专利名称：氮杂胞苷类似物及其用途的制作方法
技术领域：
本申请涉及氮杂胞苷类似物及其用途。
背景技术：
核苷类似物是作为DNA和RNA构建模块的天然核苷的衍生物，其在临床上可有效 治疗人癌症或病毒性疾病，但是在早些年，这些化合物是作为抗结核药被评价的。这些化合 物已经注册上市有40多年，目前大约有35种产品在日常使用。下表1中所示的天然核苷 由两类氮碱基即嘌呤(以腺嘌呤和鸟嘌呤为例)和嘧啶(以胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶为 例)以及单糖核糖或脱氧核糖构成。
天然核苷均以下述式A中所示的所谓3-D构型存在。糖环上氮碱基和羟基甲基侧链均位于所述糖环平面的同侧(顺式)。
式 A为了获得具有抗癌或抗病毒活性的核苷衍生物，已经对氮碱基和/或单糖进行了 化学修饰。例如，在氮碱基中添加卤素原子或其它官能团、插入其它氮原子或者在单糖环中 进行立体化学变化将核糖变成阿拉伯糖或者除去羟基变成脱氧核糖可得到具有潜在治疗 益处的产品。在许多产品中，所述单糖环被保留下来，而在另一些产品中，所述糖环被变成 链。核苷类似物是小分子，易于具有极好的水溶性。由于AIDS世界范围内流行而导致的对核苷类似物领域进行的广泛研究和开发的 努力促进了对作用机制的基本认识和了解，由于化学修饰等引起活性性能的改变也与癌症 治疗领域相关。就现今疑难疾病的治疗而言，包括核苷类似物在内的许多药物的普遍缺点是活性 低、特异性差。一些这些问题可能与药物物质本身的固有活性有关，一些可能与某些耐药机 制(患者固有的或在治疗过程中获得的，例如在癌症治疗中的多药耐药(MDR))有关。一些 问题可能与某些差的转运或细胞吸收和活化机制有关。一些问题可能与药物的快速失活和 /或排泄有关。核苷类似物的效力在很大程度上取决于其模拟天然核苷的能力，从而与病毒和/ 或细胞酶相互作用并且干扰或抑制核酸代谢的关键过程。为了发挥其抗病毒或抗癌活性， 必须通过病毒和/或细胞激酶作用将核苷类似物经由其单磷酸酯和二磷酸酯形式转变为 其相应的三磷酸酯形式。一般来说，所述三磷酸酯形式是活性剂，但对于某些产品例如吉西 他滨而言，甚至二磷酸酯形式就可发挥显著的临床效果。在经肠或经胃肠外施用后，为了到达患病、癌变或病毒感染的细胞或组织，核苷类 似物应当具有有利的药代动力学特征。除了所施用药物被快速排泄以外，许多核苷类似物 可在血流和组织中失活。例如，胞嘧啶衍生物即使在单磷酸水平上也可通过一类称为脱氨 酶的酶的作用而快速脱氨基变成无活性的尿嘧啶类似物。许多核苷类似物的细胞吸收和由 此良好的疗效强烈取决于膜结合核苷转运蛋白(称为富集和平衡型核苷转运蛋白)。因此， 已经在寻找不依赖于这些特异性吸收机制的化合物。但是，另一个活性限制因素(尤其在 抗癌领域内)是细胞修复机制。当抗癌核苷类似物单磷酸酯被掺入到细胞DNA内时，其应 当不被癌细胞DNA除去，这是由于与p53蛋白有关的核酸外切酶活性造成的。然而，为了限 制药物的副作用，除去健康细胞DNA中的核苷类似物是有利的。过去数年中，已经开发出了许多核苷类似物，其在很大程度上克服了一些或许多 活性限制特征。例如，阿昔洛韦(ACV)可作为具有高特异性的化合物的例子给出。ACV单 磷酸酯仅可通过病毒激酶形成，这意味着ACV在未感染细胞内不能被活化。尽管如此，但是 ACV并不是特别有活性的产品。为了避开核苷类似物活化中常见的限速步骤即在细胞内形成核苷类似物单磷酸酯，已经开发出了几种膦酸酯，例如西多福韦或者甚至单磷酸酯产品。 为了促进口服吸收或保证在机体内有利的药物处置，已制备了独特的前药，例如阿德福韦 酉旨(Hepsera)。除了对核苷类似物进行结构改变以促进提高临床应用以外，还进行了进一步修 饰以提高活性。存在几个通过添加脂质部分得到的修饰核苷类似物的实例(美国专利 Nos. 6，153，594,6, 548，486,6, 316，425 和 6，384，019 ；欧洲专利申请 Nos. EP-A-56265 和 EP-A-393920以及W099/26958)。这可通过例如通过酯键、酰胺键、碳酸酯键或氨基甲酸酯 键连接脂肪酸来实现。可制备更复杂的产品，例如核苷类似物的磷脂衍生物。参见Eur J Pharm Sci lib Suppl 2 15-27 (2000)；欧洲专利No. 545966 ；加拿大专利No. 2468099 以及 美国专利Nos. 6，372，725和6，670，341。这些类似物被描述为具有抗病毒活性，尤其适用于 治疗和预防由DNA、RNA或逆转录病毒引起的感染。