专利名称：一种根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法
技术领域：
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法。
背景技术：
甘蔗是主要的糖料作物，高产、高糖、高抗和高经济效益是栽培甘蔗的最终目的， 也是甘蔗育种的主要目标。但是甘蔗的主要经济性状(如蔗茎产量、蔗糖份及生长特性等) 和抗逆性多属于数量性状，受微效多基因控制，受环境影响大，连锁群多，因此通过常规杂交育种要想把亲本所具有的全部优良性状综合起来非常困难。尤其是很难在甘蔗优良品种中有针对性地引入抗性基因。现代栽培甘蔗是多个种间复合杂合后代，为高度异源多倍体 (染色体数目高达2η = 36 170)，开花困难，常规杂交育种难度大，周期长(甘蔗传统育种从有性杂交到良种育成约需10 13年的选择过程)，而且新育成的高产优质品系还可能因为某一性状的缺陷，如抗病性差而难以推广应用。基因工程可以定向改变甘蔗的某些性状，特别是在甘蔗抗旱、抗寒、抗病虫等抗性育种及高光合、高糖等遗传性状改良方面。因此，通过转基因技术提高甘蔗抗性及糖份将是高产、高糖、高抗甘蔗育种的重要新途径。由于甘蔗复杂的多倍体基因组，与其他作物相比，在甘蔗转基因研究应用方面进展较小。甘蔗的遗传转化研究首次报道始于1987年，目前成功培育出转基因甘蔗的转化方法有原生质体电穿孔法、基因枪法和农杆菌介导法等3种，用于甘蔗转化的受体主要有胚性愈伤组织，茎尖分生组织，悬浮细胞及原生质体。尽管原生质体是遗传转化过程中外源 DNA的理想受体，可以获得外源基因整合及稳定表达的愈伤组织细胞，但甘蔗原生质体难以再生出甘蔗植株且只是局限在个别基因型上，因此这种转化方法并不是获得转基因甘蔗植株的有效方法。选用幼龄的具有高频再生能力的靶组织与细胞可缩短培养过程，防止体细胞变异，外植体大小均一，体积小有利于转化。目前大多数基因工程甘蔗的培育都是采用基因枪法。基因枪法是以完整细胞和组织为受体，将外源DNA溶液同钨、金等金属颗粒共同保温，使DNA吸附于金属颗粒表面，然后在真空条件下加速金属颗粒轰击细胞或组织，使之直接导入受体细胞或组织，经筛选后存活下来，表达导入的基因。该法操作简便、无基因型专一性，且可同时用几个质粒。1998年Arencibia等采用工程菌LBA4404和ΕΗΑ101，成功进行了农杆菌介导的甘蔗遗传转化，平均转化效率0. 194% 1. 115%。同年，Elliott使用工程菌株AGLO，转化效率为5. 13%。此后国内外都相继开展了农杆菌介导的甘蔗遗传转化研究。目前转基因甘蔗存在转化率低、基因表达量低或沉默、遗传稳定性差等问题，就其原因在于一是基因枪法转化的外源基因由于多拷贝插入，随机整合等使得转基因在甘蔗中的沉默现象很严重；基因枪法转化嵌合体比例大，转基因拷贝数多，遗传稳定性较差；二是影响根癌农杆菌转化甘蔗的因素，具体涉及甘蔗基因型、高效植物表达载体的构建(包括启动子和选择标记、MAR序列等)、受体材料类型及预处理、合适的农杆菌株系、菌体浓度、Vir 基因活化、浸染时间、共培养时间以及农杆菌的有效去除等。农杆菌介导的甘蔗转化技术， 由于其设备要求简单、费用低，且通常只会整合单个或少数拷贝的外源基因，因而，很少会有甲基化和基因沉默现象(Silencing)发生。由于甘蔗遗传背景的异源多倍性和高度杂合性，建立高效、可重复地稳定表达外源基因的农杆菌介导的甘蔗遗传转化技术仍是目前最关键的技术。此外，转基因在受体染色体上的整合是随机的，转基因的遗传稳定性及其表达活性在不同的转化体中存在很大差异，如果没有大量的转基因植株供筛选，就不可能获得遗传稳定、转基因性状良好、其他原有农艺性状未受破坏的转基因品种或株系。针对目前转基因甘蔗外源基因表达量过低和基因沉默等问题，各种高效表达启动子和表达载体的发明与利用是解决这个问题的有效方法。其中核基质结合区(Matrix attachment regions, MARs)的应用受到了广泛的关注。