一种半夏杂交及F₁扩繁方法

专利名称：一种半夏杂交及F₁扩繁方法
技术领域：
本发明涉及一种半夏杂交及F1扩繁方法。

背景技术：
半夏(Pinellia ternate(Thunb.)Breit.)为天南星科半夏属多年生草本，生于山地、农田、溪边或山林下，分布于我国大部分地区。以块茎入药，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功效，用于脾胃虚寒、呃逆呕吐、食少吐泻、心腹冷痛、肾虚阳痿等症的治疗，是历版《中国药典》所收载的常用中药，其使用频率在588种中药处方中居22位。近代研究发现半夏还有抗早孕、抗肿瘤、降血脂、护肝等功能，因而备受国内外的关注。近年来，由于医药管理部门对制药企业进行了全面整顿，明确了不可用水半夏代替旱半夏作制药原料，使半夏的市场需求量大大增加。同时由于我国半夏野生资源的减少以及出口需求的增加，进一步加剧了半夏供需矛盾。
从全国半夏生产现状来看，各地半夏野生转家种的历史均不长，规模栽培技术需要不断完善；就一个地区来说，也不可避免的出现品种类型变异与退化现象；半夏生产中已经出现的问题也较多，如半夏出苗不整齐，倒苗现象，病虫害如芋花叶病毒(DMV)和大豆花叶病毒(SMV)等问题，大大降低了半夏的实际生产能力。为了解决生产中出现的问题，各地相继开展了相关研究，但主要集中在资源评价和栽培技术方面，此类研究对进一步认识我国半夏种质资源和完善栽培技术奠定了基础，而关于半夏育种方面的研究尚未见有详细报道。根据目前国内的半夏生产与研究现状，开展育种工作具有重要意义。但是，目前半夏杂交育种工作还存在着许多技术瓶颈，如杂交条件不确定，以无性繁殖为主的繁殖方式繁殖系数低，短期内无法对F1代各项特性进行检测筛选，影响品种选育以及成果的转化。为建立半夏杂交品种选育体系，本工作主要针对上述两方面的问题进行研究，其成果为半夏栽培品种改良提供技术依据和简便可行的方法。


发明内容
本发明提供了一种半夏杂交及F1扩繁方法，它采用杂交和扩繁，可以培育处光合特性好以及内在品质佳的半夏品种。
本发明采用了以下技术方案一种半夏杂交及F1扩繁方法，它包括以下步骤步骤一，半夏品种收集及种质资源圃建立首先收集不同类型的半夏种茎，选择健康、大小一致的种茎，分小区定植于半夏种质资源圃中，插牌标记并进行水肥管理；步骤二，杂交亲本筛选从半夏种质资源圃的不同类型半夏居群中，挑选性状优良，具有代表性的居群作为杂交亲本；步骤三，杂交技术将半夏花的器官苞片微张，柱头发白具粘液，雄蕊表面光滑、未散粉时对半夏花人工去雄授粉，人工去雄授粉完成后套袋隔离，挂牌标记，待种子成熟后收杂交F1代成熟种子；步骤四，扩繁技术一，实生苗获得将收集到的杂交F1代成熟种子进行消毒灭菌，将灭菌后的杂交F1代成熟种子接种于1/2MS培养基中，在一定培养条件下培育半夏F1实生苗；二，实生苗扩繁选取经种子培养获得的健康的半夏F1实生苗，分别切取半夏F1实生苗的叶柄基部、叶柄上部、叶片、块茎，将切取后的叶柄切段、叶片小块和块茎小块接种到MS+2，4-D0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L固体培养基中诱导愈伤组织；三，球状体增殖选取质地，色泽一致的分化出球状体的愈伤组织接种到改良的MS液体培养基中增值产生半夏球状体；四，F1代植株再生将增值产生半夏球状体接种到MS+NAA0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L分化培养基中，诱导其生根分化形成完整的F1代植株，即可进行炼苗移栽；步骤五，半夏F1代品比试验分别对半夏不同亲本与F1代植株的茎叶形态进行比较，采用分光光度计法测定各F1代叶片中的色素含量，并对其光响应曲线、CO2响应曲线、叶绿素荧光参数进行测定比较，综合比较各F1代光合特性，检测F1代半夏中鸟苷及总游离有机酸的含量，确定光合特性及活性成分均优的杂交F1代。