它们还适用于治疗恶性肿瘤。核苷类似 物的脂质衍生物可用于几种用途。它们可被看作是前药，这些前药不是脱氨酶的底物，从而 保护核苷类似物在血流中的转运过程中免于失活。所述脂质衍生物还可更有效地转运透过 细胞膜，从而提高核苷类似物的细胞内浓度。脂质衍生物还可更适于用在皮肤制剂、口服产 品(参见美国专利No. 6，576，636和W0 01/18013)或特定剂型(例如设计用于靶向肿瘤的 脂质体)(参见美国专利No. 5，223，263)中。已经证明，就具有保守3-D构型的单糖环的核苷类似物或具有非环状侧链的核 苷类似物而言，可通过形成单不饱和《-9C18和C20脂肪酸的脂质衍生物而最有效地提高
夕舌个生。AntimicrobialAgents and Chemotherapy, Vol. ,53-61(1999)； Cancer Research 59 =2944-2949(1999) ；Gene Therapy, 5 419-426(1998) ；Antiviral Research, 45 157-167 (2000)以及 Biochemical Pharmacology，67 :503_511 (2004)。优选 的单不饱和衍生物不仅比多不饱和衍生物活性更好，而且更容易结晶并且对脂质链氧化的 化学稳定性更高。因此，从化学品和药物制备的观点来看，它们是更有利的化合物。还证明， 单不饱和《-9C18和C20脂肪酸适于提高大量非核苷生物活性化合物的治疗活性(参见欧 洲专利 No. 0977725)。核苷类似物的一个相对新的亚类是所谓的氮杂胞苷(aza-C)衍生物。在此类化合 物中，嘧啶碱基中5位上的CH基团与氮原子交换，如下文式B所示。 被DNA异常甲基化导致沉默的肿瘤抑制基因是这些新化疗剂再活化的潜在靶标。 DNA甲基化的强效抑制剂和抗白血病药即氮杂胞苷和5-氮杂-2’-脱氧胞苷衍生物(5-氮 杂-C，5-氮杂-CdR，地西他滨)可使沉默的肿瘤抑制基因再活化。在高浓度下，化合物是细 胞毒性的，但是在浓度较低时，低甲基化导致细胞系分化。所述化合物需要通过脱氧胞苷激 酶进行代谢活化，产生对DNA甲基转移酶的抑制。这些衍生物治疗潜力的一个障碍是它们 在体内被胞苷脱氨酶(CD)快速失活。在水溶液中的不稳定性以及其副作用谱限制了其临床活性。本发明涉及克服现有技术中这些和其它缺点。
发明内容
本发明的一个方面涉及式(I)化合物或其可药用盐 其中R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)，是 其中横虚线表示礼与式(I)分子相连所形成的键，&和民独立地是0H或H，前提 是R2和R3不同时是0H，R4是H、R5C (0)、R5CH20C (0)或R5CH2NHC (0)，前提是R和R4不同时是 H，R5 具有通式 CH3- (CH2) n- (CH = CH-CH2) m_CH = CH_ (CH2) k- ；k 是 0-7 的整数；m 是 0-2 的整 数；n是0-10的整数。本发明的另一个方面涉及含有式(I)化合物和可药用赋形剂、稀释剂和/或载体 的药物组合物。本发明的又一个方面涉及治疗对象的肿瘤性病症的方法。所述方法包括选择患有 肿瘤性病症的对象，以及在有效治疗所述对象中所述肿瘤性病症的条件下向所述对象施用 上文所述的式(I)化合物或其可药用盐。本发明的又一个方面涉及治疗对象的炎性病症的方法。所述方法包括选择患有炎 性病症的对象，以及在有效治疗所述对象中所述炎性病症的条件下向所述对象施用上文所 述的式(I)化合物或其可药用盐。Aza-C在缓冲液和血浆中的不稳定性是众所周知的(参见lsraili等，Cancer Research 36,1453-1461 (1976) ；Rudek 等，J Clin Oncol，23 17，3906-3911 (2005)； Rustum 等，J Chromat，421 12，387-91 (1987) ；Zhao 等，J Chromat B，813，81-88 (2004)，其 全部内容均在此通过弓I用并入本文)。据报道Aza-C在临床血浆样品中的平均终末半衰期为 1. 50士2. 30 小时(参见 Rudek 等，J Clin Oncol, 23 17，3906-3911 (2005)，其全部内容 在此通过引用并入本文)。在体外，即使在-60°C下贮存，4. 5天后损失20%的Aza-C，当在 室温下贮存时，在0. 5小时内损失10% (参见Zhao等，JChromat B，813，81-88 (2004)，其全 部内容在此通过引用并入本文)。