专利名称：产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其于2010年12月27日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，寄存编号CGMCC No4504，也寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC 930118。
背景技术：
牛樟芝菌属真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、担子菌亚门 (Basidiomycotina)、同担子菌纲(Homobasidiomycetes)、无裙菌目(Aphyllopforales)、 多孑L菌科(Polyporaceae)、薄孑L菌属(Antrodiella) (Hawksworth et al.，1996)。棒芝属多年生，子实体呈扁平型(resupinate)，具有强烈樟树香气，外形为板状或钟状，无柄。担孢子为圆柱型且薄壁平滑，不具有缠绕菌丝，为褐腐型木材腐朽菌等。但由菌丝培养发现牛樟芝菌丝具有节孢子(arthroconidia)，而在其他薄孔菌属的种类中尚未有此结构的报导 (Chang and Chou，1995)。牛樟树因具有强烈的黄樟香气味，可以作为驱虫剂，使得一般真菌无法生存于牛樟树上。樟芝为少数可生长于牛樟树的真菌，其子实体的钟面新鲜时为橘红色，有着“中国台湾森林红宝石”的美誉。板底层有浅黄白色的木栓质，藉此木栓质附着在牛樟树中空心材的内壁上生长。钟状型态者，子实层钟面呈橘红色，整面充满菌孔，菌孔微细绵密，每毫米有4-5个，管口小，呈深红色。菌孔多为0.4-0. 6毫米(mm)，圆形至角形， 内有孢子，担孢子(basidiospore)为卵圆形，有双层壁，外壁透明，内壁金褐色，具分离或连接的棘状突起，孢径14-19X7. 8-14. 4微米(μ m)。樟芝以 Ganoderma comphoratum 的名首次发表于 1990 年(Zang and Su, 1990)。1995年，张东柱与周文能针对樟芝子实体外观、气味、生长速率与孢子显微结构作详尽的记述，以新种发表并将其学名命名为Antrodiacinnamomea(Chang and Chou, 1995)。1997年吴声华等人依照国际植物命名规则Gnternational Code of Botanical Nomenclature ；ICBN)，命名时必须使用较早一篇所使用的种名，因此提出新组合名 Antrodiacamphorate (ffu et al.，1997)。2004年，张东柱与周文能再提出樟芝种名应该依其宿主牛樟树(Cinnamomea kanehirai Hayata)，种名不易被混淆，此命名也符合ICBN命名的规定，Antrodia cinnamomea才是真正的名(Chang and Chou，2004)。综上所述，因为从中国台湾各地采集分离的牛樟芝菌具有不同菌丝体及外部型态，多数学者都以传统的型态学观察来做菌种的鉴别然而利用菌种型态学的分类却容易导致鉴别上辨识的差错。近来，因分子生物技术的跃进，许多专家学者开始由分子及生化层次上来研究物种亲缘性，使物种的侦测、诊断与分类更具有客观与准确性。基因体层次了解菌系系统之间的关系，因其可由序列提供分析，故可获得比较正确的资讯。于是，2004年吴声华等人利用核醣体去氧核醣核酸的大次单兀(large subunit of ribosome deoxyribonucleic Acid, LSU rDNA)序列进行亲缘关系的研究。LSU rDNA序歹Ij分析结果显示Taiwanofunguscamphoratus与Antrodia 和Antrodiella的亲缘性并不接近。因而提出多孔菌新属台芝属(Taiwanofungus)，将樟芝独立归类成台芝属(Taiwanofimgus) (ffu et al.，2004)。虽然樟芝在属的分类层级上，目前仍具有争议，但樟芝作为独立的一种并无问题。樟芝的别名还有“樟菇”、“樟菰”、“樟窟内菰”、“牛樟菇”、“牛樟芝”、“红樟”、“红樟
芝”等。它被民间视为“灵芝之王”，是中国台湾特有种真菌。仅生长于中国台湾山区海拔 200 2000米高的牛樟树干的心材内壁或是枯死的牛樟木阴暗潮湿表面，因为樟芝具有极高的宿主专一性，而牛樟树因滥采造成其数量日渐稀少，因此樟芝目前在自然界中的产量极为稀少，成为本土的保育物种之一。牛樟芝菌菌种鉴定方法有菌丝形态学鉴定、分子鉴定(真菌的核醣体去氧核醣核酸(rDNA)序列、真菌的ITS、5. 8S核醣体去氧核醣核酸(rDNA)、ITS-PCR限制酶片段长度多型性)等。牛樟芝含有许多的生理活性成份，例如三萜类化合物、超氧歧化酵素、腺甘、多醣体(如β-D-葡聚醣)、蛋白质(含免疫蛋白)、维生素(如维生素B、烟碱酸、麦角固醇)、 微量元素(如钙、磷、锗)、核酸、凝集素、氨基酸、固醇类、木质素、血压稳定物质等。其具备的生理活性功能包括有抗肿瘤、增加免疫能力、抗病毒、抗过敏、抗高血压、抑制血小板凝集、降血糖、降胆固醉、抗细菌、保护肝脏等。樟芝保肝解酒解毒的疗效在民间流传甚久， 被认为有促进健康及预防疾病的功能。目前为止有关樟芝疗效科学性的研究主要为保肝解毒、抗菌、抗氧化及抗癌等方面的研究。樟芝的种类不下数十种，其野生种活性成分高，但因其专一性宿主牛樟树遭滥采而日渐稀少，目前采用人工栽种培养，其栽植不易且活性成分是否与野生种相同甚至含量更高则需仰赖其他技术加以突破及验证。
