专利名称：一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域，特别涉及基因工程领域。
目前常规生产基因工程药用蛋白或其它有益蛋白的方法主要是通过细菌发酵，即把外源基因组装到细菌基因上，然后培养细菌、收集菌体或外分泌物提取有益蛋白成分，这一方法有以下局限1)、细菌为原核生物，一些对人体有益的蛋白质，其基因往往来源于高等动植物，这些基因在细菌中的表达往往具有低等生物的特征，如酰胺化，有的根本不能表达。
2)、细菌中本身蛋白质种类繁多，其中大部分是不能被人体吸收利用或是有害的成分。
国外近十年来开始用植物病毒的基因组作为载体表达外源基因，这一方法是把外源基因组装到植物病毒的基因组上，利用植物病毒的高拷贝快速复制来实现外源基因的高效表达。但此途径因为破坏了植物病毒复制体系的完整性而只能实现瞬时高表达，即接种植物不能持续、系统地表达基因工程蛋白质。
本发明的目的在于提供一种以植物为生物反应器，持续、高效地表达基因工程蛋白质的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法，其特征在于它以黄瓜花叶病毒(CMV，下同)的卫星RNA作为表达载体，通过构建含外源基因的重组卫星RNA，然后将含外源基因的重组卫星RNA与CMV共同接种植物并表达外源基因，或共同接种植物细胞培养物，并在组织培养条件下表达外源基因；所述含外源基因的重组卫星RNA是指含有一种外源基因的卫星RNA序列，其外源基因的长度为30bp～1800bp，或含有以串联方式连接的两种或两种以上外源基因的卫星RNA序列，其外源基因的总长度为60bp～1800bp。
CMV是一种单链的RNA病毒，可接种侵染1000多种植物，如十字花科和茄科蔬菜以及多种药用植物。CMV卫星RNA是CMV基因组以外的一种遗传因子，其本身不参与与CMV复制有关的功能而是在CMV的带动下复制，其在寄主植物细胞中的拷贝数往往可达CMV基因组的数十倍或上百倍。基于以上特点，改变卫星RNA的结构不会破坏CMV复制体系的完整性因而CMV的卫星RNA可以作为一种持续、高效表达基因工程蛋白质的载体。本发明适用面广，通过在卫星RNA上装载不同的目的基因并接种侵染不同植物，满足生产不同的基因工程蛋白质的要求，如具治疗、保健、食用作用的蛋白质，且基因工程蛋白质的表达量大大高于已有表达系统。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
本发明以黄瓜花叶病毒(CMV，下同)的卫星RNA作为表达载体，通过构建含外源基因的重组卫星RNA，然后将含外源基因的重组卫星RNA与CMV共同接种植物并表达外源基因，或共同接种植物细胞培养物，并在组织培养条件下表达外源基因；所述含外源基因的重组卫星RNA是指含有一种外源基因的卫星RNA序列，其外源基因的长度为30bp～1800bp，或含有以串联方式连接的两种或两种以上外源基因的卫星RNA序列，其外源基因的总长度为60bp～1800bp。
本发明所述的转录载体是指用常用方法构建的细菌质粒其原理是在常用质粒上，如PUC18、PUC19等，组装CaMV(花椰菜花叶病毒)的35S启动子和终止子序列，使得35S启动子和终止子之间具有装载外源DNA片段的酶切位点。这类载体如PCASS1、PCASS2、PD-35ST及其构建方法为本领域内常见(参考文献如SHIBu-Jun等1997 J.Gen.Virology1181-1185)。
本发明所述的逆转录、PCR、体外转录、用DNA合成仪人工全合成DNA的方法均为分子生物学中的常用方法，其参考文献如下1、逆转录、PCR方法Avila-Rincon MJ，Collmer CW & JM Kaper 1986，Virology 152446-434.
钱世钧、于颖、田开荣等1994，生物工程学报104734-382、PCR方法Rosenberg SM 1987，Meth.Enzymol3、cDNA合成方法Sambrook J，Fritsch E F & Maniatis T 1989，Molecular cloningAlaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory.
