专利名称：防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株jh21及其生防菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株JH21及其生防菌剂，属于农作物防病治病技术领域，专用于水稻主产区对稻瘟病和水稻纹枯病的防治。背景技术：
水稻是我国主要粮食作物之一，目前种植面积约占全国耕地面积的1/4，年产量约为全国粮食总产量的1/2。然而，水稻病害的持续发生一直严重影响着水稻的生产。在现行防治条件下，全国平均每年因各种水稻病害造成稻谷减产达200亿kg，如不进行防治，减产可达 300亿kg。因此，研究和防治水稻病害刻不容缓。在水稻病害中，稻瘟病和纹枯病发生面积大，流行性强，危害严重，防治上难度较大，是水稻生产中最主要的两大病害。水稻稻瘟病又称稻热病、叩头瘟等，是一种世界性真菌病害，对全球水稻生产造成极大危害，被列为水稻三大病害之首，是水稻苗期和抽穗期最重要的病害，在我国所有稻区均有发生，在病害流行年份一般造成减产10% 20%，病害重的年份减产40% 50%，甚至颗粒无收。20世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380 Rhm2以上，年损失稻谷达数亿公斤。在生产上我国目前主要是应用化学农药来防治稻瘟病，一般在苗期时采用化学杀菌剂浸种防治苗瘟，移栽本田后使用叶面喷雾防治叶瘟与穗颈瘟。现阶段生产上主要应用春雷霉素、三环唑或以三环唑与硫磺、三环唑与异稻瘟净复配的复配杀菌剂在苗期和抽穗期喷雾防治稻瘟病。但稻瘟病的发生受品种、气候影响较大，对稻瘟病的发生程度、 发生期的预测预报精度不高，应用化学农药防治稻瘟病，因药剂本身没有内吸性，很难在防治适期用药，且由于病菌对常用药剂抗药性的逐渐增强，使得防效不断下降。另外化学药剂的成倍使用，农田生态系统已遭到严重破坏，收获后加工成的大米农药残留严重，已给人们健康带来不可忽视的严重危胁。由茄丝核菌solani)引起的水稻纹枯病是水稻最难治理的水稻真菌病害之一。随着矮杆品种和杂交稻的推广种植以及栽培管理水平的提高，纹枯病发生日益严重。其中，尤以高产水稻区受害最重。纹枯病主要引起鞘枯和叶枯，使水稻结实率降低，瘪谷率增加，粒重下降，一般减产10-20%，发生严重减产40-50%。且由于纹枯病菌腐生能力强和寄主范围广，国内外至今尚未发现对该病的高抗品种；该病对国内的主要防治药剂——井R霉素已产生明显的抗药性，每季用药次数已从20年前2次增加到现在的4 7次，用药量也从以前的Ukg/ hm2增加到目前的4. 5 6. Okg/ hm2。因防治纹枯病而长期大量使用农药造成自然生态环境污染及稻米农药残留量增加的问题也越来越突出。化学农药对农田生态系统的严重破坏，病原菌对药剂的抗性越来越明显。同时，化学农药不易降解，高残留，对人畜极不安全都严重限制了在将来的农业生产上的使用。因此，非化学性防治措施目前已成为防治水稻病害的核心方式，而生物防治则为其中最有前途的方法。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液专利(公开专利号CN1358838，
公开日
2002年7月17日)方法，菌体可室温保存2 3年。
三、发明内容技术问题
本发明的目的是针对目前农业生产中稻瘟病和水稻纹枯病防治难度大，成本高，化学农药抗性日益突出，农药残留高等问题，筛选高效生防菌株并制得生防菌剂，对水稻稻瘟病和水稻纹枯病均有防效。技术方案
一种防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株JH21为成团泛菌iPantoea agglomerans), 2009年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO. 31沈。生防菌株JH21用于制备生防菌剂的方法为
1)将该菌株接种到PDA培养液中分别培养30°C180rpm, 16 20小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；
2)当培养至OD值在0.5 0. 8之间时，将种子菌液以1 :100体积比加入PDA培养液中，30°C 180rpm振荡培养20 24小时，然后6000rpm离心lOmin，每IOOOml培养液获得 13 16g湿菌，每克湿菌含4 X 101° IO15个菌体，取湿菌与菌体保藏液按1 g :40ml配成菌剂，成品中活菌总浓度为3X109 3X1012CFU/ml，用于防治稻瘟病和水稻纹枯病。所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH 值调至7. 2 7. 4，然后121°C灭菌20分钟。菌体保藏液为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0. 001mol/L的Tween20非离子型表面活性剂。
