专利名称：反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法
技术领域：
本发明涉及组织与细胞工程、转基因动物等研究领域，特别是对乳腺上皮细胞的 分离、纯化、培养和冻存的方法。
背景技术：
乳腺是重要的皮肤外分泌器官，具有多种生理、生化和免疫功能，能为婴儿或幼畜 提供充足的营养并满足其发育的需求。这些功能的充分发挥，有赖于乳腺本身经历的一系 列特异性变化乳腺发育、乳腺分化、泌乳及乳腺重建和复旧等。实际上，由于机体系统和局 部众多可变因素的相互作用，使得人们对于乳腺上皮细胞的发育、功能分化、复旧、免疫防 御等的研究存在很大的困难。动物细胞培养模型在一定程度上模拟体内环境而广泛应用于 生物学、医学、营养学、毒理学等领域，可用于研究细胞的形态、生长发育、细胞营养和代谢 以及病变等微观过程，进行外源性物质吸收机制、转运途径及作用机理等方面的研究。从复 杂的器官体外培养到简单的单一上皮细胞培养及细胞共培养模式，可以很好的解决对于特 定因素研究的问题。国内外先后有学者对反刍动物乳腺上皮细胞的体外培养做了研究，但 目前的研究主要停留在培养方法学、形态学及激素对乳腺细胞的调控等方面，且对于分离 方法，国内外报道不尽相同，分离效果不一，形态学资料不尽周全，涉及其免疫鉴定、微观结 构观察、冷冻保存的研究不多，对其泌乳功能的系统研究更少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种分离纯化效果好的反刍动物乳腺上皮细胞 的分离纯化法，以及一种能延长保存时间的反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种反刍动物乳腺上皮细胞的分离、纯化培 养法，包括以下步骤1)、乳腺组织的取样选用已经与反刍动物相分离的乳腺，将去除结缔组织和脂肪后的乳腺分割成小块 组织，并经杀菌和清洗处理后；得体积为0. 9 1. 1mm3的乳腺组织块，备用；2)、制备培养液培养液按照下述投料比获得在每ml的DMEM/F12培养液中添加1 y g氢化可的松、5 y g转铁蛋白、5 y g胰岛素、 5 U g泌乳素、10ng表皮生长因子、2 y mol谷氨酰胺、100IU青链霉素和0. lml胎牛血清；3)、组织块培养将步骤1)所得的乳腺组织块放入铺过鼠尾胶原的细胞培养容器内，置37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，直至细胞覆盖80%的容器底表面积时，用质量浓度为0. 15%胰蛋白酶和0. 02% EDTA的消化液于37°C消化悬浮上述贴壁细胞5-8min ；直至在倒置显微镜 下80-90%细胞回缩、变圆和细胞间隙扩大后，立即用含10% (体积百分比)FBS的D-Hanks 液终止消化；所得的细胞悬液经过滤和离心，得细胞；用培养液清洗上述细胞3遍；最后用血细胞计数板调整细胞密度(采用培养液进 行稀释)，以5X 104/mL的密度植入培养板培养，置于37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养； 培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得原代培养的乳腺上皮细胞；4)、乳腺上皮细胞的纯化将原代培养的乳腺上皮细胞采用差酶法和反复贴壁法，用以纯化上皮细胞；具体 如下差酶法先用质量浓度为0. 25%胰酶的消化液消化成纤维细胞lOmin，除去成纤 维细胞及消化液；再加入质量浓度为0. 15%胰酶和0. 02% EDTA的混合消化液消化上皮细 胞 3-5min ；反复贴壁法将得到的上皮细胞经过滤和离心、计数调整细胞密度(采用培养液 进行稀释)后，以5 X 104/mL的密度再种植于细胞培养瓶，置于37°C、5% C02、饱和湿度条件 下培养；待细胞铺展到板底80%时，再依次重复上述差酶法和反复贴壁法1 2次，得到预 纯化处理后的乳腺上皮细胞；当上述预纯化处理后的乳腺上皮细胞达到80%汇合时，去除培养液；用无Ca2+、 Mg2+的Hanks液冲洗细胞，然后加入质量浓度为0. 