专利名称：利用烟草瞬时表达系统高效表达禽流感Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白质表达领域。具体的说，本发明涉及利用烟草瞬时表达系统表达禽流感病毒血凝素(HA)基因。
背景技术：
世界范围内对重组蛋白的要求在以很快的速度增长，这种增长速度通过传统的生产蛋白的方法是无法满足的。重组蛋白主要是药用蛋白，包括抗体、疫苗以及エ业上使用的 酶和次级代谢产物。传统生产重组蛋白的系统包括细菌和哺乳动物系统，但是这些系统因本身的复杂性和生产成本较高受到限制，因为传统系统需要复杂的发酵设备和昂贵的下游纯化过程。在植物中表达重组蛋白，一方面可以满足不断增长的蛋白需求；另一方面，植物表达系统有很多其它表达系统没有的优点。植物作为“绿色生物反应器”具有很多独特的优点。首先，植物表达系统具有真核生物蛋白表达后的修饰系统，包括糖基化、ニ硫键的形成，这些对于维持蛋白的生物活性非常重要。其次，“緑色生物反应器”不存在交叉感染的危险，因为到目前为止没有发现跨界的病原体。和传统的细胞培养系统相比，植物生长所需要的条件简单，并且非常经济，它只要光作为主要能量，这进一歩降低了成本。对于药用蛋白来说，后期纯化也比较简単。烟草作为植物界的“白鼠”，被用作为绿色反应器的主要平台。主要原因包括首先，烟草是多叶植物，具有很高的生物量。其次，烟草具有多种转化方式，包括农杆菌介导的瞬时表达、病毒侵染、稳定遗传以及叶绿体工程。再次，烟草即不是食物也不是饲料，不会污染食物链和饲料链。这些特点使烟草非常适合应用于表达外源蛋白。禽流感(Avain Influenza, Al)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的鸟类病毒性传染病，高致病力毒株(Highly Pathogenic Avain Influenza Virus, HPAIV)的流行可导致感染鸡群的死亡率达100%。血凝素是指红血球凝聚素。病毒的表面存在两种蛋白质，ー种称为红血球凝聚素(Hemagglutinin),另ー种为神经氨酸酶(Neuraminidase)。高致病性禽流感病毒H5N1中的“H”指代前者，“ N”指代后者。而就目前而言，红血球凝聚素有16种形态，神经氨酸酶则有9种形态。它们会引发免疫系统作出反应，特别是红血球凝聚素，当身体需要产生预防流感抗体时，身体会主动找寻■这种蛋白质。血凝素(HA)是(Avian Influenza Virus,AIV)的主要保护性抗原，以HA研制的亚单位疫苗可对同一 H亚型不同毒株产生良好的免疫保护性。Re-5疫苗株用于预防H5亚型禽流感病毒引起的鸡、鸭、鹅的禽流感。遗传信息在由mRNA到蛋白质的传递过程中是以三联体密码子的形式传递的。每种氨基酸至少对应一个密码子，最多的有六种对应密码子。编码同一种氨基酸的密码子成为同义密码子。在蛋白质的合成过程中，同义密码子的使用频率并不相同。某一种物种或某一基因通常倾向于使用ー种或几种特定的同义密码子，这些密码子被称为最优密码子，此现象被称为密码子偏好性。本实验室根据目前使用的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因序列，在GenBank中经比对后选定目前所用核酸序列。根据烟草密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的情况下，对选定的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因序列进行优化。委托上海生エ生物有限公司合成并构建到PUC57载体上。本实验从PUC57载体中扩增得到Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，利用烟草瞬时表达系统确定该基因的亚细胞定位，将该基因构建到两个植物表达载体上，并从RNA水平和蛋白水平证明该基因在烟草中得到了瞬时表达。
发明内容
本发明从含有人工合成的目的基因的载体！3UC57中扩增出Re-5疫苗株血凝素(HA)基因。血凝素(HA)是禽流感病毒的主要保护性抗原，对生产抗原性疫苗具有重要意义。本发明所述的禽流感Re-5疫苗株血凝素基因，经过密码子优化，它的序列如SEQ ID No. I 所示。—种含Re-5疫苗株血凝素HA基因的表达载体，本发明还构建了植物双元载体HA-pK7FWG2. 0，用于确定所述的Re_5疫苗株血凝素(HA)基因的亚细胞定位，实验结果显示该基因定位在细胞间隙，这对于后来蛋白提取方法的确定非常重要。PK7FWG2. 0植物双元载体是Gateway系统的载体，载体构建过程不需要考虑酶切位点，方便快捷。本发明构建了 HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0 (Delate Bar)三个植物表达载体，并在RNA水平和蛋白水平证明了三个构建都能表达Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，并且植物表达载体Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)的蛋白表达量最高。