有益效果
本发明的优点和积极效果表现在本发明是专门针对稻瘟病和水稻纹枯病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而能够有效保护农田生态系统，有利于稻米无公害生产，实施农业的可持续发展。该生防菌剂防效好，价格低于化学农药，可为农民节省开支；该菌剂还具有促生增产功能，生产出的优质无公害稻米，可为农民增加收入。平板拮抗试验表明，JH21制剂对稻瘟病病原菌和水稻纹枯病病原菌有明显的抑制作用。温室试验表明JH21制剂能有效控制稻瘟病菌和水稻纹枯病菌对水稻的侵染，抑制菌丝生长，达到控制病情发生的效果。同时，JH21制剂能促进水稻植株的生长并提高其抗逆性。大田试验结果显示JH21菌剂对对水稻稻瘟病防效为65 70%左右，增产可达40 45% ；对水稻纹枯病防效为60 70%以上，增产可达40 60%。该菌剂用湿菌与本实验室的菌体保藏液(属本实验室已授权专利，专利号 ZL02112559. 7，公开专利号CN1358838，
公开日:2002年7月17日)按1 :40 (g/ml)配成菌剂，可室温保存2 3年。该混合菌剂通过喷雾使用防治病害，也可以通过浸种处理。四
具体实施例方式
一种从水稻根围土中筛选得到的防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株JH21，该菌为泛菌属iPantoea agglomerans)，在LB培养基上他产生单菌落，培养24h后菌落呈黄色，质地均一，圆形至不规则，湿润，中央隆起，表面光滑，菌体细胞为直杆状，G—。
JH21菌剂的制备方法采用常规细菌培养法
1)将该菌株接种到PDA培养液中分别培养30°C180rpm, 16 20小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；
2)当有OD值不在0.1 1之间时将各菌继续培养，每隔3小时测一次，直到各OD值均在此范围内.当培养至OD值在0.5 0.8之间时，将种子菌液以1 :100体积比加入PDA 培养液中，30°C 180rpm振荡培养20 24小时，然后6000rpm离心lOmin，每IOOOml培养液获得13 16g湿菌，每克湿菌含4 X 101° IO15个菌体；
取湿菌与菌体保藏液按1 g :40ml配成JH21生防菌剂，成品中活菌总浓度为3X109 3X 1012CFU/ml。菌体保藏液为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0. 001mol/L的 Tween20非离子型表面活性剂。所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH 值调至7. 2 7. 4，然后121°C灭菌20分钟。(一)平板拮抗抑菌试验
利用平板对峙培养法，测定JH21菌株对水稻纹枯病菌和稻瘟病菌的抑制作用。(二)温室试验 1.种子处理
水稻种子进行表面消毒处理用75%的酒精处理15 s后无菌水水洗三次，5%的次氯酸钠溶液处理15min后无菌水水洗三次。表面消毒的水稻种子浸泡于浓度为108CFU/mlJH21 菌剂30min后，保湿催芽后播种育秧苗。2.病原菌的接种和JH21菌剂的施用
用塑料小桶装水稻田间土壤，每桶移栽3穴，每穴5棵秧苗。水稻植株长至分蘖期时接种病原菌。以水稻纹枯病菌soIani)AG~l ( ΙΑ)为供试病原菌(Inagaki K. Dispersal of rice sheath blight fungus, Rhizoctonia solani AG-I ( ΙΑ) , and subsequent disease development in paddy fields, from survey of vegetative compatibility groups [J] . Mycoscience, 1998 (39) :391 - 397.)，采用牙签接种法(易润华，朱西儒，周而勋.水稻纹枯病菌人工接种方法的研究[J].广州大学学报(自然科学版)，2003，(03))接种将经接菌培养的长2 cm左右木制短牙签嵌入植株的叶鞘内侧，保湿。以稻瘟病菌(Migrmporthe grisea) 91-17-2生理小种为病原菌(穆常青，刘雪， 陆庆光，蒋细良，朱昌雄.枯草芽孢杆菌B-332菌株对稻瘟病的防治效果及定殖作用 [J].植物保护学报，2007，(0 )，苗期接种将病菌诱导产孢后，向叶面喷施孢子悬浮液接种。待清水对照组水稻出现病情时，开始喷施JH21菌剂处理。3.统计结果