MARs是一种很好的基因表达调控元件，利用MARs是克服外源基因失活的一个有效方法。通过在目标基因两端添加核基质结合序列MAR形成LB-MAR-选择标记基因-目标基因-MAR-RB，LB-选择标记基因-MAR-目标基因-MAR-RB表达结构，在插入转基因植物染色体后形成独立的环状结构，具有稳定和提高基因表达水平，部分缓解由于位置效应以及甲基化引起的转基因沉默。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法。本发明提供的根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法，包括将携带有植物表达载体的农杆菌液侵染甘蔗的胚性愈伤组织，通过筛选和增殖抗性愈伤组织，并诱导抗性愈伤组织获得甘蔗抗性芽，其中，所述的植物表达载体的基因表达盒两侧连有核质结合区序列。其中，所述的农杆菌菌株可为本领域公知的用于植物转化的任何菌株，优选为 EHA105 或 LBA4404。其中，所述的甘蔗胚性愈伤组织为叶片诱导的I型胚性愈伤组织连续继代培养 1 5代获得的II型胚性愈伤组织，优选为培养2 3代的II型胚性愈伤组织，所述的II 型胚性愈伤组织为富有光泽、颜色淡黄、分散性好且疏松的胚性愈伤组织。其中，所述的叶片诱导的I型胚性愈伤组织按如下方式获得取顶端生长点5 IOcm的甘蔗幼嫩叶片作为外植体，将其横切成0. 1 0. 2cm 厚的薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，26°C 暗培养20 40天至叶片上长满白色致密的I型胚性愈伤组织组织，其中所述的诱导培养基是以MS为基本培养基，并添加 2 3mg/L 的 2，4-D。 根据本发明，所述的胚性愈伤组织继代培养为沈V 28 V暗培养，20 30天继代 1次，继代培养基是以MS为基本培养基，并添加0. 5 lmg/L的2，4-D。根据本发明，所述的筛选和增殖抗性愈伤组织为将侵染后的胚性愈伤组织转接到愈伤组织筛选增殖培养基中，26°C 暗培养，20 25天后选取再生的淡黄色、分散性好的愈伤组织进行继代，连续继代1 5代，优选继代2 3代，其中，所述的愈伤组织筛选增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加lmg/L的2，4-D和50mg/L的潮霉素(Hyg)和 300 500mg/L的羧苄青霉素(Carb)。根据本发明，将获得的抗性愈伤组织接种至愈伤组织继代培养基进行恢复培养 3 5天，再转接至抗性芽分化培养基，^rc 光照培养，诱导丛生芽，其中所述的抗性芽分化培养基是以MS为基本培养基，并添加1. 0 2. Omg/L的6_BA、0. 05 0. lmg/L的 NAA、50mg/L的潮霉素(Hyg)和300 500mg/L的羧苄青霉素(Carb)。
根据本发明，本发明提供的根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化还包括将1 2cm的丛生芽剥离成2-3株芽/丛，移至壮苗培养基进行壮苗培养2 3周，^TC 光照培养，待抗性苗长至3 km时，转入生根培养基诱导生根，26°C 光照培养，其中，所述的壮苗培养基是以MS为基本培养基，并添加0. 5 1. Omg/L的6_BA、0. 01 0. 05mg/L的 NAA、30mg/L的潮霉素和100 300mg/L的羧苄青霉素(Carb)，所述抗性苗生根培养基是以 MS为基本培养基，其中大量元素减半，并添加1. 0 4. 0mg/LNAA、30mg/L的潮霉素(Hyg)和 100 200mg/L的羧苄青霉素。本发明所述的培养基未有特殊说明均是指固体培养基，而且均含有30g/L的蔗糖和8g/L的琼脂。本发明通过将甘蔗I型胚性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基内进行连续继代培养1 5代，优选继代2 3代，获得大量富有光泽、颜色淡黄、分散性好的松散的II型胚性愈伤组织。