15%胰酶和0. 02% EDTA混合消化液，以 消化细胞，直至在倒置显微镜下80-90%细胞回缩、变圆和细胞间隙扩大时，用10% FBS的 D-Hanks液终止消化；所得的即为纯化后的乳腺上皮细胞；5)、乳腺上皮细胞的传代培养将上述纯化后的乳腺上皮细胞经离心，得细胞，接着用培养液清洗细胞3遍；去 掉上清液，用培养液重新悬浮细胞，并用血细胞板计数调整细胞密度(采用培养液进行稀 释)，以5X 104/mL的密度植入培养瓶培养，置于37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，隔日 换液。作为本发明的分离、纯化培养法的改进步骤3)中，铺过鼠尾胶原的细胞培养容 器内的乳腺组织块之间的距离为0. 45 0. 55cm ；细胞悬液用孔径为105 u m的不锈钢滤网
过滤o本发明还同时提供了一种反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法，包括以下步骤1)、制备冷冻保护液冷冻保护液由以下体积百分比的组份组成10% DMS0、40%胎牛血清和50%细胞 悬液；所述细胞悬液是由细胞与DMEM/F12基础培养基形成的混合物，细胞在细胞悬液中的 密度为lX106/mL，所述细胞为原代培养的乳腺上皮细胞、纯化后的乳腺上皮细胞或传代培 养的乳腺上皮细胞；2)、将上述步骤1)所得的冷冻保护液逐步慢速降温a、4°C降至_8°C，降温速率为1°C /min ；_8°C保持一分钟；b、_8°C 降至-20°C，降温速率为 0. 5°C /min ；c、-20°C 降至-120°C，降温速率为 0. 3°C /min ；
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d、将上述步骤所得的-120°C的冷冻保护液直接利用液氮降温，直至冷冻保护液被 降温至_196°C ；将上述_196°C的冷冻保护液采用液氮冷冻保存。本发明旨在建立可用于反刍动物乳汁分泌机制、乳腺生理、乳期细胞凋亡、乳腺退 化以及乳腺与营养供应、疾病防治等相关研究的乳腺上皮细胞泌乳模型；发明涵盖了乳腺 上皮细胞分离、纯化、培养、生长、保存等过程。本发明反刍动物乳腺上皮细胞的分离纯化法，采用组织块培养法、经过差酶法 (0. 25%胰酶消化成纤维细胞，0. 15%胰酶及0. 02% EDTA消化上皮细胞)和反复贴壁法纯 化了上皮细胞，发现在添加了胰岛素、泌乳素、转铁蛋白等成分的DMEM/F-12培养液中，细 胞呈典型上皮样形态，传至第十代的细胞依旧增殖旺盛，生长迅速。为了证明本发明的优点，发明人作了如下的验证实验实验1、发明人对步骤4)所得的纯化后的乳腺上皮细胞和步骤5)所得的传代培养 的乳腺上皮细胞进行了如下鉴定，具体如下按照常规免疫细胞化学方法的实验步骤，一抗为兔抗鼠细胞角蛋白18抗体，二抗 为羊抗兔IgG，经DAB显色，观察乳腺细胞的上皮特性。结果如图3所示，发现CK_18特异性在乳腺上皮细胞中表达，并在传代后的上皮 细胞中检测到了相同的结果，说明培养的乳腺细胞角蛋白特性(上皮特性)依然存在。实验2、发明人对步骤4)所得的纯化后的乳腺上皮细胞和步骤5)所得的传代培养 的乳腺上皮细胞进行了超微结构观察，具体如下收集传代培养至第九代生长旺盛的乳腺细胞(1-5X106个)，1000r/min离心 lOmin，去除上清液，用冷2.5%戊二醛41固定过夜，经0. 1M磷酸缓冲液漂洗样品三次，再 用锇酸固定，后经乙醇梯度脱水、包埋、聚合、切片、染色等步骤制成超薄切片，在透射电 镜下观察乳腺细胞的超微结构。结果如图4所示。乳腺上皮细胞核内常染色体均勻分布， 胞质内有丰富的粗面内质网，成群排列，其上附有核糖体，此外还有丰富的游离核糖体、高 尔基复合体(图4-A1)，在其成熟面附近有中等密度的分泌颗粒(图4-A2)，细胞表面有上 皮细胞微绒毛结构(图4-A3)。