专利名称：一株抗病毒解淀粉芽孢杆菌的分离及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株抗病毒解淀粉芽孢杆菌的分离及其应用，属微生物农药技术领域，特别是涉及一种有效预防烟草病毒病，促进烟草生长并且能够显著增加烟叶产量的解淀粉芽孢杆菌。
背景技术：
病毒病是我国烟草上种类最多、危害最严重的一类病害，每年都给烟草生产造成巨大的经济损失。目前生产上没有同时抗几种病毒的烟草品种，也没有对病毒病特效的药剂，而大量施用农药既影响了烟叶质量，又污染了环境。如何有效预防烟草病毒病的发生是国内外科技工作者研究的热点问题。植物根际促生菌(PlantGrowth-Promoting Rhizobacteria，简称PGPR)是一类生存于植物根际、能促进植物生长的一类有益细菌。目前，关于PGI^R菌株诱导植物产生对真菌、细菌等抗性的研究较多，而应用PGPR防治植物病毒病的报道较少。Mann(1969)把Bacillus uniflagellatus施入土壤中，结果减少了烟草花叶病毒在珊西烟叶片上产生枯斑的数目。Maurhofer等(1994)用Pseudomonas fluorescens菌株CHAO处理烟草能够减少烟草坏死病毒引起病斑的数目和大小。De Meyer等(1999)用铜绿假单胞7NSK2处理烟草植株能够降低烟草花叶病毒侵染产生的枯斑大小。菌株SE34、 IN937a、IN937b和INl 14处理番茄幼苗能明显地降低番茄发病率和组织中黄瓜花叶病毒的含量，提高产量和株高(Zehnder，2000)。我们从毛豆根际分离到了解淀粉芽孢杆菌菌株YHN，该菌株能够促进烟草生长，有效降低烟草病毒病的发生，并能显著提高烟叶产量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株抗病毒解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) YHN 及其应用。本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌YHN，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏编号为CGMCC N0. 4442，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，邮政编码100101。保藏日期2010年12月8日。该菌株从菏泽毛豆根际土壤中分离，通过稀释培养获得30多个细菌菌落。以白地霉作为指示菌，筛选有抑菌活性的菌株。抑菌活性最强的一个命名为解淀粉芽孢杆菌YHN。 划线纯化后，经对峙培养证明解淀粉芽孢杆菌YHN对多种病原菌有良好的抑制作用，抑制率在；34%-67%。解淀粉芽孢杆菌 YHN 与 Bacillus amyloliquefaciens strain 5359 (序列号⑶250449) 16S rRNA基因一致率为99%，在根据16S rRNA基因构建的系统进化树中， 解淀粉芽孢杆菌YHN与Bacillus amyloliquefaciens的菌株聚类到一起，证实解淀粉芽孢杆菌YHN是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylol iquefaciens)的一个菌株。其16S rRNA核苷酸序列如SEQ. NO. 1所示。该菌株特点如下该菌株菌落圆形，灰白色，无光泽，初期边缘整齐，不透明，较粘，菌落初期扁平后期凹陷皱缩。革兰染色为阳性杆菌，周生多鞭毛。该菌好氧，分解D-葡萄糖、D-木糖、甘露醇和果糖。苯丙氨酸脱氢酶反应为阴性。水解酪素，水解明胶，水解淀粉，还原硝酸盐，不能产生&S，甲基红试验阴性，V. P.试验阳性，吲哚试验阴性；4°C不能生长，最适生长温度 28-300C ；适宜pH为7，pH为5. 7不能够生长。YHN的菌落特征和生理生化特性与解淀粉芽孢杆菌一致。该菌株应用在烟草中，对多种真菌具有抑制作用，尤其是能够有效降低烟草病毒病的发生，并能显著提高烟叶产量。
图IYHN对8种病原真菌的拮抗作用图中AAlternariaalternata B ^0 ^ ' Fusarium oxysporumC 5 ^ ^ Exserohilum turcicum DVerticillium albo-a trumE 苹果霉心病菌 Trichothecium roseum F 烟草炭疽病菌 Colletotrichum nicotianaeG苹果腐烂病菌Cytospora mali H烟草立牛古病菌Rhizoctonia solani图1说明本发明中的YHN对8种病原真菌(其中包括5种引起烟草病害)有良好的抑制作用，抑菌谱广。图2菌株YHN 16S rRNA基因的扩增图中 1 :YHN ；2 对照菌株 YHL ；M =Marker 图3用NJ法根据YHN和其它13个菌株的16S rRNA基因构建的系统进化树在根据16S rRNA基因构建的系统进化树中，YHN与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株聚类到一起，说明YHN是解淀粉芽孢杆菌的一个菌株。图4YHN处理对烟草花叶病毒的抑制作用图4显示YHN对烟草花叶病毒的抑制效果。上排为YHN处理的叶片，下排是未处理的叶片。YHN处理可使烟草花叶病毒引起的枯斑减少34. 8%。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照方中达《植病研究方法》和Sambrook等著《分子克隆》中所述的方法和条件。实施例1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) YHN的获得该菌株(YHN)分离自菏泽毛豆根际土壤。从毛豆根际取土样10g，加入到盛有 IOOmL无菌水的三角瓶中，制成土壤悬液。将三角瓶置摇床上，振荡20分钟，静置5分钟后取上清液。采用10倍系列稀释法，每个浓度吸取200 μ L于肉汤蛋白胨琼脂培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g, NaCl 5g，琼脂20g,蒸馏水补充至IOOOmL, pH 7. 2-7. 4)平板上涂布均勻， 每个浓度三次重复。然后将肉汤蛋白胨琼脂培养基平板于生化培养箱中倒置培养M 小时。待出现菌落时，喷施指示菌白地霉(Geotrichum candidum)孢子悬液，以喷布均勻为宜。12小时后观察，挑取产生抑菌圈的菌落，抑菌效果最好的一个代号定为YHN。通过三次划线进行纯化，利用对峙纯培养法测定抑菌谱(图1)。YHN菌落圆形，灰白色，无光泽，初期边缘整齐，不透明，较粘，菌落初期扁平后期凹陷皱缩。革兰染色为阳性杆菌，周生多鞭毛。该菌好氧，分解D-葡萄糖、D-木糖、甘露醇和果糖。苯丙氨酸脱氢酶反应为阴性。水解酪素，水解明胶，水解淀粉，还原硝酸盐，不能产生 H2S，甲基红试验阴性，V.P.试验阳性，吲哚试验阴性；4°C不能生长，最适生长温度