以II型胚性愈伤组织为转化受体，克服了脱分化愈伤组织在转化中的严重不足，并进一步提高转化效率，且以II型胚性组织为转化受体，不受植株生长时期、 季节及气候等自然条件的限制，提高了效率。抗性胚性愈伤组织增殖能力强，在不影响胚性愈伤组织芽分化能力和植株变异的基础上，选择适宜的继代次数，能大大增加抗性胚性愈伤组织的数量，增加诱导抗性苗的数量，为获得大量的转基因植株提供筛选。本发明将MARs序列构建到植物表达载体表达盒的两侧，MAR序列介导的转基因， 单颗抗性愈伤组织能平均再生出4. 18株抗Hyg抗性植株，无MAR序列介导的转基因，单颗抗性愈伤组织平均再生出3. O株抗Hyg抗性植株，转化获得的抗性愈伤的平均再生植株数提高了 39. 33%。本发明工艺流程简单，成本低，MAR序列介导杀虫融合基因对甘蔗遗传转化，提高了甘蔗外源基因转化效率和成苗率，具有很大的科学研究及应用价值。
图1为植物表达载体的T-DNA结构示意图。其中，I，pC2MAR-Hyg-AVA ；II, PC13-AVA。图2为甘蔗抗性愈伤组织。图3为甘蔗抗性苗诱导。图4为甘蔗抗性苗。图5为转基因甘蔗植株。图6为转基因甘蔗植株PCR检测。其中，1 :DL-2000 ；2 非转基因植物；3 5 含 MAR序列的转基因甘蔗；6 8 不含MAR序列的转基因甘蔗。图7转基因甘蔗植株PCR-Southern检测。1 野生型；2 5 含MAR序列的转基因甘蔗；6 8 不含MAR序列的转基因甘蔗；9 质粒pC2MAR-AVAPCR产物。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1胚性愈伤组织制备
选生长健壮的甘蔗品种台糖25号植株尾梢，用70%乙醇消毒表面，取其距顶端生长点约IOcm左右的幼嫩叶组织作为外植体，将其横切成0. 1-0. 2cm厚的薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基MS+2，4-D ang/L上，26°C 暗培养40天，叶片上长满白色致密的愈伤组织，即得I型胚性愈伤组织。挑取初代胚性愈伤组织接入胚性愈伤组织培养基MS+2，4_Dlmg/L内进行继代增殖培养，26°C 暗培养，20 30天继代1次；这些胚性愈伤组织进一步诱导出大量的富有光泽、颜色淡黄、分散性好的松散的II型胚性愈伤组织。 实施例2胚性愈伤组织制备选生长健壮的甘蔗品种台糖25号植株尾梢，用70%乙醇消毒表面，取其距顶端生长点约IOcm左右的幼嫩叶组织作为外植体，将其横切成0. 1 0. 2cm厚的薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基MS+2，4-D :3mg/L上，26°C 暗培养20天，叶片上长满白色致密的愈伤组织，即得I型胚性愈伤组织。挑取初代愈伤组织接入胚性愈伤组织培养基MS+2，4_D lmg/L内进行继代增殖培养，26°C 暗培养，20 30天继代1次；这些胚性愈伤组织进一步诱导出大量的富有光泽、颜色淡黄、分散性好的松散的II型胚性愈伤组织。实施例3抗生素筛选愈伤组织继代培养阶段潮霉素(Hyg)设置6个梯度浓度(0、10. 0,20. 0,30. 0、 40. 0,50. Omg/L)。选取生长旺盛实施例1制备的II型胚性愈伤组织(大小约Icm2)为实验材料，接种在含有潮霉素的继代增殖培养基MS+2，4-Dl. Omg/L的培养基上，在^TC 黑暗条件下培养，每20天转接一次新鲜培养基，每种浓度接种5个培养皿，每皿接10块材料，每10天观察一次试验结果，记录愈伤组织生长情况，40天后统计结果。根据愈伤组织的生长情况确定Hyg质量浓度。不定芽分化培养阶段潮霉素(Hyg)设置6个梯度浓度(0、10. 0、20. 0、30. 0、 40. 0,50. Omg/L)。选取生长旺盛的实施例1制备的II型胚性愈伤组织(大小约Icm2)为实验材料，接种在含有潮霉素的芽分化培养基MS+6-BA2. 0mg/L+NAA0. lmg/L培养基上，在
