发生脾肿大。图4显示在用多种剂量的本发明测试化合物治疗的小鼠中关节炎的发生率。图5显示在多个治疗组中胶原诱发的关节炎的平均发作。图6显示关节炎随时间的发生率。图7显示在治疗及对照动物中关节炎性爪子的累积数量分析。图8显示平均疾病严重程度分析。图9显示在实验之前、免疫后14天、关节炎发作(若适用)及结束时采集的血清中抗CII抗体的水平。图10显示小鼠的总Ig水平。图ll显示响应促分裂原伴刀豆球蛋白A及LPS、及抗原II型胶原的淋巴结细胞激活水平。图12显示脾细胞中对ConA、LPS及CII的应答。图B是正常小鼠的关节及骨的mCT图像。图14是CIA小鼠的关节及骨的mCT图像。图15是用100mg/kgT-araC治疗6周的CIA小鼠的关节及骨的mCT图像。图16是用9mg/kg甲氨蝶呤治疗6周的CIA小鼠的关节及骨的mCT图像。图17所示图展示基于mCT图像的小鼠关节及骨破坏。图18是显示H&E组织学分析的显微照片。(对每只小鼠的一只爪子实施组织病理学评价。将组织样品固定，脱钙，用石蜡包埋，H&E染色。对每只爪子的结构变化及边缘糜烂的严重程度进行评分。)图19所示图展示基于H&E染色的关节炎的严重程度。图20所示图展示小鼠血清中的抗胶原抗体。(在T-araC治疗完成后两周采集血液样品。)图21所示图展示小鼠血清中的IL-IO。图22所示图展示小鼠血清中的VEGF。图23所示图展示小鼠血液中的T细胞。图24所示图展示小鼠血液中的T辅助细胞。图25所示图展示小鼠血液中的细胞毒性T细胞。图26所示图展示小鼠血液中的B细胞。图27A-27D展示胶原诱发的关节炎的组织学结果及本发明治疗。图28所示图展示本发明治疗对关节炎症的影响。图29所示图展示本发明治疗对关节糜烂的影响。图30所示图展示本发明治疗对关节炎病状的影响。图31所示图展示本发明治疗对软骨基质损失的影响。具体实施例方式本发明是关于治疗或预防关节炎的方法，其包含向有需要的宿主投与可有效治疗或预防类风湿性关节炎的量的至少一种由式1表示的化合物其中各R各自为H、脂肪族酰基或芳香族酰基;A选自由下列组成的群组<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中X选自由下列组成的群组氢、卤基、垸氧基、烷基、卤代垸基、烯基、卤代烯基、炔基、氨基、单垸基氨基、二烷基氨基、氰基及硝基。式1中的各R优选各自为H或脂肪族或芳香族酰基。通常，脂肪族酰基含有1个至6个碳原子，且包括甲酰基、乙酰基及丙酰基。通常，芳香族酰基包括在芳香族基团中含有7-10个碳原子的未经取代及经烷基取代的芳香族基团。当经取代时，垸基通常含有l-6个碳原子。典型芳香族酰基包括苯甲酰基及对甲基苯甲酰基。用于X的单垸基氨基的实例含有1-6个碳原子，且包括单甲基氨基、单乙基氨基、单异丙基氨基、单正丙基氨基、单异丁基氨基、单正丁基氨基及单正己基氨基。烷基部分可为直链或具支链。用于Y及X的适宜二垸基氨基的每个垸基含有1-6个碳原子。垸基可相同或不同，且可为直链或具支链。一些适宜基团的实例是二甲基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基、二丙基氨基、二丁基氨基、二戊基氨基、二己基氨基、甲基戊基氨基、乙基丙基氨基及乙基己基氨基。用于X的卤素基团的实例包括C1、Br、F及I，其中F最为典型。用于X的垸基的实例通常含有l-6个碳原子，且可为直链或具支链。一些实例是甲基、乙基、异丙基、正丙基、异丁基、正丁基、戊基及己基。卤代烷基的实例通常含有l-6个碳原子，且可为直链或具支链，且包括经C1、Br、F或I取代的烷基(包括上文明确揭示的烷基)。垸氧基的实例通常含有l-6个碳原子，且包括甲氧基、乙氧基、丙氧基及丁氧基。烯基的实例通常含有2-6个碳原子，且包括乙烯基及丙烯基。卤代烯基的实例通常含有1-6个碳原子，且包括经Cl、Br、F或I取代的烯基(包括上文明确揭示的烯基)。炔基的实例通常含有l-6个碳原子，且包括乙炔基及丙炔基。本发明方法所使用的优选化合物是l-(4-硫基-P-D-阿拉伯呋喃糖基)氟胞嘧啶及l-(4-硫基-P-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶，在本文中也称为硫代AraC及TAraC。本发明所使用的化合物可通过美国专利第6,576,621号中揭示的改良方法来制备，其揭示内容以引用方式并入本文中。本发明拟解决的关节炎类型的实例包括类风湿性关节炎及骨关节炎。本发明所治疗的宿主包括诸如人类及伴侣动物(例如狗及猫)等哺乳动物。以下非限制性实例阐释本发明且展示本发明所使用化合物治疗及预防关节炎的效力。下文数据揭示在胶原诱发的关节炎中使用预防性方案测试化合物(即l-(4-硫基-P-D-阿拉伯呋喃糖基)胞喷啶)的显著抗关节炎作用c所述药物呈现强剂量依赖性效果，在60mg/kg/天下可完全防止疾病发作，而用20mg/kg/天治疗的小鼠疾病发生率显著降低。