专利名称：一种用于防治植物病毒病的组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于防治植物病毒病的组合物，具体地说，涉及一种由虎杖提取液及植物源表面活性剂组成的具有抑制植物病毒作用的植物源组合物。
背景技术：
植物病毒病是一种极为严重的植物病害，且防治困难，素有“植物癌症”之称。植物病毒病害的爆发流行十分广泛，灾害严重，几乎所有蔬菜、粮食作物、果木等都能感染病毒病，进而降低产品品质，甚至能导致其它植物生理性病害的发生，使得农业生产受到巨大的损失。据统计，全世界每年因植物病毒病危害造成的直接损失达150亿美元以上。我国每年有许多重要的经济作物，如烟草、花卉和多种蔬菜作物等感染植物病毒，因病毒病造成的直接经济损失高达10亿美元以上。
植物的病毒危害与其它病原物有着显著的差异病毒粒体借助其它因素(如昆虫、人为或自然因素)造成的伤口等进入植物体内，利用植物细胞的信息、能量和酶系统，在寄主细胞中进行核酸(RNA或DNA)和蛋白质外壳的复制，组成新的病毒粒体，完成病毒自身的复制与增殖，还能够在维管束中随植物的营养流动方向迅速转移，使植物周身发病，植物病毒的这种增殖机制给病毒病的防治带来了极大的困难。植物病毒除夺取受侵染植物营养外，其主要危害在于能够改变寄主植物的正常代谢过程，干扰或破坏其呼吸作用、光合作用、酶的活性，以及生长素和其他激素的代谢等。
目前，植物病毒病的防治主要有以下几种措施 1、利用已有的抗源材料植物产生的能抵御某些病原物的特殊性状，将其稳定并遗传给子代，然后直接利用这些抗病特性，培育出符合实际生产需要的抗病毒品种。但是该方法育种周期长，而且抗性与产量、品质等性状很难协调统一。
2、利用化学药剂控制植物病毒病，如利用杀虫剂杀死传毒昆虫介体，对防治某些病毒病有一定的效果；或者用某些抗生素(如宁南霉素等)作为植物病毒抑制剂抑制病毒。但前者耗费大量人力、物力和时间，而且对非持久性传播的病毒防治效果较差；而目前有效的植物病毒抑制剂实用化品种很少，具有特效的治疗性药剂更少，此外化学药剂还存在毒性较高、易产生药害，对环境污染严重等缺点。
3、通过组织脱毒法获得无病毒病种植材料，即，将未被病毒侵染的植物组织材料(如茎尖，芽尖等)，通过组织培养获得大量无病毒的健康苗，而后再移栽到大田。该方法主要适用于无性繁殖的农作物，但是其成本高，工作量大，而且易发生田间的再侵染，使得植株的无毒期不长，二三年后就会“旧病复发”，具有一定的局限性。
4、抗病毒植物基因工程，即利用植物抗病毒基因，经过一定的修饰改造后转入植物细胞，使其获得抗病毒性，并培育成完整植株，即转基因植物。但该方法成本高，过程复杂，可操作性差，因此实施较少。
此外，我国自20世纪80年代初开始，陆续研制开发出了高脂膜、NS-83增抗剂、病毒A、植病灵和菌毒清等产品。但是，上述产品虽然在植物病毒防治上取得了一定的效果，但也存在活性较低、毒性高、易产生药害、开发技术不成熟、成本高等缺点，其应用受到了限制。
为了解决上述问题，本发明人以虎杖提取液为活性组分，配以植物源表面活性剂，组成具有抗病毒活性高、低毒、低残留且对环境友好的植物源组合物。
虎杖(Polygonum cuspidatum)，蓼科蓼属，是一种常用的中草药，用于治疗霉菌感染、多种皮肤炎症，心血管疾病和肝脏疾病等，其具有消肿止痛、清热去湿、祛毒祛痰、抗微生物等作用。但是将虎杖提取物作为植物病毒抑制剂，用于抑制植物病毒则未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于防治植物病毒病的植物源组合物，该组合物活性高，且低毒、低残留、对环境友好。
本发明的另一目的在于提供所述组合物的应用。
为了实现本发明的目的，本发明的一种用于防治植物病毒病的组合物，其由重量比为1～6∶2～9的A、B两种组分组成； 其中，所述组分A为虎杖提取液；所述组分B为植物源表面活性剂，其由如下重量百分数的原料组成植物蛋白氨基酸液10％～40％、皂角提取液20％～50％、茶皂素补至100％。
优选的是，所述组合物由重量比为5∶2～3的A、B两种组分组成； 其中，所述组分A为虎杖提取液，所述组分B为植物源表面活性剂，其由如下重量百分数的原料组成植物蛋白氨基酸液25％、皂角提取液30％～45％、茶皂素补至100％。
本发明所述的虎杖提取液通过如下步骤制备将虎杖用乙醇浸泡后，超声提取，离心取上清液，去除溶剂后，用乙醇定容至虎杖重量的2倍。
