专利名称：一种油葵的基因转化方法
技术领域：
本发明属于农业和植物育种领域，尤其是一种油葵的基因转化方法。
背景技术：
油用向日葵(简称油葵)是近30年来总产量增长最快的世界三大油料作物之一， 年增长率7. 1%，世界上油葵的主产国是阿根廷、法国、其次是中国。我国的油葵主要集中在 东北三省、内蒙古、新疆和正在迅速发展的陕西、山西和河北等省、自治区。油葵的籽实含油 率一股在46%左右，高的可达50%以上，出油率在42%以上。油葵油不含芥酸、硫代葡萄 糖甙等对人体有害的物质，但含有丰富的对人体非常有益的不饱和脂肪酸，其中亚油酸含 量65%左右，油酸25%左在，亚油酸能调节新陈代谢、维持血压平衡、能溶解脱离沉积在肠 壁上的多余胆固醇，因而可降低血压、预防动脉硬化。由于含有和亚油酸比例相当的维生素 E，可阻止亚油酸的迅速氧化。另外还含有大量的维生素A、类胡罗卜素等人体必需的营养物 质，在促进毛细血管增生、改善血液循环、延缓细胞衰老、防止夜盲症等方面具有重要作用。 油葵油油质纯正、无异味、芳香可口、易被吸收。作为食用油、油葵在全国仅占8%，而香港占 70%。随着我国国民经济的发展和人民生活水平的提高，油葵油的消费将呈上升趋势。
油葵作为重要的油料植物，近些年在我国已大面积应用，有关的育种研究也有报 道，但关于利用基因工程技术进行育种的研究还没有。由于油葵多为野生，种质资源不丰 富，品种性状单一，所以利用常规育种技术很难得到理想的育种目标。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种育种速度快、方法简单的油 葵的基因转化方法。 本发明的目的是通过以下技术方案实现的
—种油葵的基因转化方法，其转化方法的步骤是
(1)取油葵试管苗组织作为外植体； (2)取农杆菌C58C1的一个单菌落，接种到LB液体培养基中过夜振荡培养，待其 OD值为0. 2-0. 6时，取出并浸染油葵试管苗组织外植体； (3)将上述浸染过的油葵试管苗外植体放在含有2-5mg/L除草剂的分化培养基上 进行再生芽的诱导，该分化培养基为MS+KTO. 25mg/L+IAA0. 5mg/L，外植体长度为2-3cm，接 种50-150块，培养条件为20-30°C、20-26h光照、光强1500-25001x，从接种后每0_14天继 代一次，生成转化苗； (4)将上述除草剂筛选的转化苗转入生根培养基，其生根培养基的构成为 1/2MS+IAA0. 5mg/L，待转化苗苗长到2_5cm高时即可移栽到花盆中。
而且，所述接种后最佳时间为每7天继代一次。
而且，所述分化培养基上的除草剂浓度最佳为3mg/L。
而且，所述油葵试管苗组织外植体最佳为茎段部分。
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而且，所述除草剂包括草丁膦。
本发明的优点和积极效果是 本发明建立一套油葵的基因转化方法，分别对筛选标记(除草剂)浓度、不同转化 外植体的选择、采用不同的继代时间进行了确定，本方法表明在培养基中加入3mg/L的除 草剂浓度下，以油葵的茎段为外植体，在每周继代一次的条件下可获得最高的转化效率，为 油葵的各种基因转化奠定基础。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 油葵(试管苗)及转化所用带抗盐转录因子HS的质粒(HS/pCB302)和农杆菌 C58C1均由天津农学院园艺系园林植物实验室提供。以下实施例中用药品为MS培养基；
6-BA试剂；NAA试剂；蔗糖；琼脂粉；肌醇；蒸馏水；NaOH试剂。
—种油葵的基因转化方法，其转化方法是 (1)取生长健壮的油葵试管苗，将茎段作为外植体； (2)取农杆菌C58C1的一个单菌落，接种到LB液体培养基中过夜振荡培养，待其 0D值为0. 4时，取出并浸染油葵试管苗外植体； (3)将上述浸染过的油葵试管苗外植体放在含有3mg/L除草剂的分化培养基上， 分化培养基为MS+KTO. 25mg/L+IAA0. 5mg/L，进行再生芽的诱导，茎段长度为2-3cm，接种 100块，培养条件为28°C，24h光照，光强20001x，从接种后每7天继代一次；除草剂浓度为 3mg/L时应该为理想的筛选压力。当继代时间为7天时，接种外植体的再生率最高，即获得 的基因转化率也最高；继代时间为7天时获得的转化效果最好。 (4)将上述除草剂筛选的转化苗转入生根培养基上，该生根培养基的构成为
1/2MS+IAA0. 5mg/L，待转化苗苗长到3cm高时即可移栽到花盆中。 所述除草剂为草丁膦，草丁膦是标记基因为bar基因的筛选药剂的一种。
权利要求
一种油葵的基因转化方法，其特征在于其转化方法的步骤是(1)取油葵试管苗组织作为外植体；(2)取农杆菌C58C1的一个单菌落，接种到LB液体培养基中过夜振荡培养，待其OD值为0.2-0.6时，取出并浸染油葵试管苗组织外植体；(3)将上述浸染过的油葵试管苗外植体放在含有2-5mg/L除草剂的分化培养基上进行再生芽的诱导，该分化培养基为MS+KT0.25mg/L+IAA0.5mg/L，外植体长度为2-3cm，接种50-150块，培养条件为20-30℃、20-26h光照、光强1500-2500lx，从接种后每0-14天继代一次，生成转化苗；(4)将上述除草剂筛选的转化苗转入生根培养基，其生根培养基的构成为1/2MS+IAA0.5mg/L，待转化苗苗长到2-5cm高时即可移栽到花盆中。
2. 根据权利要求1所述的一种油葵的基因转化方法，其特征在于所述接种后最佳时 间为每7天继代一次。
3. 根据权利要求1所述的一种油葵的基因转化方法，其特征在于所述分化培养基上 的除草剂浓度最佳为3mg/L。
4. 根据权利要求1所述的一种油葵的基因转化方法，其特征在于所述油葵试管苗组 织外植体最佳为茎段部分。
5. 根据权利要求1所述的一种油葵的基因转化方法，其特征在于所述除草剂为草丁膦。
全文摘要
本发明涉及一种油葵的基因转化方法，步骤是(1)取生长健壮的油葵试管苗组织作为外植体；(2)取农杆菌C58C1的一个单菌落，接种到LB液体培养基中过夜振荡培养，待其OD值为0.2-0.6时，取出并浸染油葵试管苗组织外植体；(3)将上述浸染过的油葵试管苗外植体放在含有2-5mg/L除草剂的分化培养基上，分化培养，每0-14天继代一次，生成转化苗；(4)将上述除草剂筛选的转化苗转入生根培养基，待转化苗苗长到2-5cm高时即可移栽到花盆中。本发明建立一套油葵的基因转化方法，分别对筛选标记(除草剂)浓度、不同转化外植体的选择、采用不同的继代时间进行了明确，并且获得了最高转化效率，为油葵的各种基因转化奠定基础。
文档编号A01H5/00GK101787372SQ20101013446
公开日2010年7月28日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者刘艳军, 张伟玉, 杨静慧 申请人:天津农学院