虽然自当前实验并不能确定准确作用机制，但所述药物对疾病进程产生了影响，显著降低了小鼠受侵袭爪子发展为关节炎的数量，而且降低了患关节疾病爪子的关节炎严重程度。抗CII抗体效价显著降低也可能是此研究中所观察到的抗关节炎活性的关键。然而，应注意，总免疫球蛋白水平也降低，此表明产生综合免疫抑制效果。在淋巴结细胞中观察到对T细胞促分裂原ConA的应答显著降低，且中间(media))细胞激活应答表明淋巴细胞活性普遍降低。在20mg/kg/天剂量(在20%的小鼠中出现非致死性皮疹)及60mg/kg/天/剂量(20%出现皮疹，其中一只死亡，且显著脾肿大)二者下均观察到一定水平的药物毒性。总的来说，测试化合物呈现非常有价值的强烈显示抗关节炎活性的临床前期结果。胶原关节炎係通过用II型胶原(关节软骨的主要组份)免疫易受影响的小鼠品系来诱发(l)。在大多数经免疫动物中发生渐进性炎症关节炎，其临床特征在于红斑及水肿，受侵袭爪子的宽度通常增大100%。已提出临床评分指数来评价疾病至关节变形及脊柱炎的进程(2)。受侵袭关节的组织病理显示滑膜炎、血管翳形成、及软骨及骨糜烂，此也可由指数来表示。免疫学实验室结果包括高II型胶原抗体水平及高丙种球蛋白血症。此模型现在普遍用于测试关节疾病的免疫治疗途径(3)，且已成功用以研究用于类风湿性关节炎(RA)治疗的生物及药理学药剂(4;5)。此实验使用预防性方案使用三种剂量自用II型胶原免疫的时间起投与来评价测试化合物对CIA的影响。在测试中使用以下材料及方法。动物及化合物投与40只8-10周龄的DBA/1LacJ小鼠是自杰克逊实验室(JacksonLab)获得，且在实验之前使其在测试设施中适应10天。所有动物在测试开始时重量均大于16克。每周制备新鲜投用溶液并在4'C下储存。将小鼠分至四个治疗组之一中第1组.每天腹腔注射100pi无菌媒剂(含有0.05柳土温(Tween)80的盐水)。第2组.腹腔注射100^含有5mg/kg/天化合物的无菌媒剂。第3组.腹腔注射100pl含有20mg/kg/天化合物的无菌媒剂。第4组.腹腔注射100含有60mg/kg/天化合物的无菌媒剂。初始投用后三天，在尾巴根部经皮内给所有小鼠注射100昭存于弗氏完全佐剂(Freund'scompleteadjuvant)(FCA)中的牛II型胶原。通过每天检查并记录疾病发作来监测小鼠。每周称重小鼠，且记下总体健康状况。每周对受关节炎侵袭的动物实施5次临床评价，直至免疫后10周，且每周测量爪子3次。免疫后IO周无关节炎体征的小鼠视为疾病阴性。免疫学评价在试验开始之前给所有小鼠预抽血，随后在免疫后两周、关节炎发作(若适用)及试验完成时给所有小鼠抽血。分离血清并储存在-80'C下。实施ELISA分析以测定(1)抗II型胶原抗体水平及(2)总免疫球蛋白水平。屠宰时取出脾及淋巴结，并制备单细胞悬浮液。使用标准技术来测定对ConA及LPS的促分裂原应答及对II型胶原的抗原增殖应答。分析实施合适统计学比较来评价化合物对以下的影响(i)疾病发生率；(ii)疾病发作时间；(iii)各爪子肿胀情况；及(iv)基于累积关节炎评分的疾病进程。对免疫数据进行分析以研究化合物对以下的影响(i)II型胶原的抗体应答；(ii)总免疫球蛋白水平；(iii)T细胞促分裂原应答；(iv)B细胞促分裂原应答；及(V)抗原特异性(胶原)增殖应答。结果副作用及毒性-整个试验期间的平均小鼠重量显示于图1中。尽管随机分组，但实验开始时对照组中的小鼠与治疗组中的小鼠的重量无显著差别，且其重量随后在疾病发作后降低，此在胶原关节炎中甚为典型。在用5mg/kg/天测试化合物治疗的小鼠中观察到类似重量特性曲线。相比之下，用20mg/kg/天测试化合物治疗的小鼠在整个试验期间重量增加，增加速率与正常动物类似。此导致从第5周起对照小鼠与此治疗组具有显著差异。在整个第6周期间用60mg/kg/天治疗的小鼠以正常速率增加重量，但随后在第6周至第8周重量迅速下降，此后其重量恢复到接近正常水平。高剂量(60mg/kg/天)组中的一只动物在研究期间由于发生呈现二次感染体征的显著溃疡性皮疹而被无痛致死。60mg/kg/天组中的另一只小鼠及20mg/kg/天组中的两只动物观察到轻微皮疹(图2)。通过停止治疗3-4天(此后皮肤显示较低刺激)来控制这些表现，且在病状不恶化下重新开始治疗。试验完成后，皮疹通常消退，留下一块轻微纤维化区域。获得受侵袭部位的皮肤活组织检验，且病理结果尚未获得。尸体剖检期间的检査显示高剂量(60mg/kg/天)组中的所有小鼠显著脾肿大(图3),且显示组织均质化之前的脾重量较PBS对照组增加约5倍。也在一些小鼠中观察到淋巴结病，但发生率及等级较关于脾的观察结果为低。在较低剂量治疗组中未观察到此效应。总的来说，在20mg/kg/天及5mg/kg/天下，药物耐受性相当好，且这些组中的所有小鼠在研究阶段后均存活。关节炎的发生率及发作-用多种剂量本发明测试化合物治疗的小鼠的关节炎发生率显示于图4中。所述研究最突出的特征在于用60mg/kg/天治疗的小鼠完全免于疾病，其中0/10动物患有疾病，相比之下PBS对照组的发生率为100%(10/10)(p<0.001)。