，每天14小时2000Lx光照条件下培养，每20天转接一次新鲜培养基，每种浓度接种5瓶，每瓶10块材料，每10天观察一次试验结果，40天后记录芽分化情况，40天后统计结果。根据愈伤组织的分化情况确定Hyg质量浓度。生根培养阶段潮霉素(Hyg)设置6个梯度浓度(0、10. 0、20. 0、30. 0、40. 0、 50. 0mg/L)。选取生长旺盛、长势一致、株高3 km的分化苗，接种在含有潮霉素的生根培养基1/2MS(大量元素减量)+NAA4. 0mg/L上，在 ^°C，每天14小时2000 4000Lx 光照条件下培养，每种浓度接种5瓶，每瓶10株分化苗，每10天观察一次试验结果，记录生根情况，40天后统计结果。根据芽苗发根情况确定生根筛选的Hyg质量浓度。结果表明，愈伤组织继代培养和不定芽分化阶段使用的Hyg浓度为50mg/L ；不定芽生根筛选的Hyg质量浓度为30mg/L。实施例4植物表达载体的构建pCAMBIA1200、pBI121、pGA1611、pCMABIA1300、pBIlOl. 2、因组 DNA 中克隆野苋菜凝集素基因(AVA)，序列如SEQ ID No.5所示。将获得的PCR产物经过胶回收，连接到 pGEM-3zf/T载体上，获得重组质粒pAVA
6
HindIII和KpnI酶切(T4DNA聚合酶补平)植物表达载体pGA1611 (含W^i启动子)，与用HindIII和EcoRI酶切(T4DNA聚合酶补平)pAVA获得的野苋菜凝集素基因AVA 片段连接，得到植物表达载体pGAAVA。BamHI酶切质粒pGAAVA，补平，再用McI酶切，获得 W^i-AVA片段。pBIlOl. 2用HindIII酶切，补平，再用^icI酶切，获得去除35S启动子和⑶S 基因的线性载体，两者相连，得到植物表达载体pBIAVA。用EcoRI和HindIII双酶切pBIAVA 和pC2MARHyg，回收的小片段和线性载体连接，转化感受态细胞大肠杆菌感受态DH5 α细胞，最终获得含有顺向重复MAR的抗虫融合基因高效植物表达载体pC2MAR-Hyg-AVA，如图 I-I所示。用EcoRI和HindIII双酶切pCMABIA1300和pBIAVA这两种质粒，胶回 收线性载体和目的基因片段(Wii-AVA-TNOS)，定向连接并转化JM109，获得不含MAR序列的重组质粒 PC13-AVA。将构建好的植物表达载体质粒转化农杆菌EHA105，通过在含有100mg/L潮霉素 (Hyg)和80mg/L的利福平(Rif)的YEP平板上筛选获得阳性克隆。实施例5农杆菌介导的遗传转化利用农杆菌介导法，以继代增殖的胚性愈伤组织为受体材料进行遗传转化。挑取实施例4构建的EHA105/pC2MAR-Hyg-AVA和EHA105/pC13_AVA农杆菌单菌落分别接种到IOmL YEP液体培养基中，28°C，200rpm振荡培养至对数生长期。取ImL菌液放入50mL含有相同抗生素的YEP培养基中，农杆菌菌液培养至OD为0. 5-0. 6时，重悬于等体积含200ymol/L乙酰丁香酮(AS)的MR液体培养基中，因组DNA中克隆野苋菜凝集素基因 (AVA)，序列如SEQ ID No. 5所示。将获得的PCR产物经过胶回收，连接到pGEM_3zf/T载体上，获得重组质粒PAVAHindIII和KpnI酶切(T4DNA聚合酶补平)植物表达载体pGA1611 (含Ubi启动子)，与用HindIII和EcoRI酶切(T4DNA聚合酶补平)pAVA获得的野苋菜凝集素基因AVA 片段连接，得到植物表达载体pGAAVA。BamHI酶切质粒pGAAVA，补平，再用McI酶切，获得 W^i-AVA片段。pBIlOl. 2用HindIII酶切，补平，再用^icI酶切，获得去除35S启动子和⑶S 基因的线性载体，两者相连，得到植物表达载体pBIAVA。