所述的步骤三中人工去雄授粉的最佳时间为早晨9:00-10:00。所述的步骤四的实生苗获得中对杂交F1代成熟种子采用的消毒灭菌的方式为首先采用自来水冲洗30min后，吸干表面水分，然后在浸入70％酒精中进行表面消毒30秒，再用2％次氯酸钠溶液中浸泡20min，在2％次氯酸钠溶液加3-5滴吐温20或吐温80，最后用灭菌剂灭菌，在灭菌后用无菌水再冲洗3-5次。所述的步骤四的实生苗获得中的1/2MS培养基的体积为50ml，在1/2MS培养基中蔗糖含量为3％，pH＝5.8，琼脂为6g/L，在每瓶1/2MS培养基中接种4粒种子，培育半夏F1实生苗的培养条件为培养温度为25±1℃，光照为1500lx，每天12h。所述的步骤四的实生苗扩繁中叶柄切段为0.5cm，叶片小块为0.5×0.5cm2，块茎小块为0.5×0.5×0.5cm3，MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L固体培养基的体积为50ml，其中在MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L固体培养基中含有琼脂6g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8，诱导愈伤组织时的培养条件为培养温度为25±1℃，光照为1500lx，每天12h。所述的步骤四的球状体增殖中分化出球状体的愈伤组织为0.5g，将球状体的愈伤组织与改良的MS液体培养基装到三角瓶中，用硫酸纸将三角瓶封口，将三角瓶放在旋转式摇床上进行振荡培养，摇床转速为100r/min，MS液体培养基的体积为50ml，在MS液体培养基中含蔗糖30g/L，pH为5.8，增值产生半夏球状体的培养条件为温度为25±1℃，光照为1500lx，每天12h。所述的步骤四的F1代植株再生中MS+NAA 0.1mg/L+6-BA1.0mg/L分化培养基中含有蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH为5.8，诱导其生根分化形成完整植株的培养条件为培养温度为25±1℃，光照为1500lx，每天12h。所述的步骤四中分光光度计法中使用便携式光合仪进行测量。
本发明具有以下有益效果1杂交育种，它可以选择杂交亲本，育种目标明确，杂交F1代可遗传父母本的优良性状，后代无性繁殖，遗传稳定性好；2扩繁技术采用液体培养基诱导球状体，和固体培养基直接诱导不定芽相比，繁殖系数更大，需要时间更短，可短期内满足优良品系筛选及品种推广的要求；3光合作用是影响植物物质积累与代谢的重要生理过程，本发明的高光效对植物内在品质及产量影响很大，培育高光效品种，可改良现有的半夏栽培品系。



图1为本发明的流程图
具体实施例方式 实施例一，在图1中，本发明为一种半夏杂交及F1扩繁方法，它包括以下步骤步骤一，半夏品种收集及种质资源圃建立首先收集不同类型的半夏种茎，选择健康、大小一致的种茎，分小区定植于半夏种质资源圃中，插牌标记并进行水肥管理；步骤二，杂交亲本筛选从半夏种质资源圃的不同类型半夏居群中，挑选性状优良，具有代表性的居群作为杂交亲本；步骤三，杂交技术将半夏花的器官苞片微张，柱头发白具粘液，雄蕊表面光滑、未散粉时对半夏花人工去雄授粉，人工去雄授粉的最佳时间为早晨9:00-10:00，人工去雄授粉完成后套袋隔离，挂牌标记，待种子成熟后收杂交F1代成熟种子；步骤四，扩繁技术一，实生苗获得将收集到的杂交F1代成熟种子进行消毒灭菌，消毒灭菌的方式为首先采用自来水冲洗30min后，吸干表面水分，然后在浸入70％酒精中进行表面消毒30秒，再用2％次氯酸钠溶液中浸泡20min，在2％次氯酸钠溶液加3-5滴吐温20或吐温80，最后用灭菌剂灭菌，在灭菌后用无菌水再冲洗3-5次；将灭菌后的杂交F1代成熟种子接种于1/2MS培养基中，1/2MS培养基的体积为50ml，在1/2MS培养基中蔗糖含量为3％，pH＝5.8，琼脂为6g/L，在每瓶1/2MS培养基中接种4粒种子，在培养温度为25±1℃，光照1500lx，每天12h的条件下培育半夏F1实生苗；二，实生苗扩繁选取经种子培养获得的健康的半夏F1实生苗，分别切取半夏F1实生苗的叶柄基部、叶柄上部、叶片、块茎，将切取后的叶柄切段、叶片小块和块茎小块接种到MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L固体培养基中在培养温度25±1℃，光照1 