发明内容
有鉴于牛樟芝菌野生种活性成分高但稀少，而人工栽种培养却不易，加上其活性成分皆有限，故本发明利用筛选培养基进行菌种筛选分离，并以牛樟芝菌种亲缘关系进行菌种鉴定，找出一株新颖性分离株，并利用相同培养基及培养条件，使分离株可在该培养条件下生长。为此，我们选择四株牛樟芝菌，包括食品工业发展研究所中所收集的两株樟芝分离株(BCRC36401、BCRC36711)及光晟自行分离的牛樟芝菌BRTC-0406与BRTC-1204进行菌种亲缘关系的差异分析，并利用樟芝含有三萜类的特性以高效能液相层析仪(HPLC)的层析指纹图谱差异分析，意外发现分离株BRTC-1204能产生较高的三萜类化合物。本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，是一种经分离的牛樟芝菌，是寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC930118。本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。前述的产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其中所述的牛樟芝菌是分离取自一牛樟木的牛樟芝菌。前述的产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其中所述的牛樟芝菌其具有牛樟芝菌的所有被鉴知的特性。前述的产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其中所述的牛樟芝菌产生较高量的三萜类化合物。前述的产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其中所述的牛樟芝菌产生的三萜类化合物具有所有三萜类被鉴知的功效。分离株的菌种亲缘关系差异分析以下述方法进行菌种鉴定一、菌丝形态学以肉眼观察分离株在洋菜培养基上的菌丝型态，包括菌丝型态、颜色等。二、分子鉴定A.真菌的核醣体去氧核醣核酸(rDNA)基因序列核醣体去氧核醣核酸(rDNA)呈纵线排列头尾相连的重复性基因，每个重复单元包含了小次单元(small subunit，SSU) 16_18S、5. 8S及大次单元(Large subunit，LSU) 23-28S 基因，这三个角军石马区(coding region) 1 ITSl (internal transcribed spacer, ITS)与 ITS2 隔开。SSU 与 LSU 由外间隔区(External spacer)或称 IGS (Inter-genicspacer，基因间隔区)区隔，5.8S基因则位于ITSl与ITS2之间。由于身兼细胞中所有蛋白质合成的任务，核醣体去氧核醣核酸(rDNA)在不同物种间的演化相当保守(conservation)且在基因组中数量丰富，因此常被用来鉴别不同种的微生物。樟芝的核醣体去氧核醣核酸(rDNA)大致上可分为18S、ITS1、5. 8S、ITS2及28S区域。在18S核醣体去氧核醣核酸(rDNA)序列，基因长度约1700碱基(bp)大小，种间的相似度在96%以上，18S核醣体去氧核醣核酸(rDNA) 序列具有演化中高保守性优点(Woese and Olsen, 1996 ；Medlin et al.，1988 Jorgensen et al.，1989)，可被作为属之间的分类依据(Dams et al.，1988 ；Kelly and Cox，1982)，需将整段基因分段定序方可完成。B.真菌的ITS及5. 8S核醣体去氧核醣核酸(rDNA)基因序列ITS核醣体去氧核醣核酸(rDNA)的基因序列多型性分析，在真菌的菌种分类与菌种鉴定上是一个有用的技术。在核醣体去氧核醣核酸(rDNA)中ITS和5. 8S基因序列的演化速度较快，常被用来研究同一属中种间的研究(White et al.，1990)。ITS1、5.8S及ITS2 核醣体去氧核醣核酸(rDNA)序列长度共约为610碱基(bp)，基因定序便利，序列演化变异度大于18S与LSU核醣体去氧核醣核酸(rDNA)，在鉴种上扮演重要的地位。