用EcoRI和HindIII双酶切pBIAVA 和pC2MARHyg，回收的小片段和线性载体连接，转化感受态细胞大肠杆菌感受态DH5 α细胞，最终获得含有顺向重复MAR的抗虫融合基因高效植物表达载体pC2MAR-Hyg-AVA，如图 I-I所示。用EcoRI和HindIII双酶切pCMABIA1300和pBIAVA这两种质粒，胶回收线性载体和目的基因片段(Wii-AVA-TNOS)，定向连接并转化JM109，获得不含MAR序列的重组质粒 PC13-AVA。将构建好的植物表达载体质粒转化农杆菌EHA105，通过在含有100mg/L潮霉素 (Hyg)和80mg/L的利福平(Rif)的YEP平板上筛选获得阳性克隆。实施例5农杆菌介导的遗传转化利用农杆菌介导法，以继代增殖的胚性愈伤组织为受体材料进行遗传转化。挑取实施例4构建的EHA105/pC2MAR-Hyg-AVA和EHA105/pC13_AVA农杆菌单菌落分别接种到IOmL YEP液体培养基中，28°C，200rpm振荡培养至对数生长期。取ImL菌液放入50mL含有相同抗生素的YEP培养基中，农杆菌菌液培养至OD为0. 5-0. 6时，重悬于等体积含200 μ mol/L乙酰丁香酮(AS)的MR液体培养基中，28°C，200rpm培养池，诱导细菌Vir 基因的表达。抗生素使用链霉素(MrUSyg/LRif 25yg/L0选取在胚性愈伤组织继代增殖培养基上生长旺盛的甘蔗胚性愈伤组织转移至新鲜的继代增殖培养基上培养4d，活化后的愈伤组织作为转化材料。用镊子将其夹碎成Imm2 大小，置于超净工作台吹风30-60min，使组织块表面呈干缩状态。转至培养皿中，分别加入用 AS (终浓度为 200 μ mol/L)活化 2h 的 EHA105/pC2MAR-Hyg_AVA 和 EHA105/pC13_AVA 农杆菌菌液，浸染45min，期间轻微振荡。用无菌滤纸将菌液吸干后转接到无抗生素含 100 μ mol/L AS的MS培养基上，23°C黑暗共培养4d。再转入到附加有500mg/L羧苄青霉素 (Carb)和50mg/L潮霉素(Hyg)的抗性继代增殖筛选培养基中，在^TC 黑暗条件下培养，每2周转接1次新鲜的筛选培养基诱导抗性胚性愈伤组织(图幻。所述抗性胚性愈伤组织继代增殖培养基是以继代增殖培养基为基本培养基，并添加潮霉素Hyg(50mg/L)、羧苄青霉素Carb (500mg/L)。所述MR液体培养基是以MS培养基为基本培养基，其中大量元素减量，并添加 2，4-D(l. Omg/L)、AS (200 μ mol/L)、果糖(10mmol/L)、葡萄糖(10mmol/L)、蔗糖 (30g/L)，pH5.3。所述共培养基是以继代增殖培养基为基本培养基，并添加AS (100 μ mol/ L)。
抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程经过转化和筛选过程，从褐化的胚性愈伤组织内再生淡黄的、分散性好的颗粒状抗性胚性愈伤组织。将抗性胚性愈伤组织接入抗性胚性愈伤组织继代增殖培养基上，在26°C 黑暗条件下培养，每20天转接一次新鲜培养基，进行2代继代增殖，以增加抗性胚性愈伤组织的数量。经过抗性继代筛选过程， 可以进一步把非转化细胞杀死，提高转化率，同时可以获得大量的抗性胚性愈伤组织。所述抗性胚性愈伤组织继代增殖培养基是以继代增殖培养基为基本培养基，并添加潮霉素 Hyg(50mg/L)、羧苄青霉素 Carb (500mg/L)。继代后的抗性愈伤组织分化出苗的培养过程将继代增殖后的抗性胚性愈伤转至无抗生素的继代增殖培养基上恢复培养4d，然后转入抗性芽分化培养基诱导出苗，26°C ^°C，每天2000 4000Lx光照14小时诱导出芽(图幻。所述抗性芽分化培养基是以 MS培养基为基本培养基，并添加6-BA (2. 0mg/L)、NAA (0. lmg/L)、蔗糖(30g/L)、潮霉素 Hyg(50mg/L)、羧苄青霉素 Carb (500mg/L)。抗性苗生根的培养过程经过筛选、分化，待抗性苗长至2cm时，将丛芽剥离成单芽移至壮苗培养基中进行壮苗培养2周(图4)，26°C ^°C，每天2000 4000Lx光照14 小时。