认为Aza-C的主要不稳定性是由于5-氮杂-嘧啶环快速 开环(第一个步骤是可逆的)并且随后进行甲酸消除引起的(参见Chan等，J Pharma Sci, 68;7，807-12(1979)，其全部内容在此通过引用并入本文)。认为其它降解途径是4位氨基 进行脱氨并且糖苷键水解得到D-核糖和5-氮杂胞嘧啶。出乎意料地发现优选的Aza-C脂 质衍生物具有比Aza-C本身显著更好的血浆稳定性特性。在室温和实验条件下，所述化合 物在空白人血浆基质中稳定(初始化合物的剩余百分率> 94% )至少4小时，在血浆蛋白 质沉淀后，于提取后上清中未观察到明显的降解产物。还考察了优选的脂质化合物在37°C 下贮存时的血浆稳定性。表明当脂质侧链连接到Aza-C上时，该化合物Aza-部分的开环或 其它降解显著降低。Aza-C的快速降解是Aza_C临床应用的一个缺点。相对于Aza_C本身而言，脂质衍 生物的血浆稳定性提高，可使脂质衍生物的患者血浆水平高且持久。首先，这可导致所述药 物具有比Aza-C本身更好的组织/器官/肿瘤分布，细胞更好地暴露于所述药物并且药物 吸收更好，其次，在Aza-C-5’ -酯键于细胞内水解后，肿瘤细胞DNA更好地暴露于Aza_C。通过对氮杂胞苷和脱氧胞苷(例如5-氮杂-2’ _脱氧胞苷)进行修饰，本发明 的实施方案产生了具有出乎意料地不同于氮杂胞苷和脱氧胞苷(例如5-氮杂-2’ -脱氧 胞苷)的性能的新分子。这产生了一系列活性远远超出氮杂胞苷和脱氧胞苷(例如5-氮 杂_2’ -脱氧胞苷)抗癌活性的化合物，所述氮杂胞苷和脱氧胞苷(例如5-氮杂-2’ -脱 氧胞苷)的抗癌活性局限于血液恶性肿瘤。这些新化合物对许多实体瘤包括乳癌和宫颈癌 具有抗癌效力。所述化合物还出乎意料地对治疗抗性(treatmentresistant)癌症具有活 性，因此可提供在当前治疗选择受限的实体瘤中进行治疗的优点。本发明的实施方案具有 治疗用途，以治疗选择和效力有限的癌症以及满足未能满足的需求。在有限的暴露之后，这些化合物表现出活性起效较早，因此，在临床上可仅在短期 治疗后有效。与母药相比，这将使得治疗暴露更短、更不频繁并且降低了与药物相关的毒 性。这将提供提高的治疗指数。添加脂质(包括酯、酰胺、氨基甲酸酯和碳酸酯)成分的结构改变保留了氮唑胞苷 环，并因此保留了分子对表观遗传学机制的影响。表观遗传学调节为改变癌症和炎症中的 基因表达提供了重要的机制。这些新化合物在低于氮杂胞苷的浓度下具有活性，因此更有 效。活性谱改变的这些化合物可调节实体瘤和炎性疾病中的表观遗传学靶标。表观遗传学机制在促炎性状态中是重要的，所述促炎性状态包括但不限于肺、结 缔组织、胃肠道和脉管系统的炎性状态。这些化合物通过靶向表观遗传学机制可减少或逆 转引起这些疾病的炎性过程。
图1是显示Aza-c和5-AZa-C_5’ -岩芹酸的细胞毒性活性与时间之关系的图。
具体实施例方式本发明的一个方面涉及式(I)化合物或其可药用盐 其中R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)，是 其中横虚线表示礼与式(I)分子相连所形成的键，&和民独立地是0H或H，前提 是R2和R3不同时是0H，R4是H、R5C (0)、R5CH20C (0)或R5CH2NHC (0)，前提是R和R4不同时是 H，R5 具有通式 CH3- (CH2) n- (CH = CH-CH2) m_CH = CH_ (CH2) k- ；k 是 0-7 的整数；m 是 0-2 的整 数；n是0-10的整数。在优选的实施方案中，k是4，n是10。在某些实施方案中，队是 其中横虚线表示礼与式(I)分子相连所形成的键。在某些实施方案中，R4可以是 H。在某些实施方案中，R是R5C(0)，k是4，m是0，n是10，R2是H，R3是0H，R4是H。本发明的更广泛的方面涉及式(I) ’化合物或其可药用盐
其中 R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)，是
nhr4 其中横虚线表示礼与式(I)，分子相连所形成的键，R2和R3独立地是0H或H，前 提是R2和R3不同时是0H，R4是H、R5C (0)、R5CH20C (0)或R5CH2NHC (0)，前提是R和R4不同时