具体地说，虎杖与乙醇的重量比为1～5∶5～10，浸泡时间为1～5h，在45℃温度下超声提取1～5h，所述乙醇优选为70％乙醇。此外，去除溶剂时的温度应不高于45℃。
本发明所述的植物蛋白氨基酸液是将植物蛋白在碱性条件(pH＝10～12)下水解制得的氨基酸液，其重量百分比浓度为1％～90％。
所述植物蛋白优选为大豆蛋白。
本发明所述的皂角提取液为水提液，通过市售得到，其重量百分比浓度为1％～90％。
本发明组合物以虎杖提取液为活性组分，该提取液中主要含有大黄素、白藜芦醇、蒽醌甙、3，4′，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖甙、鞣质及多种多糖等多种成分，其中，主要功能成分有大黄素和白藜芦醇。大黄素能抑制植物体内烟草花叶病毒病(TMV)、黄瓜花叶病毒病(CMV)或马铃薯Y病毒(PVY)等多种病毒的增殖，同时还能显著提高烟草植株体内过氧化物酶的活性，增强植物对病毒的抵抗力；白藜芦醇对植物病毒具有良好的化学预防能力，因此虎杖提取液具有较好的预防和治疗植物病毒病的作用。
进一步地，本发明将上述虎杖提取液按一定比例与植物源表面活性剂相配合，所述植物源表面活性剂是由植物蛋白氨基酸液、皂角提取液、茶皂素按一定配比组成。其中，所述植物蛋白氨基酸液为大豆等植物蛋白水解后的水解液，其主要成分包括赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸等多种游离氨基酸及部分小肽，这些成分以游离态存在于溶液中，更易被植物细胞吸收，能够增强植物细胞的耐病力；所述皂角提取液是一种植物表面活性剂，具有降低药液的表面张力、提高药剂在受药表面的附着性和沉积量的作用，从而提高有效成分在有水分条件下的释放速度和扩展面积，提高防病、治病效果；所述茶皂素具有提高药液在植物体表的附着力，起到对药物的协同增效作用。
本发明的组合物在预防、治疗植物病毒病方面的应用。
所述应用为虎杖提取液与植物源表面活性剂的组合物与制剂用载体制成植物病毒抑制剂。
所述植物病毒抑制剂为水剂，其按重量百分数的组成为组分A10％～60％、组分B 20％～30％、水补至100％。
优选组成为组分A 50％、组分B 20％～30％、水补至100％。
特别地，在使用本发明组合物制备植物病毒抑制剂时，优选制成水剂。这是因为在制备颗粒剂、散剂等剂型的过程中，需要经过干燥步骤，而干燥时的高温会破坏虎杖提取液、植物源表面活性剂中的有效成分，从而降低其对植物病毒病的防治效果。
本发明的优点在于，本发明的用于防治植物病毒病的组合物，其组分均来源于植物，能在自然界中降解，不会污染环境及农产品，难以在环境和人体中积累毒性，对人和牲畜相对安全，具有低毒、低残留的特点，且能够保持农产品的高品质；通过虎杖提取液与植物源表面活性剂复配，使得组合物具有良好的协同增效作用，活性高、效果显著，使用方便，能够高效预防和治疗多种植物病毒病。
具体实施例方式 以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1植物病毒抑制剂水剂(KBD水剂)的制备 1、组分A的制备取2.5公斤虎杖，粉碎至60目加入12.5公斤70％乙醇，浸泡2h后，在45℃温度下超声提取2h，离心取上清液，在45℃温度下去除溶剂，用70％乙醇定容至5公斤，制得虎杖提取液(组分A)，备用。
2、组分B的制备取2公斤大豆在pH＝11的碱性条件下水解，得到4公斤植物蛋白水解液，即植物蛋白氨基酸液，然后加入5公斤皂角提取液及1公斤茶皂素(注皂角提取液及茶皂素均为浙江东方茶业科技有限公司生产)，混合均匀，制得植物源表面活性剂(组分B)。
3、植物病毒抑制剂的制备将5份组分A、3份组分B、2份水混合，制成10公斤水剂KBD。
实施例2 1、组分A的制备取1公斤虎杖，粉碎至60目加入10公斤70％乙醇，浸泡1h后，在45℃温度下超声提取5h，离心取上清液，在45℃温度下去除溶剂，用70％乙醇定容至2公斤，制得虎杖提取液(组分A)，备用。
2、组分B的制备取2公斤大豆在pH＝10的碱性条件下水解，得到5公斤植物蛋白水解液，即植物蛋白氨基酸液，然后加入6公斤皂角提取液及9公斤茶皂素(注皂角提取液及茶皂素均为浙江东方茶业科技有限公司生产)，混合均匀，制得植物源表面活性剂(组分B)。
3、植物病毒抑制剂的制备将1份组分A、3份组分B、6份水混合，制成10公斤水剂KBD。