待抗性苗长至3cm时，转入生根培养基诱导生根 ^°C，每天2000 4000Lx 光照14小时诱导生根。约长出10条根左右，打开瓶盖移至室外炼苗，2d后将小苗取出，用流水洗净附着的培养基，放在80%空气相对湿度的(25°C)的温室中培养，待苗成活后分单株种植于装有营养土的盘中，获得转化甘蔗植株(图幻。所述壮苗培养基是以MS为基本培养基，并添加 1. 0mg/L 6-BA、0. 05mg/L NAA、蔗糖(30g/L)、300mg/L Carb、30mg/L Hyg ；所述抗性苗生根培养基是以MS为基本培养基，其中大量元素减量，并添加4. 0mg/L NAA、30mg/L Hyg、200mg/L Carb0实施例6甘蔗抗性苗检测对实施例5 制备的 EHA105/pC2MAR-Hyg-AVA 和 EHA105/pC13_AVA 抗性苗，分别进行基因组DNA的提取和PCR检测，以非转基因苗为对照。其中用于PCR检测的引物如SEQCN 102154364 A
说明书
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ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。部分抗性苗的PCR检测如图6所示。(AVA基因的特异引物 (5 ‘ -GGAAGATCTACCATGGCGGGATTACCAGTG-3‘ )(SEQ ID No. 6)和(5 ‘ -AGCGTCGACTTAGTTG TTGGATCCCAATTC-3‘ ) (SEQ ID No. 7)进行 PCR 扩增，两引物间 DNA 片段长度约为 1900bp。 以非转化甘蔗植株作为对照。以PCR阳性的转化植株DNA为检测样品，回收PCR产物，分别点样于尼龙膜上。杂交分析的探针由/PC13-AVA特异扩增的AVA基因片段制备，探针标记及杂交采用Roche公司的 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 试剂盒。设计非转化植株作为对照。用EHA105/pC2MAR-Hyg-AVA转化了 200块的II型胚性愈伤组织，获得了 92株抗性苗，其中85株PCR阳性植株，PCR-Southern杂交阳性植株为83株，转化效率为38% (转化效率=检测阳性植株数量/接种愈伤数量)，筛选率为90. 22% (筛选率=检测阳性植株数量/抗性植株数)；用EHA105/pC13-AVA转化了 200块的II型胚性愈伤组织，获得了 42株抗性苗，其中36株PCR阳性植株，PCR-Southern杂交阳性植株为27株，转化效率为13. 5% (转化效率=检测阳性植株数量/接种愈伤数量)，筛选率为64. 29% (筛选率=检测阳性植株数量/抗性植株数)。部分PCR阳性苗的PCR-Southern杂交结果如图7所示。MAR序列介导转基因表达的pC2MAR-Hyg-AVA质粒共获得22个基因系，无MAR序列介导转基因表达的PC13-AVA质粒获得14个基因系，MAR序列介导转基因表达使得转化过程中转基因系的获得数量比无MAR序列介导转基因表达的提高了 57. 14%。MAR序列介导转基因表达单颗抗性愈伤组织平均再生出4. 18株抗Hyg抗性植株，无MAR序列介导的转基因表达单颗抗性愈伤组织平均再生出3. O株抗Hyg抗性植株，转化获得的抗性愈伤的平均再生植株数提高了 39.33%。大部分抗性植株形态正常，株型较壮，发根也正常，根系较粗壮、 长。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种根癌农杆菌介导的甘蔗高效遗传转化方法，其特征在于，包括将携带有植物表达载体的农杆菌液侵染甘蔗的胚性愈伤组织，通过筛选和增殖抗性愈伤组织，并诱导抗性愈伤组织获得甘蔗抗性芽，其中，所述的植物表达载体的基因表达盒两侧连有核质结合区序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甘蔗胚性愈伤组织为叶片诱导的I 型胚性愈伤组织连续继代培养1 5代获得的II型胚性愈伤组织。