500lx，每天12h的条件下诱导愈伤组织，叶柄切段为0.5cm，叶片小块为0.5×0.5cm2，块茎小块为0.5×0.5×0.5cm3，MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L固体培养基的体积为50ml，其中在MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L固体培养基中含有琼脂6g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8；三，球状体增殖选取质地，色泽一致的分化出球状体的愈伤组织0.5g接种到改良的MS液体培养基中，将球状体的愈伤组织与改良的MS液体培养基装到150ml的三角瓶中，用硫酸纸将三角瓶封口，将三角瓶放在旋转式摇床上进行振荡培养增值产生半夏球状体，增值产生半夏球状体的培养条件为温度25±1℃，光照1500lx，每天12h，摇床转速为100r/min，MS液体培养基的体积为50ml，在MS液体培养基中含蔗糖30g/L，pH为5.8；四，F1代植株再生将增值产生半夏球状体接种到MS+NAA0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L分化培养基中，在培养温度25±1℃，光照1 500lx，每天12h的条件下诱导其生根分化，在25d后形成完整的F1代植株，即可进行炼苗移栽，F1代植株再生中MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L分化培养基中含有蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH为5.8；步骤五，半夏F1代品比试验分别对半夏不同亲本与F1代植株的茎叶形态进行比较，采用分光光度计法测定各F1代叶片中的色素含量，在分光光度计法中采用Li-6400便携式光合仪进行测量，并对其光响应曲线、CO2响应曲线、叶绿素荧光参数进行测定比较，综合比较各F1代光合特性，检测F1代半夏中鸟苷及总游离有机酸的含量，确定光合特性及活性成分均优的杂交F1代。本实施例江苏海门半夏与江苏泰州半夏的杂交F1代叶面积为15.112cm2，高于其两亲本，具有明显的叶面积杂交优势(表1)，光补偿点(LCP)较父母本低，说明其在低光强下呼吸速率和光合速率就可达到平衡。而表观量子效率(AQY)高，说明其在利用弱光及耐阴性方面要优于亲本(表2)，表3为半夏亲本及子一代CO2响应曲线比较，表4半夏亲本及其子一代鸟苷含量比较，除此之外，F1代在CO2补偿点(CCP)上低于亲本，说明其在较低CO2浓度下呼吸速率和光合速率就能得到满足，羧化效率明显高于其亲本，说明F1代对低浓度的CO2，利用率要高于两亲本。综合比较，江苏海门半夏与江苏泰州半夏的杂交F1代光合特性较其亲本有明显优势，为选育出的高光效品系。
表1 半夏亲本及其子一代生物学性状比较
注H表示江苏海门半夏，T表示江苏泰州半夏，H×T表示以江苏海门半夏为母本，江苏泰州半夏为父本的半夏杂交子一代，下表同。
表2 半夏亲本及子一代光响应曲线比较
表3 半夏亲本及子一代CO2响应曲线比较
表4 半夏亲本及其子一代鸟苷含量比较 类型 鸟苷含量 Types Content of Guanosine H 0.02052 T 0.01863 H×T 0.02346
权利要求
1.一种半夏杂交及F1扩繁方法，它包括以下步骤
步骤一，半夏品种收集及种质资源圃建立首先收集不同类型的半夏种茎，选择健康、大小一致的种茎，分小区定植于半夏种质资源圃中，插牌标记并进行水肥管理；
步骤二，杂交亲本筛选从半夏种质资源圃的不同类型半夏居群中，挑选性状优良，具有代表性的居群作为杂交亲本；
步骤三，杂交技术将半夏花的器官苞片微张，柱头发白具粘液，雄蕊表面光滑、未散粉时对半夏花人工去雄授粉，人工去雄授粉完成后套袋隔离，挂牌标记，待种子成熟后收杂交F1代成熟种子；
步骤四，扩繁技术
一，实生苗获得将收集到的杂交F1代成熟种子进行消毒灭菌，将灭菌后的杂交F1代成熟种子接种于1/2MS培养基中，在一定培养条件下培育半夏F1实生苗；
二，实生苗扩繁选取经种子培养获得的健康的半夏F1实生苗，分别切取半夏F1实生苗的叶柄基部、叶柄上部、叶片、块茎，将切取后的叶柄切段、叶片小块和块茎小块接种到MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L固体培养基中诱导愈伤组织；