体外培养的乳腺细胞还具有顶质分泌的特征，高尔基分泌 泡、脂肪滴等物质聚集在细胞顶部，形成富有微绒毛的顶质突起，内有聚集的核蛋白体和一 些小泡，有些小泡有中等电子致密的无定形状物质。同时，可见上皮细胞特有的细胞连接方 式-桥粒(图4-A4)，有的则形成半桥粒结构。试验结果表明，体外培养的乳腺细胞生长状 态良好，分泌上皮的细胞特征完备。透射电镜观察到上皮细胞特有的标志_桥粒结构及分泌泡，说明体外培养的乳腺 上皮细胞保持了体内上皮细胞的特点。本发明的反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法，相对于现有的保存方法，具有如下 优点能够显著提高冻存细胞的活力、有利于保护剂向细胞内部渗透，减少冰晶的形成， 获得较好的保护效果，使细胞长期保存，完善了乳腺上皮细胞泌乳模型。为了证明本发明的反刍动物乳腺上皮细胞的保存法的优点，发明人作了如下的实 验采用本发明的反刍动物乳腺上皮细胞保存方法，将所培养的奶牛乳腺上皮细胞冻存，至于液氮中保存2个月后，37°C热水浴迅速解冻复苏，用0. 4%台盼蓝染色，进行活细胞 计数，结果表明活细胞数占复苏总细胞数的95% ；将复苏的细胞调整好细胞浓度再种植到 细胞培养瓶中，37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，细胞生长及形态均正常，达到本实验的 预期目的。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是乳腺细胞不同生长时期形态变化图；图1-A1 培养4天后乳腺上皮细胞生长状况；图1-A2 培养8天后乳腺上皮细胞 生长状况；图1-A3 培养12天后乳腺上皮细胞生长状况；图1-A4 培养16天后乳腺上皮细 胞生长状况；图1-A5 乳腺上皮细胞分泌的乳脂小滴；图1-A6 呈鹅卵石铺路状乳腺上皮 细胞群；图1-A7 拉网状生长的乳腺上皮细胞；图1-A8 乳腺上皮细胞的圆顶状结构；图2是传代乳腺上皮细胞生长形态变化图；图2-A1 原代乳腺上皮细胞；图2-A2 第四代乳腺上皮细胞；图2_A3 第七代乳腺 上皮细胞；图2-A4 第九代乳腺上皮细胞；图3是奶牛乳腺上皮细胞CK-18免疫细胞化学染色结果图；左图为阴性对照组，乳腺上皮细胞呈CK-18阴性；右图为阳性实验组，乳腺上皮细 胞呈CK-18阳性；图4是乳腺上皮细胞亚细胞结构4-A1 粗面内质网上的核糖体和高尔基复合体；图4-A2 中等密度分泌颗粒； 图4-A3 微绒毛结构；图4-A4 桥粒连接。
具体实施例方式以下实施例中PBS溶液为磷酸盐缓冲溶液；EDTA:乙二胺四乙酸；FBS 胎牛血清；DMS0: 二甲基亚砜。实施例1、一种反刍动物乳腺上皮细胞的分离、纯化和培养法，依次进行以下步 骤1)、乳腺组织的取样乳腺组织来源于两头刚屠宰的处于泌乳期的荷斯坦奶牛。从乳腺中间取样，尽量分离结缔组织和脂肪，先用75%无水乙醇浸泡消毒乳腺 组织，并将组织剪切成1cm3大小的小块组织；用0. 3%新洁尔灭(即质量浓度为0. 3%的 苯扎溴铵水溶液)冲洗小块组织，反复冲洗至少3遍；再用加有新洁尔灭的PBS溶液(每 lOOmlPBS溶液内加入苯扎溴铵1ml)冲洗组织，至少3遍。由于屠宰厂与实验室不是位于同一处；因此先将上述组织块浸没于10倍双抗的 培养液中(106IU/L青、链霉素)于冰盒中带回实验室；然后在超净台中用含1000IU/ml双 抗(青霉素和链霉素)的PBS溶液反复冲洗至溶液澄清；于少量DMEM/F12基础培养液(能
6浸没组织即可)中将小块组织切割成0. 9 1. 1mm3的乳腺组织块，最后用含100IU/ml双 抗的基础培养液冲洗2-3遍，备用。2)、制备培养液培养液按照下述投料比获得在每ml的DMEM/F12培养液中添加1 i g氢化可的松、5 i g转铁蛋白、5 i g胰岛素、 5 U g泌乳素、10ng表皮生长因子、2 y mol谷氨酰胺、100IU青链霉素和0. lml胎牛血清；得