是H，R5是C3-C26烯基。在式(I)’化合物的一个优选实施方案中，k是4，n是10。在某些实施方案中，队 是 其中横虚线表示礼与式(I)’分子相连所形成的键。在一些实施方案中，R4可以 是H。在另一些实施方案中，R是R5C(0)，k是4，m是0，n是10，&是11，R3是0H。在某些 实施方案中，&是(9-(26烯基。本发明的另一个方面涉及含有式(I)化合物和可药用赋形剂、稀释剂和/或载体 的药物组合物。本发明的药剂可口服施用，胃肠外施用，例如，皮下、静脉内、肌内、腹膜内、通过鼻 内吸入或施用于粘膜如鼻粘膜、咽喉粘膜和支气管粘膜。它们可单独施用或与合适的药用 载体一起施用，可以是固体或液体形式，例如片剂、胶囊剂、粉末剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。本发明的活性剂可口服施用，例如与惰性稀释剂或与可吸收的可食用载体一起施 用，或者可将其装在硬壳或软壳胶囊内，或者可将其压成片剂，或者可将其直接掺入膳食食 物中。就口服治疗性施用而言，可在这些活性剂中掺入赋形剂，并以片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂等形式使用。这种组合物和制剂应当含有至少0.1%的活性剂。当然，这些组 合物中药剂的百分数可变化，其可便利地为所述单位的重量的约2% -约60%。这种治疗 有用的组合物中活性剂的量使得可获得合适的剂量。制备本发明的优选组合物使得口服剂 量单位含有约l_250mg的活性剂。片剂、胶囊剂等还可含有粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形 剂，例如磷酸氢钙；崩解剂，例如玉米淀粉，马铃薯淀粉、藻酸；润滑剂，例如硬脂酸镁；以及 甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精。当所述剂量单位形式是胶囊剂时，除了上述类型的物质外， 其还可包含液体载体，例如脂肪油。多种其它物质可作为包衣剂存在或用于改变剂量单位的物理形式。例如，片剂可 用虫胶、糖或者虫胶与糖二者进行包衣。除了活性成分以外，糖浆剂可包含作为甜味剂的蔗 糖、作为防腐剂的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、染料和香精例如樱桃或橙子香精。这些活性剂还可胃肠外施用。可在水中适当地混合表面活性剂例如羟丙基纤维素 来制备这些活性剂的溶液或混悬剂。还可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中在油中制备 分散体。示例性的油是石油，动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。一 般而言，水、盐水、右旋糖水溶液和相关的糖溶液以及二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是优 选的液体载体，尤其是用于注射溶液。在常规贮存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防 止微生物生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体或用于临时制备无菌注射溶 液或分散体的无菌粉末。在所有情形下，所述形式都必须是无菌的并且其流动程度必须达 到易于注射。其在生产和贮存条件下必须稳定，并且必须在不受微生物例如细菌和真菌的 污染作用下保存。所述载体可以是溶剂或者含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇 和液体聚乙二醇)、其合适混合物以及植物油的分散介质。本发明的药剂还可以以气雾剂形式直接施用于气道。就作为气雾剂使用而言，在 溶液或混悬液中的本发明药剂可与合适的抛射剂(例如碳氢化合物抛射剂，如丙烷、丁烷 或异丁烷)以及常规辅助剂一起包装在密闭气雾剂容器中。本发明的物质还可以在非加压 形式(例如喷雾器或雾化器)中施用。本发明的又一个方面涉及治疗对象的肿瘤性病症的方法。所述方法包括选择患有 肿瘤性病症的对象，以及在有效治疗所述对象中的所述肿瘤性病症的条件下向所述对象施 用上文所述的式(I)化合物或其可药用盐。在某些实施方案中，所述肿瘤性病症是癌性疾病。所述癌性疾病可以是实体瘤或 血液癌或恶性肿瘤。所述癌性疾病可以是白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或骨髓增生异常综 合征。在某些实施方案中，所述实体瘤可以是组织的癌症，所述组织为例如乳房、卵巢、 前列腺、脑、膀胱和肺组织。本发明的又一个方面涉及治疗对象的炎性病症的方法。所述方法包括选择患有炎 性病症的对象，以及在有效治疗所述对象中所述炎性病症的条件下向所述对象施用上文所 述的式(I)化合物或其可药用盐。在某些实施方案中，所述炎性病症是肺、结缔组织、胃肠道或脉管系统的炎性状 态。