所述的表达载体Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)是将 Kozak 序列和6XHis标签以及所述的Re-5疫苗株血凝素HA基因克隆到去掉抗除草剂筛选标记Bar后的载体PB2GW7. 0中而得到。本发明还公开了利用烟草瞬时表达系统高效表达Re-5疫苗株血凝素HA基因的方法，是构建含有所述Re-5疫苗株血凝素HA基因的表达载体，再将表达载体注射到烟草中表达Re-5疫苗株血凝素。所述的表达载体是HA-6 X Hi S-PB2GW7. 0、Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0 和/或Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0(Delate Bar)。本发明评估了烟草注射Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0(Delate Bar)表达载体的农杆菌后，Re-5疫苗株血凝素(HA)基因在不同时期的表达量，实验结果显示，在第六天Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表达量最高。本发明证明Re-5疫苗株血凝素(HA)基因能够在烟草系统中瞬时表达。实现本发明的技术如下根据烟草密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的情况下，对选定的Re-5疫苗株的血凝素(HA)基因序列进行优化。根据优化的序列设计做血凝素(HA)基因定位的引物(5’加CACC是使用gateway系统时必须加的，3’去掉终止密码子)，以上海生エ生物有限公司提供的含有人工合成的目的基因的PUC57载体为模板，扩增去掉终止子的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，跑胶鉴定正确后回收。利用invitrogen公司的pENTR Directional TOPO Cloning Kits试剂盒将回收的血凝素(HA)基因连到Gateway系统中的pENTR载体鉴定正确后通过invitrogen公司的Gateway LR Clonase II Enzyme Mix试剂盒，将血凝素基因从入门载体pENTR置换到Gateway系统中的表达载体pK7FWG2.0，该载体带有绿色荧光蛋白GFP，可用于确定目的基因的亚细胞定位。将鉴定正确的大肠杆菌质粒转化农杆菌，鉴定正确后，用无针头的注射器注射烟草，6天后用共聚焦显微镜观察，并确定Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的亚细胞定位。根据优化的序列设计Re-5疫苗株血凝素(HA)基因表达的引物(在5’端加CACC，3’端加上6 XHis标签)，以上海生エ生物有限公司提供的含有目的基因的人工合成的PUC57载体为模板，扩增出带6XHis标签的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因。另外，根据Kozak提出的真核生物偏好的转移起始密码子周边序列，许多研究报道表明，起始密码子 的周边序列做相应修改，可提高外源基因的表达量。我们设计另外ー对引物将kozak序列(TAAACCATGGCT)加到序列起始密码子的前面(5’加CACCTAAACCATGGCT, 3 ’端加卜.6 X His标签)。同样以上海生エ生物有限公司提供的含有目的基因的人工合成的PUC57载体为模板，扩增出带6XHis标签及kozak序列的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因。将扩增结果跑胶，鉴定正确后回收，利用 invitrogen 公司的 pENTR Directional TOPO Cloning Kits 试剂盒将回收的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因连到Gateway系统中的入门载体pENTR，鉴定正确后通过invitrogen公司的Gateway LR Clonase II Enzyme Mix试剂盒，将只带6XHis标签的血凝素(HA)基因从入门载体置换到Gateway系统中的表达载体pB2GW7. 0上，将带6 XHis标签和Kozak的Re_5疫苗株血凝素(HA)基因从入门载体置换到Gateway系统中的表达载体PB2GW 7. 0和本实验室改造成功的pB2GW 7. 0 (Delate Bar)载体上做Re_5疫苗株血凝素(HA)基因的过表达。将鉴定正确的大肠杆菌质粒转化农杆菌，鉴定正确后，用无针头的注射器注射烟草，第6天收获。分别用含有HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)构建的农杆菌注射烟草,第六天收获后,一方面，提RNA检测Re-5疫苗株血凝素(HA)基因在RNA水平的表达情況；另ー方面，提蛋白，用Western blot检测Re_5疫苗株血凝素(HA)基因在蛋白水平的表达情況。