实施例3 1、组分A的制备取1公斤虎杖，粉碎至60目加入5公斤70％乙醇，浸泡5h后，在45℃温度下超声提取2h，离心取上清液，在45℃温度下去除溶剂，用70％乙醇定容至2公斤，制得虎杖提取液(组分A)，备用。
2、组分B的制备取2公斤大豆在pH＝12的碱性条件下水解，得到4公斤植物蛋白水解液，即植物蛋白氨基酸液，然后加入2公斤皂角提取液及4公斤茶皂素(注皂角提取液及茶皂素均为浙江东方茶业科技有限公司生产)，混合均匀，制得植物源表面活性剂(组分B)。
3、植物病毒抑制剂的制备将6份组分A、2份组分B、2份水混合，制成10公斤水剂KBD。
以下通过实验来进一步说明本发明。
实验例1虎杖提取液单剂与组合物水剂抑制TMV病毒的对比试验1试验材料 按实施例1方法制备的虎杖提取液(组分A单剂)、实施例1的植物病毒抑制剂水剂(KBD水剂)、新叶烟苗(Nicotiana glutinosa)、烟草花叶病毒病(TMV)。
2防治TMV病毒药效实验 2.1试验方法 1、将新叶烟苗用摩擦接种法接种TMV病毒，待其发病后选择病毒病害显症同等级别的烟苗，随机分为虎杖提取液200倍组、虎杖提取液500倍组、KBD水剂200倍组、KBD水剂500倍组及对照组，每组30株烟苗。
2、将虎杖提取液、KBD水剂分别用清水稀释200倍、500倍(按重量比稀释)，按组别均匀喷洒发病烟苗叶面，对照组喷洒清水，24小时后测定烟苗叶片内病毒浓度。
3、用间接酶联免疫吸附法测定烟苗叶片内TMV病毒浓度 用0.04M，pH＝9.5的碳酸盐包被缓冲液(Na2CO3及NaHCO3)，封闭液为0.2％(体积分数)血清蛋白抗血清，工作浓度为1∶1200倍，用磷酸酶标记A蛋白检测TMV与TMV抗血清的特异性免疫反应，以硝基苯磷酸作底物，在25℃培养箱恒温放置3小时，显色后，用DG-3021A敏联免疫吸附仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)测定并记录OD值，结果如表1所示。
表1 防治TMV病毒药效实验结果
2.2结果分析 从表1可以看出，KBD水剂200倍组的病毒浓度下降77.88％，虎杖提取液200倍组的病毒浓度下降47.85％，KBD水剂(组合物)比虎杖提取液单剂的防效高1.6倍；结果表明，本发明的虎杖提取液与植物源表面活性剂按一定比例复配后，植物源表面活性剂起到极大的增效作用，与虎杖提取液单剂相比，本发明的组合物对防治TMV病毒的活性显著提高。
实验例2温室生测药效试验 1、试验条件 供试病毒烟草花叶病毒病(TMV)、黄瓜花叶病毒病(CMV) 供试作物辣椒(茄门) 2、分组方法和药剂用量 在温室中，将生长至3叶期的辣椒植株随机分为空白对照组、药剂对照组及5个不同浓度处理组共7组，每组10株苗，重复3次。空白对照组喷施水、药剂对照组喷施2％宁南霉素水剂(菌克毒克，黑龙江强尔生化技术开发有限公司)、处理组喷施实施例1的植物病毒抑制剂水剂(KBD水剂)，各组于2009年11月11日进行喷雾处理，施药4小时后摩擦接种病毒，各组施药剂量如表2所示。
表2 各组施药剂量
3、调查方法及分级标准 接种病毒后按常规管理培养，于2009年12月5日调查接种株发病情况，记载病情级别，估算其严重度，计算出病情指数(DI)。病情分级标准如表3所示。
表3 病情分级标准 4、结果与分析 KBD水剂对TMV、CMV的防治效果如表4所示。
表4 KBD防治TMV、CMV试验结果
注防效＝(对照处理平均病情指数-药剂处理平均病情指数)/对照处理平均病情指数×100％；表中同列数据后标有相同字母者，表示在0.05水平下差异不显著(LSD法) 由表4可以看出，不同浓度的KBD水剂均可防治由TMV、CMV侵染辣椒引起的病毒病，特别是在稀释浓度小于400倍时，KBD水剂的防治效果接近50％，显著优于对照药剂宁南霉素。
实验例3 田间药效试验 1、试验条件 试验地点中国农业科学院烟草研究所即墨试验站。
试验作物云烟85(烟草)。
防治对象烟草花叶病毒病(TMV)。
环境条件土壤类型为淋溶褐土，肥力中等；试验期间气象条件为多云转晴。2009年4月22日播种，2009年5月24日移栽前人工接种病毒，2009年6月2日移栽时施药，株距为50cm，行距为100cm，田间历年烟草病毒病的发生危害严重。
2、试验安排与设计 分组安排随机分为5个小区，每小区50株烟苗，3次重复。
喷施药剂、药量3个不同浓度处理组喷施实施例1的植物病毒抑制剂水剂(KBD水剂)，分别按重量比稀释200倍、400倍和600倍；药剂对照组喷施按重量比稀释200倍的2％宁南霉素水剂(黑龙江强尔生化技术开发有限公司)；空白对照组喷施水。