除非另有定义，否则本申请中所用的科技术语应当具有本领域普通技术人员通常 理解的意义。此外，除非上下文中另有要求，否则未限定具体数量的术语具有“一个或多个” 的含义。实施例实施例1 试剂、细胞系和细胞培养细胞增殖试剂WST-1 得自 Roche Applied Science (Manheim, Germany)，PI 和 Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒购自 BD Biosciences, Palo Alto，CA、5-氮杂胞苷 (5-AzaC)、溴化乙啶(EB)、吖啶橙(AO)、硝基蓝四氮唑(NBT)、佛波醇_12_豆蔻酸酯-13-乙 酸酯(TPA)购自 SigmaChemical Co (St. Lous，M0)。人早幼粒细胞白血病细胞系HL60、人组织细胞淋巴瘤U937、人慢性髓细胞白血病 K562、人急性T细胞Jurkat、乳腺癌MCF-7、膀胱癌5637、前列腺癌DU-145购自American Type Culture Collection。除Jurkat以外的所有细胞系均维持在37°C、5% C02气氛下的 RPMI 1640培养基(Gibco，Glasgow. UK)中，所述RPMI 1640培养基添加有10%热灭活胎 牛血清(FCS)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。Jurkat细胞培养在RPMI 1640培养基 中，所述RPMI 1640培养基添加有1. 5g/L碳酸氢钠、4. 5g/L葡萄糖、10mM丙酮酸钠和10% FCSU00U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。实施例2 细胞毒性测定基于活细胞中线粒体脱氢酶断裂四唑盐WST-l(4-[3_(4-碘代苯基)-2-(4_硝基 苯基)-2H-5-四唑啉基]-1，3-苯二磺酸盐)，通过比色检测法测定5-氮杂胞苷脂质的细胞 毒性。将细胞以 1 X 106/ml (HL60 细胞)或 1. 25X 105/ml (U937、K562 和 Jurkat)的初始浓 度接种在96孔平底微量板中的培养基中并培养24-72小时，所述培养基含有或不含有不同 浓度的5-氮杂胞苷脂质。将MCF-7、DU-145和5637细胞(lX104/ml)铺板并使其贴壁铺 展24小时。加入不同浓度的5-氮杂胞苷脂质，再维持培养24-72小时。将培养物与WST-1 试剂一起孵育1小时。利用酶标仪(Bio-Tek Instruments, Elx 800)于450nm(参比波长 为650nm)测量甲臜的产生。测定相比于未处理细胞的生长抑制(％)。利用CalcuSyn软 件(Biosoft)计算 IC5Q 值。实施例3 凋亡细胞的定量采用形态学标准和利用Armexin V-FITC染色后的荧光激活细胞分选(FACS)鉴定 凋亡细胞。就形态学分析而言，将含有100 u g/ml AO和100 u g/ml EB的1 yl储备液加到 25 yl细胞悬液中。借助荧光显微镜分析凋亡细胞和凋亡体。计数总共300个细胞后，计算 凋亡细胞的百分率。就FACS分析而言，用PBS清洗2 X 105至5 X 106个细胞，然后根据制造 商提供的Armexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书，利用ArmexinV-FICS和碘化丙啶(PI) 在结合培养基的试剂中标记所述细胞。在FACSCAN(Becton Dickinson, San Jose，CA)上分 别于518nm和620nm处检测FITC和PI的荧光信号。Annexin V-FITC荧光的对数值显示在 X轴上，PI荧光的对数值显示在Y轴上。通过CellQuest程序(Becton Dickinson)分析数 据。对于每个分析来说，记录10000个细胞事件。实施例4 细胞周期通过离心沉淀细胞，用PBS清洗两次，用70% (v/v)冷乙醇(_20°C )固定并于4°C 贮存至少24小时。在PBS中清洗细胞。将细胞团块用PI/RNA酶染色溶液染色。将细胞混