本发明的优点I.本发明选用植物界的“小白鼠”-烟草，作为表达宿主，能够快速瞬时表达目的基因，成本低，效率高。2.本发明根据烟草密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的情况下，对选定的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因序列进行优化，以便使Re-5疫苗株血凝素(HA)基因能在烟草中高效表达。3.本发明确定了的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的亚细胞定位，对于后续蛋白的提取具有指导意义。4.本发明证实本实验室所构建的三个含Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表达载体都能表达血凝素基因，并确定了表达量最闻的载体。5.本发明还进ー步确定了表达量最高的载体在注射后第几天Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表达量达到最高。
图I :Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的亚细胞定位A :明场；B :叶绿体的自发荧光；C :绿色荧光代表禽流感血凝素(HA)基因的表达。D :A、B以及C的叠合。图2 :实验中用到的两个过表达载体:A:植物表达载pB2GW7.0;B :去掉除草剂筛选标记的植物表达载体PB2GW7.0，即是pB2GW7.0 (Delate Bar)图3 :含Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的三个表达载体的示意图及它们表达水平比较的情况A :HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHi s_pB2GW7. O、Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0 (Delate Bar)三个表达载体的示意图，其中 2:HA-6XHis-PB2GW7. 0 表达载体的示意图；3 Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 表达载体的不意图；4 Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表达载体的不意图；B :HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (DelateBar)三个表达载体表达水平的比较1 :注射P19的烟草；2 :注射HA_6XHis-pB2GW7. 0表达载体的烟草；3 :注射Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0表达载体的烟草；4 :注射Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. OCDelate Bar)表达载体的烟草。其中I :RNA水平的表达情况；
2:烟草管家基因的表达情况；3 :蛋白水平的表达情况。图4 :注射 Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表达载体的烟草在不同时期表达Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的情况A :血凝素(HA)基因在RNA水平的表达情况:烟草管家基因的表达情况；C :血凝素(HA)基因在蛋白水平的表达情況。I :是注射P19的烟草；2 :注射Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表达载体两天后的烟草；3 :注射Kozak-HA-6 XHi s_pB2GW7. 0 (Delate Bar)表达载体四天后的烟草；4:注射Kozak-HA-6 XHi s_pB2GW7. 0 (Delate Bar)表达载体六天后的烟草；5 :注射Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表达载体八天后的烟草。
具体实施例方式PUC57载体购自上海生エ生物有限公司。pK7FWG2. 0 和 pB2GW7. 0 质粒购自 Plant System Biology (构建见 Karimi, M.，Inze, D. and Depicker, A. (2002)GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated planttransformation, Trends in Plant Science ；7 (5) 193-5.)农杆菌GV3101购自北京拜尔迪公司P19 构建见 Olivier Voinnet et al. An enhanced transient expressionsystem in plants based on suppression of gene silencing by the pl9 protein oitomato bushy stunt virus. The Plant Journal(2003)33,949-956.。