喷施时间在病害始发期，于2009年6月2日进行第一次叶面喷雾施药，每隔7天施药1次，施药3次。
调查方法与病情分级标准于2009年6月30日调查接种株发病情况，记载病情级别，估算出严重度并计算出病情指数(DI)。病情分级标准如表5所示。
表5 病情分级标准 3、试验结果与分析 3次施药后14天，烟草病毒病的病情指数及KBD水剂对TMV的防治效果如表6所示。
表6 3次施药后烟草病毒病的病情指数及KBD水剂的防治效果
注表中同列数据后标有相同字母者，表示在0.05水平下差异不显著(LSD法) 由表6可以看出，不同浓度的KBD水剂均可防治烟草病毒病TMV，其中以稀释200倍对烟草病毒病TMV的防治效果最好，防治效果达48％以上，显著优于其他浓度的KBD水剂，并且在相同的使用稀释倍数下，KBD水剂防治效果明显优于已得到市场承认的2％宁南霉素水剂，KBD水剂稀释200～500倍后使用对作物无不良影响，安全无药害。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及药效实验对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种用于防治植物病毒病的组合物，其特征在于，其由重量比为1～6∶2～9的A、B两种组分组成；
其中，所述组分A为虎杖提取液；所述组分B为植物源表面活性剂，其由如下重量百分数的原料组成植物蛋白氨基酸液10％～40％、皂角提取液20％～50％、茶皂素补至100％。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，其由重量比为5∶2～3的A、B两种组分组成；
其中，所述组分A为虎杖提取液，所述组分B为植物源表面活性剂，其由如下重量百分数的原料组成植物蛋白氨基酸液25％、皂角提取液30％～45％、茶皂素补至100％。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述虎杖提取液通过如下步骤制备将虎杖用乙醇浸泡后，超声提取，离心取上清液，去除溶剂后，用乙醇定容至虎杖重量的2倍。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，虎杖与乙醇的重量比为1～5∶5～10，浸泡时间为1～5h，在45℃温度下超声提取1～5h，所述乙醇为70％乙醇。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述植物蛋白氨基酸液是将植物蛋白在碱性条件下水解制得的氨基酸液，其重量百分比浓度为1％～90％。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述植物蛋白为大豆蛋白。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述皂角提取液为水提液，其重量百分比浓度为1％～90％。
8.权利要求1-7任意一项所述组合物在预防、治疗植物病毒病方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其为与制剂用载体制成植物病毒抑制剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物病毒抑制剂为水剂，其按重量百分数的组成为组分A 10％～60％、组分B20％～30％、水补至100％。
全文摘要
本发明提供了一种用于防治植物病毒病的组合物，其由重量比1～6∶2～9的A、B两种组分组成；其中，所述组分A为虎杖提取液；所述组分B为植物源表面活性剂，其由如下重量百分数的原料组成植物蛋白氨基酸液10％～40％、皂角提取液20％～50％、茶皂素补至100％。本发明的用于防治植物病毒病的组合物，其组分均来源于植物，能在自然界中降解，不会污染环境及农产品，同时难以在环境和人体中积累毒性，对人和牲畜相对安全，具有低毒、低残留的特点，能够保持农产品的高品质；且活性高、效果显著，使用方便，能够高效预防和治疗多种植物病毒病。
文档编号A01P1/00GK101766195SQ20101010382
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者邢福铭, 马玉海, 朱健伟, 徐向荣 申请人:北京清源保生物科技有限公司