14悬液于黑暗中在室温下孵育30分钟。利用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson, Mount View, CA)测定DNA含量。利用DNA柱形图拟合程序(Becton Dickinson)测定处于 细胞周期中亚Gl、Gp S和G2ZM期细胞的百分数。每个样品最少记录10000个事件。实施例5 :Aza-C-5 ’-岩芹酸酯的合成将岩芹酸(1. 75mmol,494mg)溶解在甲苯(3ml)中。加入DMF(10 μ 1)，然后于室温 下用10分钟加入草酰氯(3. 6mmol,457mg)。3小时后，真空下除去甲苯。 将六2&-((1.57讓01，42711^)混悬在DMA(6ml)中，加入 HCl (1M，在 Et2O 中，2. Ommol， 2. Oml)，5分钟后在室温下于真空中除去Et20。将所得混浊溶液于冰水浴中冷却，用40分 钟加入溶解在DMA(2ml)中的酰氯。搅拌反应混合物过夜，同时温度慢慢达到室温。24小时 后，在大约0. Imbar下除去溶剂。将残留物在饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯(各25ml) 之间分配。水相用乙酸乙酯萃取(3X25ml)。合并有机相，用盐水清洗，干燥(MgSO4)。真空 下除去溶剂后，将粗产物(600mg)通过快速色谱(Si02，CH2Cl2以及2. 5%、5%和10% MeOH) 纯化。最后，在大约0. 25mbar下干燥产物过夜。产率210mg(24% )。实施例6 :Aza-C-5'-反式岩芹酸酯的合成将反式岩芹酸(petroselaidicacid) (1. 77mmol, 500mg)溶解在甲苯(3ml)中。力口 入DMF (10 μ 1)，然后于室温下用10分钟加入草酰氯(3. 6mmol，457mg)。3小时后，真空下除
去甲苯。将六2&-((1.75讓01，42711^)混悬在DMA(6ml)中，加入 HCl (1M，在 Et2O 中，2. Ommol， 2. 0ml)，5分钟后在室温下于真空中除去Et20。将所得混浊溶液于冰水浴中冷却，用2小 时加入溶解在DMA(2ml)中的酰氯。搅拌反应混合物过夜，同时温度慢慢达到室温，然后 在30°C加热2小时。冷却至室温后，将所得残留物在饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯(各 25ml)之间分配。水相用乙酸乙酯萃取(3X25ml)。合并有机相，用水和盐水清洗，干燥 (MgSO4) 0真空下除去溶剂后，得到酯，为白色粉末。产率500mg。实施例7 :5-Aza-5'-岩芹酸酯在合并人血浆中的代谢稳定性将5种浓度水平(分别为0. 1、1、3、10以及30 μ M)的5-Aza-C-5，-岩芹酸酯加 到混合的人血浆中。将混合物在37°C下于摇动的水浴中孵育。在设定的孵育时间(0、15、 30、60和120分钟)取等量份(100 μ 1)的孵育溶液一式三份(η = 3)，用含有0. 甲酸 (300 μ 1)的乙腈立即沉淀血浆蛋白。用测试化合物和Aza-C在测试缓冲液(PBS，ρΗ 7.4) 中以一个孵育浓度(IyM)制备阴性对照。离心后，将上清直接用于LC-MS-MS分析。参见 表1。 表 1实施例8 :Aza-C和5-Aza-C_5，-岩芹酸的细胞毒性在乳腺癌细胞系MT-3和阿霉素(adriablastin)抗性细胞系MT-3/ADR中测定 Aza-C和5-Aza-C-5，-岩芹酸的细胞毒性。MT-3/ADR过量表达MDR-1/p-糖蛋白。将细胞接 种在96孔板中含有2mM谷氨酸盐和10% FBS的RPMI 1640培养基中，其中每孔含有5 X 103 个细胞。将所述细胞孵育24小时。将测试化合物溶解在DMS0中并在使用前在培养基中进 一步稀释。每个测试浓度使用6个孔。将细胞与测试化合物一起孵育24小时。将20 yl新 鲜制备的MTT溶液加到每个孔中并孵育4小时。由根据0. 01 ii M至100 ii M的8个不同浓 度绘图得到的生长曲线来测定IC50值。结果示于表1中。在MT-3乳腺癌细胞系中，Aza-C 和5-Aza-C-5’ -岩芹酸的活性相似，但是在MT-3/ADR抗性细胞系中，Aza-C的活性丧失。 在所测试的高达100 u M的浓度下未观察到活性，而5-Aza-C-5’-岩芹酸在抗性细胞系与非 抗性MT-3细胞系中均保持活性，具有相似的IC50值。