实施例一 Re_5疫苗株血凝素(HA)基因的密码子优化由于Re-5疫苗株血凝素(HA)基因是动物病毒基因，考虑到密码子的偏好性，为使该基因能在烟草中高效表达，本实验首先在不改变其氨基酸序列的情况下，对该基因序列的密码子进行优化。优化后的序列如SEQ ID No. I所示。该项工作由上海生エ生物有限公司完成并进行全基因合成。实施例ニ Re_5疫苗株血凝素(HA)基因定位载体HA-PK7FWG2. 0的构建 根据烟草密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的情况下，对选定的Re-5疫苗株的血凝素(HA)基因序列进行优化。根据优化的序列设计做血凝素(HA)基因定位的正向引物为 HA (SL) F 5f -CACCATGGAAAAAATCGTTC-3 ' (SEQ ID No. 2)，反向引物为 HA (SL) R 5’-GATACAAATTCTGCACTGGAGA-3’ (SEQ ID No. 3)，引物由上海生エ生物有限公司合成。以上海生エ生物有限公司提供的含有人工合成的目的基因的PUC57载体为模板，PCR体系含0. 3 u L 的质粒模板，4 u L 的 dNTP (终浓度为 2. 5mmol/L), 5 y L 白勺 IOXpyrobest Buffer,HA(SL)F,HA(SL)R各4 ii L，0. 25 ii L的pyrobest-Taq酶，用超纯水补足总体积50 Uし反应程序为 94°C预变性 5min ;94°C变性 50sec，57°C退火 50sec，72°C延伸 2minl0sec ；36 个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，直接与invitrogen公司的pENTR Directional TOPO⑧连接，具体反应体系(3 u L)如下PCR 产物0. 5 ii LSalt Solution0. 5 U LTopo Vector0. 5 U L ddH20I. 5u L22°C连接I小时，热激法转化感受态细胞E coli DH5 a，经两次PCR确定阳性重组入门质粒。两次PCR的引物为M13通用引物(M13F、M13R)以及M13上游引物Ml 3F 和基因下游引物 HA(SL)R ;M13F :5’ -GTAAAACGACGGCCAG-3 ’ (SEQ ID No. 4)、M13R :5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID No. 5);将鉴定正确的重组入门质粒与Gateway系统中的表达载体PK7FWG2. 0质粒混和，具体反应体系(5 u L)如下鉴定正确的含目的基因的入门载体 IuL表达载体PK7FWG2. 0IuLddH202 u LMIX 酶I ii L25 °C反应3小时，热激法转化感受态细胞E coli DH5 a，经两次PCR确定阳性重组质粒；两次PCR的引物为载体PK7FWG2. 0上35S的上游引物F :5’-CTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’ (SEQ ID No. 6)和基因下游引物 HA(SL) R ;以及基因上、下游引物HA (SL) F和HA (SL) R。将确定正确的质粒用冷冻法转化农杆菌，经两次PCR鉴定(载体PK7FWG2. 0上35S的上游引物和基因下游引物以及基因下上、下游引物)正确后存菌，即得到基因定位载体HA-PK7FWG2. O。实施例三Re_5疫苗株血凝素(HA)基因表达载体的构建(I)载体 pB2GW7. 0 (Delate Bar)的构建以Gateway系统中载体pB2GW7. 0为基础，去掉其除草剂筛选标记Bar基因，即完成了载体PB2GW7. 0 (Delate Bar)的构建，具体方法如下对载体pB2GW7. 0的序列进行分析，设计一对引物Pl :5' -ACATTGGGAACCGGTCACA-3' (AgeI) (SEQ ID No. 7) ;P2 :5' GAGCTCTCAATTCGGCGTTAATTCAG-3' (SacI) (SEQ ID No. 8)(如图 2，A 中所示)，Pl 从载体pB2GW7. 0上6690bp开始设计，其中包含了在载体pB2GW7. 0中只出现一次的酶切位点AgeI ；P2从载体PB2GW7. 0中LB的最后ー个碱基(即载体pB2GW7. 0 9722bp)开始设计，并在LB的最后ー个碱基的后面加了载体PB2GW7. 0上抗除草剂筛选标记Bar基因之后的SacI酶切位点(该酶切位点在载体PB2GW7. 0中只出现一次)。以载体pB2GW7. 0为模板，以PI、P2为引物，PCR体系含0. 5 y L的质粒模板，4 y L的 dNTP (终浓度为 2. 5mmol/L) ,5u L 的 10XLA Taq Buffer, PI、P2 各 4 y L，0. 