也观察到用20mg/kg/天测试化合物治疗的小鼠疾病发生率非常显著地降低(p〈0.01)，而接受5mg/kg/天的小鼠的疾病发生率(9/10)与对照小鼠无显著差异。数据显示对胶原诱发关节炎的发生率具有明显剂量依赖性效果。多个治疗组中胶原诱发的关节炎的平均发作显示于图5中。呈现关节炎的小鼠组之间未观察到疾病发作的显著差异。尽管对照组中的小鼠以较经治疗小鼠略微缓慢的平均发作速率发病(43天对34天)，但这些差异在统计学上并不显著。关节炎随时间的发生率显示于图6中。在试验的最初5周期间，经治疗小鼠与对照动物的发作速率相对来说是相当的。自此以后，20mg/kg组的发作速率大大减缓(但5mg/kg/天组没有)。可以看出，自第50天至试验完成20mg/kg组的疾病发生率显著降低，且在实验结束时疾病的最终发生率与对照组具有显著差异(p〈0.01)。疾病严重程度及进程-经治疗及对照动物中关节炎性爪子的累积数量分析(图7)揭示，用测试化合物进行治疗对胶原诱发关节炎的进程具有显著影响。在用PBS治疗的对照小鼠中，40只爪子中总共有27只呈现关节炎体征，此与用60mg/kg/天(0/40)或20mg/kg/天(7/40)治疗的小鼠具有非常显著的差异(p〈0.001)。与对照小鼠相比，用5mg/kg/天治疗的小鼠涉及爪子的数量减少(19/40)，但此并未达到统计学显著。在平均疾病严重程度分析期间观察到类似结果，其显示于图8中。在对照小鼠中自第6周至试验完成疾病明显恶化，此是胶原关节炎的典型表现。清楚地检查用20mg/kg/天治疗的小鼠疾病严重程度的进度，在第6周时观察到显著减轻(p〈0.04)，且自第8周至试验完成此差异变得非常显著(p〈0.001)。在用5mg/kg/天治疗的小鼠中疾病严重程度的减轻较不明显，但在试验完成时(第10周)观察到确实达成显著减轻(p<0.05)。抗n型胶原抗体水平-实验之前、免疫后14天、关节炎发作(若适用)及结束时采集的血清中抗cn抗体的水平显示于图9中。在用60mg/kg/天T-araC治疗的小鼠中抗CII效价完全抑制，此显示MoA具有抗关节炎活性。实验结束时，接受20mg/kg/天的小鼠中的抗胶原抗体也显著降低(p<0.02)，低于对照小鼠中所观察到的水平，且在疾病发作时在接受5mg/kg/天的小鼠中观察到显著降低(p〈0.01)。总免疫球蛋白水平-小鼠中的总Ig水平显示于图10中。在实验开始之前(预抽血)，组间无显著差异。在治疗后两周，所有治疗组的Ig水平均降低到对照水平以下，5mg/kg/天(p〈0.05)、20mg/kg/天(p〈0.05)及60mg/kg/天(p〈0.005)均达成统计学降低。然而，在疾病发作时任一组中的小鼠均无显著差异。在研究结束时，用60mg/kg/天治疗的小鼠的Ig水平非常低，且用5mg/kg/天或20mg/kg/天治疗的小鼠的Ig水平显著低于对照小鼠(p〈0.02)。促分裂原及抗原增殖应答-响应促分裂原伴刀豆球蛋白A及LPS、及抗原II型胶原的淋巴结细胞激活水平显示于图11中。在用5mg/kg/天T-araC(p〈0.04)及60mg/kg/天T-araC(p〈0.001)治疗的组中，T细胞促分裂原伴刀豆球蛋白A的应答显著降低，且在接受20mg/kg/天的小鼠中接近显著(p^.08)。有趣的是，LPS(主要B细胞促分裂原)的应答未受显著影响。刺激抗原(n型胶原)的应答也未受治疗影响。脾细胞中ConA、LPS及CII的应答显示于图12中。与淋巴结细胞中所观察到的抑制相比，在用20mg/kg/天测试化合物治疗的小鼠中细胞刺激似乎显著提高(p<0.005)。然而，数据分析表明，用20mg/kg/天(0.53)及60mg/kg/天(0.58)治疗的小鼠的中间(未受刺激)细胞激活水平低于对照小鼠的细胞激活水平(0.77)，且此差异具有统计学显著性(分别为p〈0.001及p〈0.05)。因此，刺激指数的此明显增加准确地说是由于基线细胞活性降低而非增殖增加导致的。上文结果显示，在使用预防性方案的胶原诱发的关节炎中本发明测试化合物具有显著抗关节炎影响。所述药物呈现强剂量依赖性效果，在60mg/kg/天下完全防止疾病发作，而用20mg/kg/天治疗的小鼠疾病发生率显著降低。所述药物对疾病进程产生了显著影响，显著降低了小鼠受侵袭爪子发展为关节炎的数量，而且降低了患关节疾病爪子的关节炎严重程度。虽然自当前实验并不能确定准确作用机制，但抗CII抗体效价显著降低可能是此研究中所观察到的抗关节炎活性的关键。然而，应注意，总免疫球蛋白水平也降低，此表明是综合免疫抑制效果，而非自身免疫活性的特异性降低。在淋巴结细胞中观察到T细胞促分裂原ConA的应答显著降低，且中间细胞激活应答表明淋巴细胞活性普遍降低。在20mg/kg/天剂量(在20呢的小鼠中出现非致死性皮疹)及60mg/kg/天/剂量(20%出现皮疹，其中一只死亡，且显著脾肿大)二者下均观察到一定水平的药物毒性。