三，球状体增殖选取质地，色泽一致的分化出球状体的愈伤组织接种到改良的MS液体培养基中增值产生半夏球状体；
四，F1代植株再生将增值产生半夏球状体接种到MS+NAA 0.1mg/L+6-BA1.0mg/L分化培养基中，诱导其生根分化形成完整的F1代植株，即可进行炼苗移栽；
步骤五，半夏F1代品比试验分别对半夏不同亲本与F1代植株的茎叶形态进行比较，采用分光光度计法测定各F1代叶片中的色素含量，并对其光响应曲线、CO2响应曲线、叶绿素荧光参数进行测定比较，综合比较各F1代光合特性，检测F1代半夏中鸟苷及总游离有机酸的含量，确定光合特性及活性成分均优的杂交F1代。
2.根据权利要求1所述的半夏杂交及F1扩繁方法，其特征是所述的步骤三中人工去雄授粉的最佳时间为早晨9:00-10:00。
3.根据权利要求1所述的半夏杂交及F1扩繁方法，其特征是所述的步骤四的实生苗获得中对杂交F1代成熟种子采用的消毒灭菌的方式为首先采用自来水冲洗30min后，吸干表面水分，然后在浸入70％酒精中进行表面消毒30秒，再用2％次氯酸钠溶液中浸泡20min，在2％次氯酸钠溶液加3-5滴吐温20或吐温80，最后用灭菌剂灭菌，在灭菌后用无菌水再冲洗3-5次。
4.根据权利要求1所述的半夏杂交及F1扩繁方法，其特征是所述的步骤四的实生苗获得中的1/2MS培养基的体积为50ml，在1/2MS培养基中蔗糖含量为3％，pH＝5.8，琼脂为6g/L，在每瓶1/2MS培养基中接种4粒种子，培育半夏F1实生苗的培养条件为培养温度为25±1℃，光照为1500lx，每天12h。
5.根据权利要求1所术半夏杂交及F1扩繁方法，其特征是所述的步骤四的实生苗扩繁中叶柄切段为0.5cm，叶片小块为0.5×0.5cm2，块茎小块为0.5×0.5×0.5cm3，MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L固体培养基的体积为50ml，其中在MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L固体培养基中含有琼脂6g/L，蔗糖30g/L，pH为5.8，诱导愈伤组织时的培养条件为培养温度为25±1℃，光照为1500lx，每天12h。
6.根据权利要求1所术半夏杂交及F1扩繁方法，其特征是所述的步骤四的球状体增殖中分化出球状体的愈伤组织为0.5g，将球状体的愈伤组织与改良的MS液体培养基装到三角瓶中，用硫酸纸将三角瓶封口，将三角瓶放在旋转式摇床上进行振荡培养，摇床转速为100r/min，MS液体培养基的体积为50ml，在MS液体培养基中含蔗糖30g/L，pH为5.8，增值产生半夏球状体的培养条件为温度为25±1℃，光照为1500lx，每天12h。
7.根据权利要求1所术半夏杂交及F1扩繁方法，其特征是所述的步骤四的F1代植株再生中MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L分化培养基中含有蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH为5.8，诱导其生根分化形成完整植株的培养条件为培养温度为25±1℃，光照为1500lx，每天12h。
8.根据权利要求1所术半夏杂交及F1扩繁方法，其特征是所述的步骤四中分光光度计法中使用便携式光合仪进行测量。
全文摘要
本发明公开了一种半夏杂交及F1扩繁方法，它包括以下步骤步骤一，半夏品种收集及种质资源圃建立；步骤二，杂交亲本筛选；步骤三，杂交技术；步骤四，扩繁技术；一，实生苗获得；二，实生苗扩繁；三，球状体增殖；四，F1代植株再生；步骤五，半夏F1代品比试验。本发明采用杂交和扩繁，可以培育出光合特性好以及内在品质佳的半夏品种。
文档编号A01H1/04GK101766116SQ20101902600
公开日2010年7月7日 申请日期2010年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者王康才, 肖亚雯, 邢建永, 陈暄, 吴健, 谈献和, 徐志强 申请人:王康才