C. ITS-PCR 限制片段长度多型性(Restriction fragment lengthpolymorphism, RFLP)DNA为基础的生物技术已被广泛的应用于生物多样性。当DNA中任一核苷酸发生变异的时候，如果其变异的位置正好位于某限制酵素的切点位置时，会造成该限制酶切点的消失。这种情形可由DNA经限制酶切割后的产物片段的大小加以监控。这种由于限制酶切割片段大小的不同所观察到的变异称之为限制片段长度多型性(restriction fragment lengthpolymorphism,简禾尔 RFLP)。RFLP即是早期被使用于探讨生物族群变异的技术之一，被广泛应用于各生物样品的起源探讨(Cespedes A et al.，1998 ；Partis L et al.，2000 ；Abdulmawjood A and Μ, 2002 ；Stefos G et al. ,2004.) 依据特定基因的限制酶(restriction enzyme)切割位置来比较生物间的亲缘关系。PCR-RFLP是先经由PCR技术复制放大一段特定的DNA序列，再由限制酶图谱(restriction map)分析此段序列的特异切位，藉由片段的多样性来判读评比对不同来源基因序列的差异性。利用ITS-PCR RFLP可以鉴定真菌菌种间的分类(Berthier et al. , 1996 ；Martin and Rygiewicz,2005)。三、指纹图谱差异分析CN 102523910 A对于不同的中药(包括药材和中药复方制剂)，其主要差异在于所含化学成分(主要是特征性化学成分)及其相对组合方式的不同。由于特征性化学成分的结构特殊，因此具有不同生理活性。通过对植物化学成分的特性分析，用萃取分离方式去除那些存在于中药中的非活性成分，获取每种中药的具有特征性的化学成分；再根据不同的化合物具有不同的谱学特征，通过测定萃取物的色谱和光谱图谱(即指标成份的指纹图谱)来达到表征其相对化学组成和结构等化学特征的目的。而液相层析图谱在特定的分析条件下，会在特定的时间内展现其所含有的已知与未知成分的层析图谱，具有极高的鉴别度，且兼具定性药材真伪与药材全成分组成分布的特性，极具开发作为产品规格化工具的价值。以具有特征性的液相层析指纹图谱做为鉴别者也有文献报导。指纹图谱的作用除了可提供药材规格化的参考外，也可用于辨识不同药材，同时针对于中药制剂作全面品质之控制和检验是否有掺假情形。中药材是由非常多的化学物质按照特定的相对含量比例组合而成的复方制剂且由于中药材药效是多种化学物质综合作用的结果，因此，各化学成分的相对含量的阐明非常重要，本发明将利用液相层析的指纹图谱作为牛樟芝三萜类化合物的鉴别依据。三萜类化合物多有共轭体系存在，紫外吸收波长和强度很有规律，而在C11位存在羰基的化合物存在着八％)双键，这类化合物的紫外吸收多落在λ_253(ηπι)，Ioge在 3. 8 4.1之间，而C11位没有羰基的化合物，多存在着Δ7(8)、Δ9(11)共轭双键，因而紫外吸收在Xmax237(nm)，244(nm)，253(nm)有三个吸收峰。根据文献(食药用菇菌类保健食品产业发展汇编)指出经全波长紫外光全光谱扫描三萜类化合物在λ_Μ4(ηπι)可侦测到紫外光吸收信号的特性，且利用此波长分析发现菌丝体含有与子实体相同的三萜类化合物。因此本发明将利用液相层析的指纹图谱(波长M4nm)作为牛樟芝子实体中三萜类化合物的鉴别依据。本发明在于综合鉴定结果显示此分离株BRTC-1204为一种新颖性牛樟芝菌，并可产生较高量的三萜类化合物，其寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号 BCRC 930118。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
图1是不同菌株的菌丝形态的示意图。图2是亲缘演化树的示意图。图3是ITS-PCR RFLP利用限制酶&ipl作用结果的电泳图。图4是培养基+水培养102天的樟芝培养物指纹图谱。图5是培养基+BRTC1204培养102天的樟芝培养物指纹图谱。图6是培养基+BRTC0406培养102天的樟芝培养物指纹图谱。图7是培养基+BCRC36401培养102天的樟芝培养物指纹图谱。图8是培养基+BCRC36711培养102天的樟芝培养物指纹图谱。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌其具体实施方式