总的来说，所述药物呈现非常有价值的强烈证实抗关节炎活性的临床前期结果。在进一步测试中，在第0天给小鼠注射胶原H/完全弗氏佐剂(CFA)作为初始免疫，且在第21天再次注射胶原II(无CFA)作为加强注射。为期6周的治疗在第-2天开始且为期3周的治疗在第19天开始。所有治疗均在第40天结束。在第54天采集组织及血液样品以用于病理及免疫分析。使用CIA小鼠模型评价T-araC活性的研究设计<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>X射线微断层摄影图(microtomograph)(mCT)提供用于检测小鼠中骨及关节破坏及糜烂的非破坏性三维内部显微术。使用所述技术来研究关节炎治疗中T-araC[1-(4-硫基-(3-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶]药物的功效。例如参见图13-16，其分别为正常小鼠、CIA小鼠、用T-araC治疗的CIA小鼠及用甲氨蝶呤治疗的CIA小鼠的关节及骨的mCT图像。三维内部显微术的微CT图像及关节及骨糜烂的定量分析(图17)显示，使用两种治疗剂量及时间表时T-araC具有显著抗关节炎活性。T-araC在CIA模型中显示与甲氨蝶呤类似的活性，甲氨蝶呤是当前临床上用以对抗类风湿性关节炎的药物。对小鼠爪子进行组织学分析以评价小鼠关节周围的炎症及糜烂性变化。结果也显示T-araC具有显著抗关节炎活性(图18及19)，此与微CT分析一致。另外，与I期临床研究一致，在T-araC治疗后小鼠血液血清中的抗炎症及抗血管生成细胞因子IL-10显著增加(图21)。使用ELISA来检测小鼠血清中的血管内皮生长因子(VEGF)含量，且不同治疗组间未观察到显著差异(图22)。在T-araC治疗后两周时间点，计数小鼠血液样品中的T细胞及B细胞，且发现任一细胞类型均未减少，表明若存在与T-araC治疗有关的对T细胞或B细胞计数的任何免疫抑制效应，则所述效应可能可逆。总之，使用CIA小鼠模型及表格中所示治疗设计的此临床前期研究显示，T-araC的抗关节炎活性具有统计学显著性，且未观察到明显的与T-araC治疗有关的毒性。在又一测试中，获得60只8-10周龄的DBA/1LacJ小鼠，且在实验之前使其适应测试设施最少10天。所有动物在实验开始时重量均大于16克。在尾巴根部经皮内给小鼠注射100)ig存于弗氏完全佐剂(FCA)中的牛II型胶原，并通过每天检查及记录疾病发作来监测。在第一次出现关节炎临床迹象时，将小鼠分至四个治疗组之一中第1组.通过口服管饲法每周投与三次100无菌媒剂。第2组.通过口服管饲法投与100pl含有30mg/kgT-araC的无菌媒剂。第3组.通过口服管饲法投与100pl含有60mg/kgT-araC的无菌媒剂。第4组.通过口服管饲法投与100pl含有90mg/kgT-araC的无菌媒剂。每周称重小鼠，且记下总体健康状况。每周对动物疾病实施5次临床评价，直至疾病发作后10周，且每周测量爪子3次。组织学评价-在临床评价研究完成时取所有小鼠的四肢，并储存在中性缓冲的福尔马林(formalin)溶液中。将关节在10%甲酸中脱钙18天，脱水，并包埋在石蜡块中。沿纵轴切片、固定并用苏木素及曙红或甲苯胺蓝染色。将试样切割至接近中线处，且随后将矢形面中心(sagittalcentral)样品固定以实施评价。此使得可实施区域上一致的评价。固定5至10份样品(通常每块载玻片4-6份样品)。染色后，使载玻片与盖玻片持久粘合。以盲法方式评价每份试样的最少3片单独切片，评价者对组的分配不知情。对前肢上的所有肘、腕及掌关节实施评分，同时对后爪子上的所有膝、踝及跖关节实施评分。足趾(digit)未实施评价，此乃因切片程序除去了大多数PIP关节。评价载玻片是否存在滑膜炎、血管翳形成、边缘糜烂、结构变化(主要为半脱位)及破坏。随后基于这些共同点对每一切片赋予总评分。评分系统基于以下滑膜炎是通过滑膜厚度来诊断，且评分如下0-小于3个细胞厚1-3-5个细胞厚2-6-10个细胞厚3-10-20个细胞厚4-20-30个细胞厚血管翳形成评分如下0-无血管翳形成1-存在微绒毛2-明显血管翳附着3-显著血管翳附着4-关节间隙中充满血管翳边缘糜烂评分如下0-看不到糜烂1-荚膜附着区域轻微凹陷2-软骨明显糜烂3-糜烂扩大到软骨下骨4-骨及软骨严重糜烂结构变化评分如下0-关节结构正常1-水肿性变化2-关节表面轻微半脱位3-关节表面严重半脱位4-完全纤维化及胶原桥连总评分反映0-标准正常关节外观1-轻微变化；与消退一致；在临床上可能正常。2-确定炎症关节炎3-严重炎症、糜烂性疾病4-破坏性糜烂性关节炎评价甲苯胺蓝切片的蛋白聚糖损失。将关节面的染色与生长面的染色进行比较，且评分如下0-无蛋白聚糖损失；正常甲苯胺蓝染色。1-轻微蛋白聚糖损失；表面软骨染色有一定损失2-中等蛋白聚糖损失；表面软骨染色较弱3-大量蛋白聚糖损失；表面软骨无甲苯胺蓝染色4-严重蛋白聚糖损失；深层软骨无甲苯胺蓝染色胶原诱发的关节炎的组织学结果-对切片的炎症及糜烂性疾病参数进行评价。