5 y L 的 LATaq酶，用超纯水补足总体积50iiし反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性50sec，56°C退火50sec，72°C延伸3min20sec ;36个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，利用北京全式金生物技术有限公司的PEASY-Tl CloningKit试剂盒，将目的片段连到T载体上，反应体系为PCR产物3 ill (根据PCR产物量可适当增减，最多不超过4iil)，pEASY-Tl Cloning Vector I yl轻轻混合，25°C反应15分钟。反应结束后，将离心管置于冰上，热激法转化感受态细胞E coli DH5a。经PCR和酶切(SacI和AgeI)鉴定正确后，由上海生エ生物有限公司完成测序工作，测序无误后，用SacI和AgeI双酶切载体PB2GW7. O和以载体pB2GW7. O为模板，以PI、P2为引物扩增的产物。20 酶切体系为2 ill SacI Buffer, 0. 4 U I SacI, I. 6 ii IAgeI, 5 ii I质粒,用超纯水补足总体积20u I0 37°C 4小时，跑胶回收，用大连宝生物工程有限公司的T4连接酶连接。连接体系
2ill T4Buffer, 2 ill T4酶，回收产物各8 yl。连接过夜，热激发转化感受态细胞E coliDH5a。酶切鉴定正确后，即完成了载体pB2GW7. 0(Delate Bar)(如图2，B中所示)的构建。
(2) Re-5疫苗株血凝素(HA)基因表达载体的构建表达载体HA-6XHis-pB2GW7. 0的构建根据优化的序列设计含6XHis标签的血凝素(HA)基因的引物HA-6XHis F 5 CACCATGGAAAAAATCGTTCTTCTTCT 3’ (SEQ IDNo. 9)、HA-6XHis R :5’ TTAATGATGATGATGATGATGGATACAAATTCTGCACTG 3’ (6XHis) (SEQID No. 10)引物由上海生エ生物有限公司合成。以上海生エ生物有限公司提供的含有人工合成的目的基因的PUC57载体为模板，PCR体系含0. 3 ii L的质粒模板，4 y L的dNTP (终浓度为 2. 5mmol/L)，5ii L 的 IOXpyrobest Buffer, HA-6XHis F, HA-6XHis R各 4yL，
0.25 ii L的pyrobest-Taq酶,用超纯水补足总体积50 Uし反应程序为94°C预变性5min ；94°C变性 50sec，58°C退火 50sec，72°C延伸 2minl0sec ；36 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，直接与invitrogen公司的pENTR Directional T0P0 连接,具体反应体系(3 u L)如下PCR 产物0. 5 ii LSalt Solution0. 5 U LTopo Vector0. 5 U LddH20I. 5u L22°C连接I小时，热激法转化感受态细胞E coli DH5 a，经两次PCR确定阳性重组入门质粒。两次PCR的引物为M13通用引物(M13F、M13R)以及M13上游引物M13F和基因下游引物HA_6XHis R ;将鉴定正确的重组入门质粒与Gateway系统中的表达载体pB2GW7. 0质粒混和,具体反应体系(5iiL)如下鉴定正确的含目的基因的入门载体 IuL表达载体pB2GW7. 0IuLddH202 u LMIX 酶I ii L25°C反应3小时，热激法转化感受态细胞E coli DH5 a，经两次PCR确定阳性重组质粒；两次PCR的引物为载体pB2GW7. 0上35S的上游引物F :载体pB2GW7. 0上35S的上游引物 F :5，CTTCGCAAGACCCTTCCTC 3，(SEQ ID No. 11)和基因下游引物 HA_6XHis R;以及基因上、下游引物HA-6XHis F和HA-6XHis R0将确定正确的质粒用冷冻法转化农杆菌，经两次PCR鉴定(载体PB2GW7.035S上的上游引物和基因下游引物以及基因下上、下游引物)正确后存菌，即得到表达载体HA-6XHis-pB2GW7. O。表达载体Kozak-HA-6XHis-PB2GW7. 0 和 Kozak-HA-6 XHis-pBMWL 0 (DelateBar)的构建根据优化的序列设计含Kozak序列和6XHis标签的血凝素(HA)基因的引物Kozak-HA-6XHis F :5’ CACCTAAACCATGGCTATGGAAAAAATC(Kozak)3’ (SEQ ID No. 12)，Kozak-HA-6 XHis R :5，TTAATGATGATGATGATGATGGATACAAATTC (6 XHis) 3，(SEQ IDNo. 13)，引物由上海生エ生物有限公司合成。以上海生エ生物有限公司提供的含有人工合成的目的基因的PUC57载体为模板，PCR体系含0. 3 ii L的质粒模板，4 y L的dNTP (终浓度为 2. 