培养液。下述步骤中没有特别表明的均指该培养液。3)、组织块培养将步骤1)所得的乳腺组织块放入铺过鼠尾胶原的50ml细胞培养瓶(corning) 内，每瓶内均勻放置40-50块乳腺组织块，用灭菌牙签分离该乳腺组织块，使乳腺组织块均 勻分布，使其相互间距离为0. 5cm左右。置37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，培养3 5h后；然后每孔添加5ml培养液，置培养箱中37°C、5% C02、饱和湿度条件下继续培养，接 种的乳腺组织块贴壁性良好，培养至4天时，可见有细胞从组织边缘呈纤维样细胞向外生 长，并且迅速展开(图1-A1)。第8天时开始逸出多角形和鹅卵石状上皮细胞，此时细胞生 长迅速，细胞营养消耗旺盛(图1-A2)。随着上皮细胞的逸出，成纤维细胞生长开始变慢， 最先逸出的成纤维样细胞折光性减弱，颜色变暗，有逐渐衰竭的迹象，而上皮细胞开始大量 展开(图1-A3)，密度低时，大多呈现多角形，密度增大后，细胞排列紧密形成生长晕圈(图 1-A4)。培养的乳腺小叶组织块周围可见乳滴状物质(图1-A5)，说明此时的乳腺组织仍具 有一定的分泌性。乳腺上皮细胞呈扁平的多角形，呈鹅卵石铺路状(图1-A6)，细胞之间紧 密相接，表现出上皮细胞特有的拉网结构(图1-A7)，当上皮细胞融合后，形成类似圆顶状 (dome-like)结构(图1-A8)。直至细胞覆盖80%板底表面积时，用质量浓度为0. 15%胰蛋 白酶和0. 02%EDTA的混合消化液(用量2ml/瓶，以D-Hanks液作为溶液)37°C消化悬浮上 述贴壁细胞5-8min，直至在倒置显微镜下80-90%细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大后立即用 含10% FBS的D-Hanks液(FBS与D-Hanks以1 9的体积比相混合而得)终止消化(用 量3ml/瓶)；所得细胞悬液经105 u m不锈钢滤网过滤和lOOOrpm/min离心5min，以收集细 胞；接着用培养液洗3遍；最后用血细胞计数板调整细胞密度(采用培养液进行调节)，以 5X104/mL的密度植入培养瓶培养，置于37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养；培养至细胞覆 盖80%板底表面积时，进行细胞纯化，方法如下。4)、乳腺上皮细胞的纯化根据乳腺上皮细胞与成纤维细胞对胰酶敏感度不同以及贴壁速度不同，采用差酶 法和反复贴壁法纯化上皮细胞。具体如下选用上述步骤3)培养后所得的细胞，先用质量浓度为0. 25%胰酶的消化液(用量 2ml/瓶，以D-Hanks液作为溶液)消化成纤维细胞lOmin，除去成纤维细胞及消化液；再加 入质量浓度为0. 15%胰酶和0. 02% EDTA的混合消化液(用量2ml/瓶，以D-Hanks液作为 溶液)消化上皮细胞3-5min;得到的上皮细胞经过滤等，然后计数调整细胞密度(采用培 养液进行调节)后以5X104/mL的密度再种植进细胞培养瓶，置于37°C、5% C02、饱和湿度 条件下培养。待细胞铺展到板底80%时再依次重复上述差酶法和反复贴壁法步骤，原代培 养的乳腺上皮细胞(图2-A1)经2-3代传代纯化后，可得到预纯化处理的乳腺上皮细胞，呈
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在上述预纯化处理的乳腺上皮细胞达到80%汇合时去除培养液；用无Ca2+、Mg2+的 Hanks液冲洗细胞，然后加入质量浓度为0. 15%胰酶和0. 