在对照(PBS治疗)组中，关节炎外观(图27A)显示严重炎症糜烂性疾病病状，具有滑膜肥大及增生的典型关节炎特征，具有显著血管翳附着及边缘糜烂。用30mg/kg/天T-araC化合物进行治疗(图27B)使得关节炎参数显著变化，炎症及糜烂性关节变化均减轻。与对照相比，用60mg/kg/天T-araC进行治疗(图27C)使得血管翳形成及糜烂更显著减轻，且投与90mg/kg/天T-araC(图27D)达成轻微变化外观或具有薄滑膜、光滑软骨表面及正常骨的正常关节。另外，在所述研究中，用多种剂量的T-araC进行治疗时，动物技师均未报告皮疹。炎症评分分析(图28)揭示，与对照(盐水治疗)动物相比，在用T-araC治疗的小鼠中炎症剂量依赖性减轻。在用30mg/kgT-araC治疗的小鼠中，滑膜炎显著减轻(p<0.01)，且血管翳形成显示类似评分降低(p〈0.01)。在用60mg/kg或90mg/kg治疗的小鼠中，这些参数非常显著地降低(p〈0.001)，且较高剂量组与接受30mg/kgT-araC的小鼠也有显著差异。对胶原诱发关节炎的糜烂性特征(糜烂及关节结构变化)变化的评价显示类似效应特性曲线。与对照(盐水治疗)动物相比，在用30mg/kg/天及90mg/kg/天T-araC治疗的组中观察到关节糜烂非常显著地减轻(p〈0.001)(图29)，且在用20mg/kg/天T-araC化合物治疗的小鼠中观察到显著减轻(p〈0.01)。组织病理学参数与总组织学关节炎评分组合(图30)反映各疾病参数结果。用T-araC治疗的小鼠与对照(PBS)治疗动物间观察到显著剂量依赖性差异。在用60mg/kg/天及90mg/kg/天治疗的小鼠中总疾病减轻非常显著(p〈0.001)。检测经甲苯胺蓝染色的切片以确定T-amC是否影响关节炎关节的基质蛋白损失。数据(图31)显示，60mg/kg/天或90mg/kg/天T-araC确实防止蛋白聚糖损失，且该效果在统计学上非常显著。组织学结果证实临床数据，表明使用治疗性方案用本发明化合物治疗建立的胶原诱发的关节炎可使疾病显著剂量依赖性改善。在用60mg/kg或90mg/kg治疗的小鼠中，所有关节炎组织学参数的降低均达到高统计学显著水平。然而，在所有剂量下均观察到疾病的统计学减轻。在高剂量T-araC下，关节结构明显恢复。总体印象是在用高剂量治疗的小鼠中T-araC使关节疾病一定程度恢复。总之，这些结果与所得到的临床观察结果符合，且非常令人鼓舞。结果表明，当以治疗性方式将本发明化合物投与到建立的关节炎时其具有抗关节炎效果。现在对显示显著抗关节炎效果的治疗试验进行总结，在试验期间的某个时间点接受90mg/kg/天的小鼠100%开始疾病消退，且在试验结束时60%的动物保持在临床无疾病状态。另外，观察到关节炎指数及涉及爪子的数量非常显著地降低。亦在用60mg/kg/天治疗的小鼠中观察到关节炎显著减轻，其中在某个时间点70%开始疾病消退，且在试验结束时40%仍然保持消退。再次观察到疾病评分及涉及四肢的数量显著降低。在用30mg/kg/天治疗的小鼠中未观察到对临床疾病的显著效果。组织学结果证实临床数据，且表明使用本发明化合物T-araC治疗建立的胶原诱发的关节炎可使疾病显著剂量依赖性改善。所有关节炎组织学参数的降低均达到高统计学显著水平，且在高剂量T-araC下观察到关节结构显著恢复。脾肿大(在用T-araC治疗的所有小鼠中普遍存在，与关节炎功效无关)研究显示，最显著的变化是在不存在组织坏死或纤维化下细胞过度增殖。此显著细胞增加似乎引起脾大小增加。调配物本发明化合物可作为个别治疗药剂或若干治疗药剂的组合通过任何可用于投与药物的传统方法来投与。其可单独投与，但通常与根据所选投与途径及标准医药实践而选择的医药载剂一起投与。所述化合物也可与诸如下述其它治疗药剂一起投与干扰素(IFN)、干扰素a-2a、干扰素a-2b、复合干扰素(consensusinterferon)(CIFN)、利巴韦林(ribavirin)、金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(remantadine)、白细胞介素-12、熊去氧胆酸(UDCA)及甘草皂苷。本文所述医药上可接受的载剂(例如，媒剂、佐剂、赋形剂或稀释剂)已为所属领域的技术人员所熟知。通常，医药上可接受的载剂对于活性化合物来说是化学惰性的且在使用条件下无有害副作用或毒性。医药上可接受的载剂可包括聚合物及聚合物基质。本发明化合物可作为个别治疗药剂或若干治疗药剂的组合通过任何可用于投与药物的传统方法来投与。当然，投与剂量将根据习知因素而变化，例如特定药剂的药效特征及其投与方式及途径；接受者的年龄、健康状况及体重；症状的性质及程度；并行治疗的种类；治疗频率；及期望的效果。预期活性成份的日剂量为约0.001毫克(mg)至1000mg/千克(kg)体重，优选剂量为0.1mg/kg至约30mg/kg。