统计JH21菌剂对水稻纹枯病和稻瘟病的防效，及其对水稻的促生长作用。(三)田间试验
使用JH21菌剂在08年5月至11月在江苏省铜山县和安徽省庐江县进行田间防治稻瘟病和水稻纹枯病的田间试验，统计了 JH21菌剂的对病害的防治效果和对水稻的促生增产效果。 实验结果
1.平板抑菌试验
按照《植病研究法》中平板对峙培养试验方法，对JH21对稻瘟病菌和水稻纹枯病菌的抑制效果进行评价，待清水对照处理组病菌菌丝长满平板时统计结果如下，JH21对稻瘟病菌生长抑制率为74. 44%，水稻纹枯病菌生长抑制率为47. 78% (表1所示)。
表1. JH21对水稻纹枯病原菌和稻瘟病病原菌抑制作用
ι 病原菌 I处理痛原菌菌落直径(mm)生长抑制率！ 1JH212374,44%I 稻瘟病菌 L [凊水900水稻纹枯病菌.JH21 凊水47 9047,78% 0 2.水稻叶瘟病温室试验
接种稻瘟病菌孢子后，至对照组开始发病时第一次喷施JH21菌剂，此后每隔7-10天喷施一次JH21菌剂。至水稻抽穗期，调查防效和生物量。以20%三环唑WP (江苏丰登农化有限公司)为对照药剂。JH21菌剂在温室试验中对水稻稻瘟病防效达73. 6096，高于三环唑处理组。同时，使用JH21菌剂能够明显促进水稻植株的生长，生物量增长率为40. 83% (表 2所示)。 3.水稻纹枯病温室试验
接种水稻纹枯病菌后，对照组开始发病时第一次喷施JH21菌剂，此后每隔10-15天喷施一次。水稻至乳熟期，调查防效和生物量。以对照药剂为20%纹真清SC (上海农乐生物制品股份有限公司)。JH21菌剂在温室试验中对水稻纹枯病防效达81. 07%,高于农药对照组。同时，JH21菌剂能促进水稻植株的生长，生物量增长率为62. 41% (表3所示)。
权利要求
1.一种防治稻瘟病及水稻纹枯病的生防菌株JH21，为成团泛菌iPmtoea ^^ /offlera/^)，2009年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO. 3126ο
2.用权利要求1所述的生防菌株JH21制备的防治稻瘟病及水稻纹枯病的生防菌剂。
3.制备权利要求2所述生防菌剂的方法，其特征在于1)将权利要求1所述的菌株接种到PDA培养液中30°CISOrpm培养16 20小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)当培养至OD值在0.5 0. 8之间时，将种子菌液以1 :100体积比加入PDA培养液中，30°C 180rpm振荡培养20 24小时，然后6000rpm离心lOmin，每1000ml培养液获得 13 16g湿菌，每克湿菌含4 X IOltl IO15个菌体；3)取湿菌与菌体保藏液按1g:40ml配成菌剂，成品中活菌总浓度为3X109 3Xl(^CFU/ml。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值调至7. 2 7. 4，然后121°C灭菌20分钟；菌体保藏液为0. 01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0. 001mol/L的Tween20 非离子型表面活性剂。
5.权利要求2-4所述生防菌剂JH21产品在防治稻瘟病和水稻纹枯病方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株JH21，属于植物保护技术领域。该菌是成团泛菌(Pantoea agglomerans)，将该菌在PDA培养液30℃180rpm振荡培养20～24小时，然后6000rpm离心10min，取湿菌与本实验室的菌体保藏液按140(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为3×109～3×1012CFU/ml。JH21菌剂对水稻稻瘟病防效为65～75%左右，增产可达40～50%；水稻纹枯病防效为60～70%以上，增产可达40～60%。JH21菌剂能够对水稻纹枯病和稻瘟病混合发生田块进行防治，同时该菌剂能够明显的促进水稻的生长，提高水稻产量。该菌剂可以在播种时通过浸种使用，移栽后通过喷雾使用防治病害。
文档编号A01N63/00GK102191198SQ20111007433
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者周冬梅, 张文芝, 郭坚华, 陈云 申请人:南京农业大学