02%EDTA混合消化液(用量2ml/ 瓶，以D-Hanks液作为溶液)，以消化细胞，直至在倒置显微镜下80-90%细胞回缩、变圆、细 胞间隙扩大时，用10% FBS的D-Hanks液(3ml/瓶，FBS与D-Hanks以1 9的体积比相混 合而得)终止消化；所得的即为纯化后的乳腺上皮细胞；5)、乳腺上皮细胞的培养和生长将上述纯化后的乳腺上皮细胞经lOOOrpm/min离心5min以除去消化液并收集细 胞，接着用培养液清洗，重复上述步骤3遍；去掉上清液，用培养液重新悬浮细胞，并用血细 胞板计数调整细胞密度(采用培养液进行调节)，以5X 104/mL的密度植入培养瓶培养，置 于37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，隔日换液。传代细胞的形态经历了初始的细胞岛屿 样分散生长、半汇合、汇合到密集生长四种基本形态变化。细胞核呈圆形或椭圆形，核仁以 2-5个居多，细胞有接触抑制现象。4代以内的细胞基本以多角形上皮细胞为主，随传代次 数的增多，细胞形态不均一，呈现长形、梭形和三角形混合生长(图2-A3)。当细胞传至第9 代时，细胞变大，圆饼样，仍可见明显的细胞增殖现象(图2-A4)实施例2、一种反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法，依次进行以下步骤1)、制备冷冻保护液冷冻保护液由以下体积百分比的组份组成10% DMS0、40%胎牛血清和50%细胞 悬液；细胞悬液是由细胞与DMEM/F12基础培养基形成的混合物，细胞在细胞悬液中的密度 为1 X 106/mL,细胞为原代培养的乳腺上皮细胞(实施例1步骤3)所得)、纯化后的乳腺上 皮细胞(实施例1步骤4)所得)或传代培养的乳腺上皮细胞(实施例1步骤5)所得)；2)、将上述步骤1)所得的冷冻保护液逐步慢速降温a、4°C降至_8°C，降温速率为1°C /min ；_8°C保持一分钟；b、_8°C 降至 _20°C，降温速率为 0. 5°C /min ；c、-20°C 降至-120°C，降温速率为 0. 3°C /min ；d、将上述步骤所得的-120°C的冷冻保护液直接利用液氮降温，直至冷冻保护液被 降温至_196°C ；将上述-196°C的冷冻保护液液采用液氮冷冻保存。采用上述方法，可保证乳腺上皮细胞的活力天数至少为450天。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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权利要求
一种反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法，其特征是包括以下步骤1)、制备冷冻保护液冷冻保护液由以下体积百分比的组份组成10％DMSO、40％胎牛血清和50％细胞悬液；所述细胞悬液是由细胞与DMEM/F12基础培养基形成的混合物，细胞在细胞悬液中的密度为1×106/mL，所述细胞为反刍动物原代培养的乳腺上皮细胞、纯化后的乳腺上皮细胞或传代培养的乳腺上皮细胞；所述反刍动物为牛；2)、将上述步骤1)所得的冷冻保护液逐步慢速降温a、4℃降至-8℃，降温速率为1℃/min；-8℃保持一分钟；b、-8℃降至-20℃，降温速率为0.5℃/min；c、-20℃降至-120℃，降温速率为0.3℃/min；d、将上述步骤所得的-120℃的冷冻保护液直接利用液氮降温，直至冷冻保护液被降温至-196℃；将上述-196℃的冷冻保护液采用液氮冷冻保存。
全文摘要
本发明公开了一种反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法，包括以下步骤1)制备冷冻保护液，该冷冻保护液由以下体积百分比的组份组成10％DMSO、40％胎牛血清和50％细胞悬液；2)将上述步骤1)所得的冷冻保护液逐步慢速降温，直至冷冻保护液被降温至-196℃；将上述-196℃的冷冻保护液采用液氮冷冻保存。采用本发明的方法能延长反刍动物乳腺上皮细胞的保存时间。
文档编号A01N1/02GK101861857SQ20101016204
公开日2010年10月20日 申请日期2008年11月24日 优先权日2008年11月24日
发明者刘建新, 刘红云, 赵珂 申请人:浙江大学