剂型(适于投与的组合物)每单位含有约lmg至约500mg活性成份。在所述医药组合物中，活性成份通常以占组合物总重量约0.5-95重量％的量存在。活性成份可以固体剂型(例如胶囊、片剂及粉剂)或以液体剂型(例如酏剂、糖浆及悬浮液)经口投与。其亦可以无菌液体剂型非经肠投与。活性成份亦可经鼻内(滴鼻液)或通过吸入药物粉雾来投与。可使用例如经皮、经由贴片途径或软膏投与的其它剂型。适于经口投与的调配物可由下列各物组成(a)液体溶液，例如有效量的化合物溶解于诸如水、盐水或橙汁等稀释剂中；(b)胶囊、药囊、片剂、菱形片剂及糖锭，各含有预定量的活性成份，呈固体或颗粒形式；(C)粉剂；(d)合适液体中的悬浮液；及(e)适宜乳液。液体调配物可包括稀释剂，例如水及醇，例如乙醇、苯甲醇、丙二醇、甘油及聚乙烯醇，其中添加或不添加医药上可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。胶囊形式可为普通硬壳或软壳明胶类型，其含有例如表面活性剂、润滑剂及惰性填充剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸钙及玉米淀粉。片剂形式可包括下列各物中的一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶状二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸及其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、湿润剂、防腐剂、矫味剂及药理学上可相容的载剂。菱形片剂形式可包含活性成份于矫味剂(通常为蔗糖及阿拉伯胶或黄蓍胶)中、且含片包含活性成份于惰性基质(例如明胶及甘油、或蔗糖及阿拉伯胶)中、乳液及凝胶除活性成份外还含有所属领域的技术人员所习知的载剂。本发明化合物可单独或与其它适宜组份组合制成气溶胶调配物而经由吸入投与。可将所述气溶胶调配物置于经加压的可接受推进剂(例如二氟二氯甲垸、丙垸及氮气)中。亦可将其调配成(例如)装入雾化器或喷雾器中的用于非加压制剂的药物。适于非经肠投与的调配物包括水性及非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及使调配物与预定接受者的血液等渗的溶质；以及水性及非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂及防腐剂。所述化合物可以存于医药载剂中的生理学上可接受的稀释剂形式投与，例如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、水性右旋糖及有关糖溶液、醇，例如乙醇、异丙醇或十六醇、二醇，例如丙二醇或聚乙二醇(例如聚(乙二醇)400)、甘油縮酮，例如2，2-二甲基-l，3-二氧戊环-4-甲醇、醚、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加医药上可接受的表面活性剂(例如肥皂或去污剂)、悬浮剂(例如果胶、聚羧乙烯制剂(carbomer)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂及其它医药佐剂。可用于非经肠调配物的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂及矿物油。适用于非经肠调配物的脂肪酸包括油酸、硬脂酸及异硬脂酸。适宜脂肪酸酯的实例是油酸乙酯及肉豆蔻酸异丙酯。适用于非经肠调配物的肥皂包括脂肪碱金属、铵及三乙醇胺盐，且适宜去污剂包括(a)阳离子型去污剂，例如二甲基二垸基卤化铵及垸基吡啶鎗卤化物；(b)阴离子型去污剂，例如烷基、芳基及烯烃磺酸酯、烷基、烯烃、醚及单甘油硫酸酯、及磺基琥珀酸酯；(c)非离子型去污剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺及聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物；(d)两性去污剂，例如P-氨基丙酸烷基酯及2-烷基咪唑啉季铰盐；及(e)其混合物。非经肠调配物的溶液中通常含有约0.5重量％至约25重量％的活性成份。适宜防腐剂及缓冲剂可用于所述调配物中。为最小化或消除对注射部位的刺激，所述组合物可含有一种或多种亲水亲油平衡值(HLB)介于约12至约17之间的非离子型表面活性剂。所述调配物中表面活性剂的量介于约5重量％至约15重量9b之间。适宜表面活性剂包括聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如山梨糖醇酐单油酸酯)及氧化乙烯与疏水性基质的高分子量加合物、通过使氧化丙烯与丙二醇縮合而形成的高分子量加合物。医药上可接受的赋形剂亦已为所属领域的技术人员所熟知。赋形剂的选择至少部分由特定化合物以及用以投与组合物的特定方法来决定。