适宜PH为7，pH为5. 7不能够生长。YHN的菌落特征和生理生化特性与解淀粉芽孢杆菌一致。提取YHN 基因组 DNA。利用引物 16S_8_F(5' -CAC GGA TCC AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3')和 ITS-R(5 ‘ -CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3 ‘)，通过 PCR 扩增 16S rDNA(图 2)。PCR 反应程序是 94°C 3min ；94°C 30s ；54°C 45s ；72°C 2min ；30 个循环；72°C 延伸IOmin ;4°C保存。扩增产物连接到pMD18_T。连接反应体系为10XT4DNA连接酶缓冲液 1 μ L，pMD18-T (50ng/ μ L) 0· 3 μ L，目的 DNA7. 7 μ L, T4DNA 连接酶(350U/ μ L) 1 μ L, 16°C 水浴中连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5ci。提取质粒DNA，通过电泳和PCR筛选阳性克隆。鉴定好的含有重组质粒的菌株，以菌液形式送北京博尚公司测序。利用Mega软件构建系统进化树(图3)。YHN 与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株 5359(序列号 ⑶250449) 16S rRNA基因的一致率为99 %，在根据16S rRNA基因构建的系统进化树中，YHN与解淀粉芽孢杆菌的菌株聚类到一起，证实YHN是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的一个菌株。SEQID NO 1的信息
(a)序列特征:*长度1861碱基对；*类型=DNA ；*链型双链；*拓扑结构线性
(b)分子类型基因组DNA
(C)假设否
(d)反义否
(e)最初来源解淀粉芽孢杆菌YHN是从菏泽采集的毛豆根际土壤中分离的。
(f)序列描述
1TTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCCGGGTTTCCCCATTCGGAAATCTCCGGATCAAAGC
61TTGCTTACAGCTCCCCGAAGCATATCGGTGTTCGTCCCGTCCTTCATCGGCTCCTAGTGC
121CAAGGCATCCACCGTGCGCCCTTTCTAACTTAACCGTTAAAAAGAATCACTACGTGATAT
181CTTGCATTACTAATTGAATGTGAATTACTTCTGTTATCTAGTTTTCAAAGAACAACATCT
241CGAAGAATCAAATGATCCTTCAAAACTAAACAAGACAGGGAACGTTCTGTTTATAAGACC
301CAAGGTCTTATATTCCGTTAAAATCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGAT
361ACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCT
421AAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGT
481ACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGC
541TTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTT601AACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCA661TAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAC721CTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACT781TAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCC841CGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTC901GCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTT961GAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCAC1021TAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGT1081ATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGT1141CGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTC1201CACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGG1261GGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGA1321CAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTG1381GTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGA1441GCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCA1501TTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGT1561GTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCAC1621CAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTC1681TGAACCATGCGGTTCAAACAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAG1741TCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAAGGAGCAAG1801CTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCC1861ATAATCAACTCTGGATCCGTGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAA实施例2 =YHN抑菌谱的测定采用对峙培养法(Sijam等，2005)对表1中所列8个病原菌进行抑菌效果测定。 在直径为90mm的马铃薯葡萄糖琼脂平板中央分别接直径为9mm的上述病原菌菌饼，然后用封口膜封好平板，放入生化培养箱中培养两天。将直径为6mm的灭菌滤纸片蘸取准备好的解淀粉芽孢杆菌YHN菌液(107cfU/mL)，移到距离病原菌边缘15mm处，封口，最后放入
生化培养箱中培养(图1)。表1中每个病原菌按照上述步骤处理重复3次(重复)。 7天后测量抑菌圈直径，计算抑制率(表1)。表IYHN对病原菌的抑制率病原菌名称抑制率
烟草枯萎病菌(,iAsari· oxysporum)44%
烟草赤星病菌 Ulternaria alternata)36%
烟草黄萎病菌(Verticillium albo-atrum)37%烟草立枯病菌{Rhizoctonia sol an i)65% ')0^^ ^ (Colletotrichum nicotianae)51% 苹果腐烂病菌(Oio5pora /Hdi)34% 苹果霉心病菌roseum)62% 玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)67%实施例3 =YHN对烟草花叶病毒的室内抑制作用将YHN在肉汤蛋白胨琼脂培养基平板上划线，平板放入生化培养箱中培养 12h。用牙签挑单菌落放入盛有5mL液体LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容1L，高压灭菌)的试管中，28°C振荡培养14-1他。以1 100的接种量，将上述培养液接种于盛有IOOmL的三角瓶中，28°C振荡培养 14-1他。将菌液离心得到菌体，用适量无菌水冲洗，重悬，再次离心，重复冲洗两次；得到不含LB培养基的菌体，最后用无菌水将菌体调至终浓度为107cfu/mL。选取5-6叶期长势一致的三生烟(普通烟的一个品种)苗(Nicotiana tabacum cv. samsun)，每隔5天喷施菌悬液一次，共喷施3次，以清水处理作为对照。3次重复，每个重复10株三生烟苗。采用常规汁液摩擦接种法，在菌剂喷雾处理过的三生烟叶片上摩擦接种烟草花叶病毒，每株接第3、4、5个叶片。置于25°C光照培养箱中，3天后调查结果，记录枯斑数。YHN处理的叶片平均枯斑数为19. 4士2. 0，与对照8士4. 5)相比，处理的枯斑减少34. 8% (图4)。YHN对其它病毒在普通烟草(Nicotiana tabacum)其它品种上的发生也有抑制作用，能够降低发病率和发生程度。见实施例4。实施例4 :YHN用于大田防治烟草病毒病将实施例3中振荡培养14-1 的YHN菌液按1 %接种量接种到含LB培养基中，28°C ISOrpm摇床培养14-16小时，将培养好的菌液离心，弃上清，加少量水重悬。然后加清水调至终浓度约为107cfu/mL。在苗床期G月初)将菌液均勻喷施到烟草(品种为中烟 100) (Nicotiana tabacum cv Zhongyan 100)叶片上，间隔 10-15 天，共喷施两次。7 月底调查病害发生情况。病害分级标准按烟草行业标准YC/T39-1996规定执行与对照相比，处理的植株粗壮，明显高于对照，每株叶片数达到20-22片，普遍高于对照的17-20片。处理的病情指数为18. 17，对照病情指数为48. 25，防效为62. 34%。与对照相比，处理田可增产烟叶10-20%。该菌株应用在烟草中，对多种真菌具有抑制作用，尤其是能够有效降低烟草病毒病的发生，并能显著提高烟叶产量。
权利要求
1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于命名为解淀粉芽孢杆菌YHN，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称=CGMCC ；保藏号CGMCC NO. 4442 ； 其16S rRNA核苷酸序列如SEQ. NO. 1所示。
2.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌YHN，其特征在于该菌株分离自菏泽毛豆根际土壤，该菌株菌落圆形，灰白色，无光泽，初期边缘整齐，不透明，较粘，菌落初期扁平后期凹陷皱缩；革兰染色为阳性杆菌，周生多鞭毛；该菌好氧，分解D-葡萄糖、D-木糖、甘露醇和果糖；苯丙氨酸脱氢酶反应为阴性；水解酪素，水解明胶，水解淀粉，还原硝酸盐，不能产生H2S，甲基红试验阴性，V. P.试验阳性，吲哚试验阴性；4°C不能生长，最适生长温度 28-300C ；适宜pH为7，pH为5. 7不能够生长。
3.解淀粉芽孢杆菌YHN在烟草中抗病毒的应用，并可提高烟叶产量。
全文摘要
本发明涉及一株抗病毒解淀粉芽孢杆菌的分离及其应用，属微生物农药技术领域。该菌株为解淀粉芽孢杆菌YHN，分离自菏泽毛豆根际土壤，其保藏编号CGMCC NO.4442；该菌在烟草中应用，不但对烟草有促生作用，而且对烟草病毒病有抑制作用，还能显著提高烟叶产量。
文档编号A01P3/00GK102154164SQ20101062453
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者李向东, 王晓强, 袁从阳 申请人:山东农业大学