、结构、特征及其功效，详细说明如后。本发明菌株BRTC-1204是分离自牛樟木的樟芝分离株，经麦芽提取物琼脂(Malt Extract Agar) I (麦芽抽出液培养基Blakeslee' s i^ormula)作为筛选培养基进行菌种分离，其培养基成分为麦芽抽出液20.0克(Maltextract 20g)、葡萄糖20. 0克(Glucose 20. Og)、消化蛋白质10克(P印tonel. Og)、琼脂20. 0克(Agar 20. Og)、蒸馏水1公升 (Distilled water 1. 0L)，培养温度为摄氏25度(25°C )需氧培养。将分离的单一菌落进行分析，分离株BRTC-1204进行菌种鉴定。本发明主要是利用标准菌株BCRC36401、BCRC36711 (购自财团法人食品工业发展研究所生资中心)及光晟自行分离的牛樟芝菌BRTC0406与菌株BRTC-1204共计四株牛樟芝菌进行下述三种方法的分析(1)形态学分析O)分子生物鉴定技术中的18S 核醣体去氧核醣核酸(rDNA)基因序列分析、ITS核醣体去氧核醣核酸(rDNA)基因序列分析、5. 8S核醣体去氧核醣核酸(rDNA)基因序列分析及ITS-PCR限制片段长度多型性(Restrictionfragment length polymorphism, RFLP)分析与(3)利用液相层析的指纹图谱作为牛樟芝类子实体的鉴别依据，鉴定结果显示BRTC-1204为一新颖性牛樟芝菌 (Taiwanofungus Camphorata)01、形态学分析本发明菌种BRTC-1204此分离株为真菌，具有超氧歧化酶，菌丝呈白色而后会转成红色，菌丝形态结果显示如图1所示，已可看出与其他Taiwanofungus Camphorata菌种的歧异度。2、分子生物鉴定技术A.将本发明菌种BRTC-1204利用PCR扩增技术放大18S核醣体去氧核醣核酸 (rDNA)基因序列。所利用的引子如下18s-rDNA-NSl :5’ -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’18s-rDNA-NS4 :5，-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3，18s-rDNA-NS3 :5’ -GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3，18s-rDNA-NS8 :5’ -TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’PCR扩增技术放大18S rDN所得产物送基因组学(Genomics)生物科技公司进行序列的定序工作。结果所得18S rDNA基因序列1790碱基对，请见表1。运用基因序列资料库PubMed提供的软件BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool)与资料库中已知的牛樟芝菌株进比对，请见表2，若超过97%相似度以上可作为同种分类的判断，作为菌种鉴定的依据。本发明菌株结果显示 BRTC-1204 为 Taiwanofungus Camphorata。表1. 18S核醣体基因序列部分序列定序结果Sequence Data)序列长度为 1790(Length = 1790)GACTTTTTTTTTCAATTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAACAAGTTTGTACTGTG AAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTGCTTTGCTACATGGATAACTGTGGTAATTCTA GAGCTAATACATGCAATGAAGCCCCGACTCCTGGGAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCGGTTAGCCGCTCCATTGGTGATTCATAATAACTTGTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGTGATGCTTCATTCAAATATCTGCCCTAT CAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGG AGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTG ACAATAAATAACAATATAGGGCTCTTTCGGGTCTTATAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCTCTTAGCGAGGAACA ATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAGTTGTTGCAGTTAAAA AGCTCGTAGTTGAACTTCAGACCTGGCCGGGTGGTCTGCCTCACGGTATGTACTGTCTGGCTGGGTCTTATCTCTTG GTGAGCCGGCATGCCCTTTGCTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGATGTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTCAAAGCA GGCCTATGCCCGAATACATTAGCATGGAATAATAAAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGAGTCGCC GTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCATTAGTATTCAGTTGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTACTGAAGACTA ACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAGGTTAGGGGATCGAAAACGATCAGATAC CGTTGTAGTCTTAACAGTAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGATCTCAATTTTATGTGTCGCTCGGCACCTTACG AGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCA CCAGGTGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATGACTAGGATTGACAG ATTGATAGCTCTTTCATGATTTTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAAT TCCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTTAATAGTCAGGCTGGCTTTTGCTGGTCGCTGGCTTCTTAGAGGGACTG TCTGCGTCTAGCAGACGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCT ACACTGACAGAGCCAGCGAGTTTTTATTCCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCTTGTGAAACTCTGTCGTGCTGGGG ATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATACCTAGTAAGCGTGAGTCATCAGCTCGCGTTGATTACGTCC CTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGTCTTGGGATTGGCTTCGGGGAGC CGGCAACGGCATCCTGTTGCTGAGAACTTGATCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCC GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA表2BLAST 叠代搜索(Blast search)BRTC-1204 18S核醣体基因序列与已知菌种(樟芝菌)部分序列做比对有97. 0%
一致性
权利要求
1.一种产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其特征在于其是一种经分离的牛樟芝菌，是寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC930118。
2.根据权利要求1所述的产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其特征在于其中所述的牛樟芝菌是分离取自一牛樟木的牛樟芝菌。
3.根据权利要求1所述的产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其特征在于其中所述的牛樟芝菌其具有牛樟芝菌的所有被鉴知的特性。
4.根据权利要求1所述的产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其特征在于其中所述的牛樟芝菌产生较高量的三萜类化合物。
5.根据权利要求1所述的产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其特征在于其中所述的牛樟芝菌产生的三萜类化合物具有所有三萜类被鉴知的功效。
全文摘要
本发明是有关于一种产生高量三萜类化合物的新颖牛樟芝菌，其寄存于中国台湾新竹的食品工业发展研究所，寄存编号BCRC930118。
文档编号A01G1/04GK102523910SQ201010623230
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者吕春美, 李欣桦, 王樱谕, 薛如婷, 许清祥, 赖订颖 申请人:光晟生物科技股份有限公司