参见表2。 表2实施例9 Aza-C和5-Aza-C-5’ -岩芹酸的抗增殖活性在Hela突变宫颈癌细胞系中在暴露24小时和72小时时测定Aza_C和 5-Aza-C-5，-岩芹酸的抗增殖活性。将细胞接种在96孔板中含有2mM谷氨酰胺和10% FBS 的RPMI 1640培养基中，其中每孔含有5X 103个细胞。将所述细胞孵育24和72小时。将 测试化合物溶解在DMS0中并在使用前在培养基中进一步稀释。每个测试浓度使用6个孔。 利用MTT法测定细胞毒性。将20 yl新鲜制备的MTT溶液加到每个孔中并孵育4小时。由根 据0. 01 y M至100 y M的8个不同浓度绘图得到的生长曲线来测定IC50值。长期暴露于两 种化合物72小时得到相似的细胞毒活性，但是出乎意料地，暴露24小时后，5-Aza-C-5’-岩 芹酸的细胞毒作用已经存在。观察到Aza-C和5-Aza-C-5’ -岩芹酸具有不同的时间曲线，其中5-Aza-C-5’ -岩芹酸的细胞毒作用快速出现。参见图1。
实施例10 核苷转运蛋白抑制对Aza-C和5-Aza-C-5’-岩芹酸在癌细胞中的细胞 毒活性的影响评价了核苷转运蛋白抑制对Aza-C和5-Aza-C-5，-岩芹酸在癌细胞中的细胞毒性 活性的影响。双嘧达莫用作平衡型核苷转运蛋白hENTl和hENT2的抑制剂。将细胞接种在 96孔板中含有2mM谷氨酰胺和10% FBS的RPMI 1640培养基中，其中每孔含有5 X IO3个 细胞。将所述细胞预先孵育24小时。在加入测试化合物之前30分钟，将双嘧达莫(10 μ M) 加到所述细胞中。将测试化合物溶解在DMSO中并在使用前在培养基中进一步稀释。每个 测试浓度使用6个孔。将所述细胞与测试化合物一起孵育72小时。将20 μ 1新鲜制备的 MTT溶液加到每个孔中并孵育4小时。由根据0. 01 μ M到100 μ M的8个不同浓度绘图得到 的生长曲线来测定IC50值。结果示于表3中。加入核苷转运抑制剂双嘧达莫使Aza-C的 活性降低3倍，表明Aza-C在Hela细胞中的流入和流出部分取决于核苷转运蛋白hENTl和 hENT2。当利用双嘧达莫阻滞核苷转运蛋白hENTl和hENT2时，5-Aza-C-5，-岩芹酸的细胞 毒活性不但得以维持而且提高了 10倍。这可能对于其中由于缺少核苷转运蛋白的表达而 造成Aza-C无活性的患者尤其重要。参见表3。
Aza-C和5-Aza-C-5，-岩芹酸在舍有或 不含有核苷转运抑制剂双嘧达莫的He Ia 宫颈癌细胞中的细胞毒活性 表3实施例11 利用氮杂胞苷或5-Aza-C-5’-岩芹酸处理后乳腺癌细胞系中雌激素受 体β (ERβ)的基因表达通过定量实时PCR(TaqMan)测定了雌激素受体β的基因表达(在RNA水平上测 定)。MCF-7乳腺癌细胞在缺乏雌激素的培养基(不含酚红的RPMI，含有2%谷氨酰胺和 10%炭-右旋糖酐处理的胎牛血清)中培养。将细胞接种在25cm2的培养瓶中并贴壁24小 时，然后用ΙμΜ氮杂胞苷或5-Aza-C-5’ -岩芹酸处理。包括一个未处理的对照作为对照。 暴露于所述化合物5天后收获细胞，通过胰蛋白酶消化来收获细胞，将其清洗并快速冷冻 在液氮中。从约IO6个快速冷冻的MCF-7细胞中提取总RNA，测量所述RNA的浓度和纯度，利 用TaqMan反转录试剂(N808-0234)将RNA转录成cDNA。利用标准方案和预混PCR试剂进 行实时定量。引物-探针混合物购自Applied Biosystems,ER^ (ID Hs00230957_ml)和管 家基因羟甲基原胆色烷合成酶HMBS (ID Hs00609297_ml)。利用比较Δ-ACt法计算基因表 达。暴露于5-Aza-C-5’ -岩芹酸后，诱导ERi3表达升高4. 14倍，而暴露于氮杂胞苷后仅 仅升高2. 51倍，参见表4。这可能与其中激素敏感性可被恢复的激素难治疗性肿瘤高度相 关，参见表4。
虽然本文中已经详细地描述和叙述了优选的实施方案，但是对于相关领域技术人员显而易见的是，可在不背离本发明精神的情况下进行各种改动、增加、替换等，并且因此 这些改动、增加、替换等被认为包含在下述权利要求中所定义的本发明范围内。
权利要求
式(I)化合物或其可药用盐其中R是H、R5C(O)、R5CH2OC(O)或R5CH2NHC(O)，R1是其中横虚线表示R1与式(I)分子相连所形成的键；R2和R3独立地是OH或H，前提是R2和R3不同时是OH；R4是H、R5C(O)、R5CH2OC(O)或R5CH2NHC(O)，前提是R和R4不同时是H；以及R5具有通式CH3-(CH2)n-(CH＝CH-CH2)m-CH＝CH-(CH2)k-；k是0-7的整数；m是0-2的整数；以及n是0-10的整数。FPA00001068276200011.tif,FPA00001068276200012.tif