因此，存在许多种本发明医药组合物的适宜调配物。下述方法和赋形剂仅为例示性的且决非限制性的。优选地，医药上可接受的赋形剂不干扰活性成份的作用且不会引起不利副作用。适宜载剂及赋形剂包括溶剂(例如水、醇及丙二醇)、固体吸收剂及稀释剂、表面活化剂、悬浮剂、片剂粘合剂、润滑剂、矫味剂及着色剂。所述调配物可存在于单剂量或多剂量密封容器(例如安瓿及小瓶)中，且可储存在冷冻干燥(冻干)条件下一仅需在即刻使用前添加无菌液体赋形剂(例如注射用水)。可自无菌粉剂、颗粒及片剂制备临时配制的注射溶液及悬浮液。用于可注射组合物的有效医药载剂的要求已为所属领域的技术人员所熟知。参见制药学与药学实践(fVzarmacew"csawd尸/jarmac;y尸racrice)，禾!j平禾斗特(J.B.Lippincott)公司，宾西法尼亚州(Philadelphia),PA，班克(Banker)及查墨斯(Chalmers)编辑，238-250(1982);及可注射药物的ASHP手册(AS7/尸H朋必oc^o打/")ectoWeDmg"，托赛奥(Toissel)，第4版，622-630(1986)。适于局部投与的调配物包括包含活性成份于矫味剂(通常为蔗糖及阿拉伯胶或黄蓍胶)中的菱形片剂；包含活性成份于惰性基质(例如明胶及甘油、或蔗糖及阿拉伯胶)中的含片；及包含活性成份于适宜液体载剂中的漱口药；以及乳膏、乳液及凝胶，其除活性成份外还含有所属领域的技术人员所习知的载剂。另外，适于直肠投与的调配物可以栓剂形式存在，其通过与诸如乳化基质或水溶性基质等多种基质混合来制备。适于阴道投与的调配物可以阴道栓、棉塞、乳霜、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾调配物形式存在，其除活性成份外亦含有所属领域的技术人员认为合适的载剂。适宜医药载剂阐述于此领域的标准参考文本雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceuticalSciences)，马克出版公司(MackPublishingCompany)中。在本发明上下文中投与至动物(尤其人类)的剂量应足以在合理期限内在动物中达成治疗应答。所属领域的技术人员应认识到，剂量将根据多种因素而定，包括动物的病状、动物体重以及所治疗病状的严重程度及阶段。适宜剂量在患者中产生己知可达成期望应答的活性药剂浓度。优选剂量是最大抑制所治疗的病状而无难以控制的副作用的量。剂量大小亦由投与途径、时间安排及频率以及投与化合物可能伴随的任何不利副作用的存在、性质及程度及期望生理学效果来决定。可用于投与本发明化合物的医药剂型举例如下硬壳胶囊大量胶囊单位可通过用100mg粉末状活性成份、150mg乳糖、50mg纤维素和6mg硬脂酸镁填充每粒标准两片式硬明胶胶囊来制备。软明胶胶囊制备活性成份存于可消化油(例如大豆油、棉籽油或橄榄油)中的混合物，并借助正排量泵将其注射到熔融明胶中，形成含有lOOmg活性成份的软明胶胶囊。洗涤并干燥所述胶囊。可将活性成份溶解于聚乙二醇、甘油及山梨醇的混合物中以制备可与水混溶的药物混合物。片剂通过传统程序来制备大量片剂，使其剂量单位为100mg活性成份、0.2mg胶状二氧化硅、5mg硬脂酸镁、275mg微晶纤维素、11mg淀粉及98.8mg乳糖。可施加合适水性及非水性涂层以提高适口性、使其雅致及稳定或延迟吸收。速释片剂/胶囊所述是通过传统及新颖方法制备的固体口服剂型。在无水情况下经口服用这些单位可立即溶出及递送药物。将活性成份混合于含有诸如糖、明胶、果胶及甜味剂等成份的液体中。通过冷冻干燥及固态萃取技术将所述液体固化成固体片剂或囊片。可将药物化合物与粘弹性及热塑性糖及聚合物或泡腾组份压制在一起而产生拟用于速释(无需水)的多孔基质。此外，本发明化合物可以滴鼻液、或定量剂量及鼻或口腔吸入剂形式投与。药物是自鼻溶液以细雾形式或自粉末以气溶胶形式递送。本文所用的术语"包含(comprising)"(及其语法变体)是以"具有(having)"或"包括(including)"的包括意义使用，而非以"仅由…组成(consistingonlyof)"的排外意义使用。本文所用的术语"基本上由…组成"意指包括明确列举者与不会本质上影响所列举者或指定者的基本及新颖特征者。本文所用的术语"一(a)"及"所述(the)"应理解为涵盖复数形式以及单数形式。上文对本发明的描述是对本发明进行阐释及说明。此外，本发明仅显示及阐述优选实施例，但如上文所提及，应了解，本发明能够用在各种其它组合形式、修改形式及环境中并能够在本文所述且与上述教示相当的概念范畴内及/或在相关技术的技能或知识范围内作出改变或修改。上文所述实施例意欲进一步解释习知的实践本发明的最佳方式，并使其它所属领域的技术人员能够在所述或其它实施例中在特定应用或使用本发明所需的各种修改下使用本发明。因此，本说明并非意欲将本发明限制于本文所揭示的形式。而且，随附权力要求书意欲理解为包括替代实施例。