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的甘蔗胚性愈伤组织为叶片诱导的I 型愈伤组织连续继代培养2 3代获得的II型胚性愈伤组织。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的叶片诱导的I型胚性愈伤组织按如下方式获得取顶端生长点5 IOcm的甘蔗幼嫩叶片作为外植体，将其横切成0. 1 0. 2cm厚的薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，26°C 暗培养20-40天至叶片上长满白色致密的I型胚性愈伤组织，其中所述的诱导培养基是以MS为基本培养基，并添加2 ;3mg/L的 2 A-O0
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的继代培养为^TC 暗培养，20 30天继代1次，继代培养基是以MS为基本培养基，并添加0. 5 lmg/L的2，4-D。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的筛选和增殖抗性愈伤组织为将侵染后的胚性愈伤组织转接到愈伤组织筛选增殖培养基中，26°C 暗培养，20 25天后选取再生的淡黄色、分散性好的愈伤组织进行继代增殖，连续继代1 5代，其中，所述的愈伤组织筛选增殖培养基是以MS为基本培养基，并添加lmg/L的2，4-D和50mg/L的潮霉素和300 500mg/L的羧苄青霉素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的连续继代的代数为2 3代。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将抗性愈伤组织接种至继代培养基恢复培养3 5天，再转接至抗性芽分化培养基，^rc 光照培养，诱导丛生芽，其中所述的抗性芽分化培养基是以MS为基本培养基，并添加1. 0 2. Omg/L的6_BA、0. 05 0. lmg/L 的NAA、50mg/L的潮霉素和300 500mg/L的羧苄青霉素。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将1 2cm的丛生芽剥离成2-3株芽/丛，移至壮苗培养基进行壮苗培养2 3周，26°C ，光照培养，待抗性苗长至3 km时，转入生根培养基诱导生根 光照培养，其中，所述的壮苗培养基是以MS 为基本培养基，并添加0. 5 1. Omg/L的6-BA、0. 01 0. 05mg/L的NAA、30mg/L的潮霉素和100 300mg/L的羧苄青霉素，所述抗性苗生根培养基是以MS为基本培养基，其中大量元素减半，并添加1. 0 4. 0mg/LNAA、30mg/L的潮霉素和100 200mg/L的羧苄青霉素。
全文摘要
本发明公开了一种根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化方法，包括将携带有植物表达载体的农杆菌液侵染甘蔗的胚性愈伤组织，通过筛选和增殖抗性愈伤组织，并诱导抗性愈伤组织获得甘蔗抗性芽，其中，所述的植物表达载体的基因表达盒两侧连有核质结合区序列。本发明将MARs序列构建到植物表达载体表达盒的两侧，其大大提高了甘蔗外源基因转化效率和成苗率，而且工艺流程简单，成本低。
文档编号A01H5/00GK102154364SQ201010623788
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者李杨瑞, 李楠, 胡春锦, 邓智年, 郭文峰, 魏源文 申请人:广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室