2.权利要求1的化合物，其中k是4。
3.权利要求2的化合物，其中n是10。
4.权利要求1的化合物，其中队是
5.权利要求4的化合物，其中R4是H。
6.权利要求1的化合物，其中R是R5C(0)，是 R2是H，R3是0H，R4是H，k是4，m是0以及n是10。
7.—种药物组合物，其含有权利要求1的化合物和可药用赋形剂、稀释剂和/或载体。
8.一种治疗对象的肿瘤性病症的方法，所述方法包括 选择患有肿瘤性病症的对象，以及在有效治疗所述对象中所述肿瘤性病症的条件下向所述对象施用下式化合物或其可 药用盐 其中，R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)； 队是 其中横虚线表示礼与式(I)分子相连所形成的键；R2和R3独立地是0H或H，前提是R2和R3不同时是0H ；R4 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)，前提是 R 和 R4 不同时是 H ；以及R5 具有通式 CH3-(CH2)n-(CH = CH-CH2)m-CH = CH-(CH2)k-；k是0-7的整数；m是0-2的整数；以及n是0-10的整数。
9.权利要求8的方法，其中所述肿瘤性病症是癌性疾病。
10.权利要求9的方法，其中所述癌性疾病是实体瘤或血液癌或恶性肿瘤。
11.权利要求9的方法，其中所述癌性疾病是白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或或骨髓 增生异常综合征。
12.权利要求10的方法，其中所述实体瘤是选自乳房、卵巢、前列腺、脑、膀胱和肺的组 织的癌症。
13.权利要求8的方法，其中k是4。
14.权利要求13的方法，其中n是10。
15.权利要求8的方法，其中队是
16.权利要求15的方法，其中R4是H。
17.权利要求8的方法，其中R是 R2是H，R3是0H，R4是H，k是4，m是0以及n是10。
18. 一种治疗对象炎性病症的方法，所述方法包括 选择患有炎性病症的对象，以及在有效治疗所述对象中所述炎性病症的条件下向所述对象施用下式化合物或其可药 用4k 其中，R 是 H、R5C (0)、R5CH20C (0)或 R5CH2NHC (0)； 队是 其中横虚线表示R1与式(I)分子相连所形成的键；R2和R3独立地是OH或H，前提是R2和R3不同时是OH ；R4 是 H、R5C (0)、R5CH2OC (0)或 R5CH2NHC (0)，前提是 R 和 R4 不同时是 H ；以及R5 是 C3-C26 烯基，其中 R5 具有通式 CH3-(CH2)n-(CH = CH-CH2) m_CH = CH-(CH2)k-；k是0-7的整数；m是0-2的整数；以及η是0-10的整数。
19.权利要求18的方法，其中所述炎性病症是肺、结缔组织、胃肠道或脉管系统的炎性 状态。
20.权利要求18的方法，其中k是4。
21.权利要求20的方法，其中η是10。
22.权利要求18的方法，其中R1是
23.权利要求22的方法，其中R4是H。
24.权利要求18的方法，其中R是R5C(O)，R1是 R2是H，R3是0Η，R4是H，k是4，m是0以及η是10。
全文摘要
本发明涉及如下的式(I)化合物或其可药用盐其中R是H、R5C(O)、R5CH2OC(O)或R5CH2NHC(O)；R1是其中横虚线表示R1与式(I)分子相连所形成的键；R2和R3独立地是OH或H，前提是R2和R3不同时是OH；R4是H、R5C(O)、R5CH2OC(O)或R5CH2NHC(O)，前提是R和R4不同时是H；R5具有通式CH3-(CH2)n-(CH＝CH-CH2)m-CH＝CH-(CH2)K-；k是0-7的整数；m是0-2的整数；n是0-10的整数。本发明还公开了制备和使用这些化合物的方法。
文档编号A01N43/04GK101877964SQ200880108555
公开日2010年11月3日 申请日期2008年9月25日 优先权日2007年9月26日
发明者刘易斯·西尔弗曼, 奥勒·亨利克·埃里克森, 芬恩·米伦, 詹姆斯·霍兰, 马里特·利兰·桑德沃尔德 申请人:西乃山医学院;克拉维斯制药股份有限公司