本说明书中提及的所有公开案、专利及专利申请案均以引用方式并入本文中，且出于任何及所有目的，其并入程度如同明确地及单独地指出将每一个别公开案、专利及专利申请案以引用方式并入一般。在不一致情况下，以本发明为准。参考文献(1)伍雷(WooleyPH)，露丝拉(LuthraHS)，斯图亚特(StuartJM),戴维(DavidCS).小鼠II型胶原诱发的关节炎。I类主要组织相容性复合物(I区)连锁与抗体相关。(TypeIIcollagen-inducedarthritisinmice.I.Majorhistocompatibilitycomplex(Iregion)linkageandantibodycorrelates.)实验医学期干U(JournalofExperimentalMedicine)1981;154:688-700。(2)伍雷(WooleyPH).小鼠胶原诱发的关节炎。(Collagen-inducedarthritisinthemouse.)酶学方法(MethodsInEnzymology)1988;162:361-373。(3)斯坦因斯(StainesNA)，伍雷(WooleyPH).胶原关节炎-其可教示我们什么？(Collagenarthritis-whatcanitteachus)英国风湿病学期刊(BritishJournalofRheumatology)1994;33(9):798-807。(4)伍雷(WooleyPH)，华伦(WhalenJD),査普曼(ChapmanDL),伯杰(BergerAE)，理査德(RichardKA),阿斯巴(AsparDG).白细胞介素-1受体拮抗蛋白对小鼠II型胶原诱发的关节炎及抗原诱发的关节炎的影响。(Theeffectofaninterleukin-1receptorantagonistproteinontypeIIcollagen-inducedarthritisandantigen-inducedarthritisinmice.)关节炎与风湿病(ArthritisRheum)1993;36:1305-1314。(5)伍雷(WooleyPH),杜彻(DutcherJ)，维德默尔(WidmerMB)，吉利斯(GillisS).重组人类可溶性肿瘤坏死因子受体FC融合蛋白对小鼠II型胶原诱发的关节炎的影口向。(InfluenceofarecombinanthumansolubletumornecrosisfactorreceptorFCfusionproteinontypeIIcollagen-inducedarthritisinmice.)免疫学期刊(JoumalofImmunology)1993;151:6602-6607。权利要求1、一种治疗或预防关节炎的方法，其包含向有需要的宿主投与可有效治疗或预防关节炎的量的至少一种由式1表示的化合物其中各R各自为H、脂肪族酰基或芳香族酰基；A选自由下列组成的群组其中X选自由下列组成的群组氢、卤基、烷氧基、烷基、卤代烷基、烯基、卤代烯基、炔基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、氰基及硝基。2、如权利要求l所述的方法，其中各R均为H。3、如权利要求1所述的方法，其中A是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>4、如权利要求3所述的方法，其中X是H。5、如权利要求l所述的方法，其中X是H。6、如权利要求1所述的方法，其中所述化合物是l-(4-硫基-P-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶。7、如权利要求1所述的方法，其中所述化合物是l-(4-硫基-P-D-阿拉伯呋喃糖基)氟胞嘧啶。8、如权利要求l所述的方法，其中所述宿主是哺乳动物。9、如权利要求l所述的方法，其中所述宿主是人类。10、如权利要求l所述的方法，其中所述宿主是伴侣动物。11、如权利要求l所述的方法，其中所述关节炎是类风湿性关节炎。12、如权利要求IO所述的方法，其中所述化合物是l-(4-硫基-p-D-阿拉伯呋喃糖基)胞嘧啶。13、如权利要求IO所述的方法，其中所述化合物是l-(4-硫基-P-D-阿拉伯呋喃糖基)氟胞嘧啶。全文摘要本发明是关于由式1表示的化合物，其中各R各自为H、脂肪族酰基或芳香族酰基；A选自由下列组成的群组；且其中X选自由下列组成的群组氢、卤基、烷氧基、烷基、卤代烷基、烯基、卤代烯基、炔基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、氰基及硝基；所述化合物用以治疗或预防关节炎，包括类风湿性关节炎。文档编号A01N43/04GK101641011SQ200880009522公开日2010年2月3日申请日期2008年3月24日优先权日2007年3月23日发明者威廉·R·沃德,屈志参,崔祥民,约翰·A·西克里斯特申请人:南方研究所