5mmol/L), 5 u L 的 IOXpyrobest Buffer, Kozak-HA-6 XHis F\> Kozak-HA-6 XHis R 各L，0. 25ii L的pyrobest-Taq酶，用超纯水补足总体积50 yし反应程序为94°C预变性 5min ;94°C变性 50sec, 57°C退火 50sec, 72°C延伸 2minl0sec ；36 个循环；最后 72°C延伸IOmin0 PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳,切胶回收目的片段,直接与invitrogen公司的pENTR Directional T0P0⑧连接，具体反应体系(3 u L)如下PCR 产物0. 5 ii LSalt Solution 0. 5 U LTopo Vector0. 5 U LddH20I. 5u L22°C连接I小时，热激法转化感受态细胞E coli DH5 a，经两次PCR确定阳性重组入门质粒。两次PCR的引物为M13通用引物(M13F、M13R)以及M13上游引物M13F和基因下游引物Kozak-HA-6XHis R ;将鉴定正确的重组入门质粒与Gateway系统中的表达载体pB2GW7. 0和pB2GW7. 0 (Delate Bar)质粒混和，具体反应体系(5 u L)如下鉴定正确的含目的基因的入门载体IuL表达载体pB2GW7. 0/pB2GW7. 0 (Delate Bar) I U LddH202u LMIX 酶I ii L25°C反应3小时，热激法转化感受态细胞E coli DH5 a，经两次PCR确定阳性重组质粒；两次PCR的引物为载体pB2GW7. 0上35S的上游引物F和基因下游引物Kozak-HA-6 X Hi SR ；以及基因上、下游引物 Kozak-HA_6XHisF 和 Kozak-HA_6XHisR。将确定正确的质粒用冷冻法转化农杆菌，经两次PCR鉴定(载体pB2GW7. 035S上的上游引物和基因下游引物以及基因下上、下游引物)正确后存菌，即得到表达载体Kozak-HA-6XHiS-PB2GW7. 0 和 Kozak-HA-6XHis_pB2GW7. 0(Delate Bar)。实施例四烟草的种植和Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的瞬时表达(I)烟草的种植烟草种植在本实验室的培养箱内，10小时光照，14小时黑暗，湿度是70%左右。烟草种子不需任何处理直接种植在小的育苗盒中，两星期以后，每ー个小的育苗盒移ー棵烟草幼苗，移苗后2-3星期，大概5-6片真叶，即可用于注射。(2) Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的瞬时表达Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的瞬时表达通过将相应构建的农杆菌注射烟草来实现。具体方法如下将鉴定正确的含表达载体的农杆菌按体积比1%的接种量接种到含有相应抗生素的培养基中，摇16小时，然后按体积比1/10的接种量再摇6个小时。4000rpm，IOmin离心收集菌体,用提前配好的Mgcl2悬浮液(0. 406g Mgcl2 7H20溶于200ml水)悬浮，再4000rpm, IOmin,再用Mgcl2悬浮液悬浮，将OD600调至0. 8即可。将含有P19 (沉默抑制因子，作用是增加目的蛋白的表达量)的悬浮液和含目的基因的悬浮液等体积混合，注射烟草。实施例五Re-5疫苗株血凝素(HA)基因亚细胞定位的观察取注射载体HA-pK7FWG2. 0+P19五天后的烟草叶片，用镊子从所取叶片上撕一小片下来，放在载玻片上(下表皮紧贴载玻片)，加一滴30%甘油，盖上盖玻片，吸取多余的30%的甘油。然后将制好的标本倒放在共聚焦显微镜上观察，结果如图I所示，Re-5疫苗 株血凝素(HA)基因定位在细胞间隙。实施例六Re-5疫苗株血凝素(HA)基因在HA_6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. 0、Kozak-HA_6 XHis_pB2GW7. 0 (Delate Bar)三个表达载体中表达情况的比较(I) RNA水平的比较烟草分别注射HA-6XHis-pB2GW7. 0+P19、Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0+P19、Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar) +P19后，第六天收获烟草叶片，提总RNA，反转录成 cDNA。以该 cDNA 为模板，以 HARTF(5，TATTCCGAAATCTTCTTGGTCT 3’，SEQ ID No. 14)、HA RT R(5’ ITGAITGCGTCATTAGGCTT3’，SEQ ID No. 15)为引物，进行 RT-PCR。同样的cDNA 作为模板，使用 Actin F(5' ATGACGGCAGATACTGGACC 3'，SEQ ID No. 16)和 ActinR(5/ CAGGCTTGTAGGCAATGAAA 3'，SEQ ID No. 17)作为引物,扩增 Actin 作为内參。(2)蛋白水平的比较蛋白水平的检测，通过杂交6XHis标签来实现，具体方法如下蛋白提取缓冲液是4M尿素和IOOmMDTT,将适量叶片用液氮磨成粉末，在预冷的EP管中加入300 U I提取缓冲液及0. Ig的粉末，在蜗旋仪上充分蜗旋，然后加入蛋白上样Loading，放入沸水中煮5min,然后8000rpm离心30min,取20 y I上清点入提前做好10%的聚丙烯酰胺凝胶中，70伏电压，40min，然后90伏，大概3小吋。胶跑完后，ー块染色，另ー块胶转膜。转膜条件是200毫安，35min。转膜结束后，用5%的奶粉封闭3个小时，然后封ー抗(I 1000)，4°C过夜。PBS洗膜5次，每次5min。封ニ抗，室温3个小时。PBS洗膜5次，每次5min。用ECL显色，试剂盒中两种液体等体积混合，然后加到转膜时靠近胶的膜的那一面，压X光片5-30min。具体结果如图3所示，三个含Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的载体表达该基因的情况在RNA水平上没有显著的差别，但在蛋白水平上，注射载体Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0 (DelateBar)的烟草，Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表达量最高。实施例七注射Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表达载体的烟草不同时期表达Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的情况按照实施例六的方法检测注射Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表达载体的烟草在不同时期表达Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的情況。具体结果如图4所示，无论是在RNA水平还是蛋白水平，烟草在注射Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)载体的农杆菌后的第六天，Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表达量都是最高的。
权利要求
1.Re-5疫苗株血凝素HA基因，其特征在干，该基因经过密码子优化，它的序列如SEQID No. I 所示。
2.ー种含Re-5疫苗株血凝素HA基因的表达载体，是Kozak-HA-6XHis- pB2GW7. O(Delate Bar)其特征在于是将Kozak序列和6XHis标签以及权利要求I所述的Re_5疫苗株血凝素HA基因克隆到去掉抗除草剂筛选标记Bar后的载体pB2GW7. 0中而得到。
3.ー种利用烟草瞬时表达系统高效表达Re-5疫苗株血凝素HA基因的方法，其特征在于构建含有权利要求I所述Re-5疫苗株血凝素HA基因的表达载体，再将表达载体注射到烟草中表达Re-5疫苗株血凝素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的表达载体是胡-6XHis-pB2GW7.O、Kozak-胡-6XHis-pB2GW7. 0 或 Kozak-胡-6XHis_pB2GW7. 0 (Delate Bar)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的表达载体是Kozak-胡-6XHis-pB2GW7. OCDelate Bar)，注射 Kozak-胡-6XHis_pB2GW7. OCDelate Bar)到烟草中表达Re-5疫苗株血凝素，转化第六天后Re-5疫苗株血凝素的含量最高。
全文摘要
本发明属于基因工程和蛋白质表达领域，涉及一种利用烟草瞬时表达系统表达禽流感病毒血凝素(HA)基因。所述的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，序列如SEQIDNO.1所示。通过基因工程方法，该基因在烟草叶片中表达。发现HA主要在烟草的细胞间隙表达，三个含目的基因的构建都能表达Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，Kozak-HA-6×His-pB2GW7.0(DelateBar)表达载体Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表达量最高。本发明还发现烟草注射Kozak-HA-6×His-pB2GW7.0(DelateBar)表达载体后，Re-5疫苗株血凝素(HA)基因在第六天表达量最高。
文档编号A01H5/00GK102643837SQ20121007599
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者侯继波, 唐应华, 张志燕, 王政, 王秋叶, 谭小力, 郑香峰, 陈克平 申请人:江苏大学