4、体外转录方法Boyer J C and Haenni A L 1994，Virology 415-4265、转录载体构建Ding S W，Rathjen J P，Li W X等于1995，J G Virology 76459-464基因参考文献1.α-胸腺素基因Eschenfeldt W H，Manrow R E & Krug M S等，1989，J Biol Chem.264(13)7546-7555。
2.PF4基因(血小板因子IV)Poncz M，S Surrey，& P LaRocco等，1987，Blood 69219-223。
3.氯霉素乙酰转移酶Sakai R K，Gelfand，D H Stoffel等，1988，Science 2301350-1354。
4.荧光素酶deWet J R 1987，Mol.Cell Biol.7725。
5.胰岛素原类似物Wetzel R等1981，Gene 1663-71。
实施例1分离CMV中的卫星RNA，以卫星RNA为模板通过逆转录和PCR方法克隆卫星RNA的全长cDNA，在cDNA的96-183位碱基之间插入α-胸腺素基因(87bp，29个氨基酸)，获得全长367bp的重组卫星DNA，其两端包含Stul和EcoRl两个酶切位点再将重组卫星DNA组装到PCASS2质粒的35S启动子的下游从而获得含重组卫星DNA的PCASS2质粒，将含重组卫星DNA的PCASS2质粒和不含卫星RNA的CMV共同接种烟草，在CMV的存在下转录获得具有含α-胸腺素基因的重组卫星RNA，用具有含α-胸腺素基因的重组卫星RNA的CMV扩大接种感染烟草，根据植株症状表现判断，阳性株率95％以上，7～20天后收集烟草叶片，提取、纯化α-胸腺素，α-胸腺素的产率为5～23mg/100g新鲜烟叶。
实施例2以卫星RNA为模板通过逆转录和PCR方法克隆卫星RNA的全长cDNA，在cDNA的96-183位碱基之间以替换方式插入串联的α-胸腺素基因和PF4基因(血小板因子IV，219bp，71个氨基酸)，获得全长为536bp的重组卫星DNA，再将重组卫星DNA组装到PCASS2质粒的35S启动子的下游从而获得含重组卫星DNA的PCASS2质粒，含重组卫星DNA的PCASS2质粒和CMV共同接种烟草，在CMV的存在下转录获得具有含α-胸腺素基因和PF4基因的重组卫星RNA，用具有含α-胸腺素基因和PF4基因的重组卫星RNA的CMV扩大接种烟草，根据植株症状表现判断，阳性株率95％以上7～20天后收集烟草叶片，提取、纯化α-胸腺素和血小板因子IV，目的蛋白质的总产率为2～10mg/100g新鲜烟叶。
实施例3根据CMV卫星RNA的两端序列和PF4基因的两端序列设计并用DNA合成仪合成PCR引物PCR引物中包括酶切位点、卫星RNA的cDNA的两端序列和PF4基因的两端序列，用PCR方法进行PCR扩增并将PCR产物组装到PCASS2转录载体的35S启动子和35S终止子之间，构成含重组卫星DNA的PCASS2质粒，再与不含卫星RNA的CMV共同接种烟草，在CMV的存在下转录获得具有含PF4基因的重组卫星RNA，用具有含PF4基因的重组卫星RNA的CMV通过磨擦接种番茄幼苗，10～20天后用CMV、PF4双抗检测接种番茄株，阳性株率60～85％。
实施例4根据CMV中的卫星RNA的cDNA的5’端96个碱基、α-胸腺素基因的序列和3’端184个碱基的序列，用DNA合成仪人工全合成一个367个碱基的DNA序列并在其两端分别加上Stul和EcoRl两个酶切位点的序列，从而获得重组卫星DNA；再将重组卫星DNA组装到PCASS2质粒的35S启动子的下游从而获得含重组卫星DNA的PCASS2质粒，含重组卫星DNA的PCASS2质粒和CMV共同接种烟草，在CMV的存在下转录获得具有含α-胸腺素基因的重组卫星RNA，用具有含α-胸腺素基因的重组卫星RNA的CMV通过磨擦接种接种感染烟草，根据植株症状表现判断，阳性株率95％以上，7～20天后收集烟草叶片，提取、纯化α-胸腺素，α-胸腺素的产率为5～23mg/100g新鲜烟叶。
实施例5根据CMV中的卫星RNA的cDNA的5’端96个碱基、α-胸腺素基因的序列和3’端184个碱基的序列，用DNA合成仪人工全合成一个367个碱基DNA序列并组装到RNA体外转录试剂盒中外源DNA载体的T7启动子的下游，通过用体外转录试剂盒转录，获得重组卫星RNA，再与CMV共同接种无病毒半夏幼苗，获得被具有含α-胸腺素基因的重组卫星RNA的CMV侵染的半夏，用组织培养方法大量无性繁殖半夏植株，α-胸腺素基因在半夏植株中的表达量为0.01～0.29mg/100g鲜半夏。
实施例6用实施例3的方法获得PCR产物并组装到RNA体外转录试剂盒中外源DNA载体的T7启动子的下游，通过用体外转录试剂盒转录获得具有含PF4基因的重组卫星RNA，再与CMV共同接种大白菜的原生质体，获得被具有含PF4基因的重组卫星RNA的CMV侵染的愈伤组织，检测愈伤组织中CMV外壳蛋白和PF4，阳性率25～40％，以带有以上两种蛋白质的组织继续扩大培养，在细胞培养水平上获得PF4因子的高效表达。
实施例7利用实施例1的方法获得含氯霉素乙酰转移酶基因(656bp)的重组卫星DNA，并组装到RNA体外转录试剂盒中外源DNA载体的SP6启动子的下游，通过用体外转录试剂盒转录获得含氯霉素乙酰转移酶基因的重组卫星RNA，后者与CMV共同接种烟草幼苗，获得具有含氯霉素乙酰转移酶基因的重组卫星RNA的CMV侵染的烟草，用显症烟草的叶汁液再接种3～7叶期的烟草幼苗，2-4天后在所有接种植株上均检测到氯霉素乙酰转移酶活性。
实施例8以卫星RNA为模板通过逆转录和PCR方法克隆卫星RNA的全长cDNA，在cDNA的96-183位碱基之间用替换方式插入荧光素酶基因(1649bp)获得全长为1912bp的重组卫星DNA，再将重组卫星DNA组装到PCASS2质粒的35S启动子的下游从而获得含重组卫星DNA的PCASS2质粒，以含重组卫星DNA的PCASS2质粒和不含卫星RNA的CMV共同接种烟草，在CMV的存在下转录获得具有含荧光素酶基因的重组卫星RNA，用具有含荧光素酶基因的重组卫星RNA的CMV扩大接种感染烟草，根据植株中荧光素活性判断，阳性株率55％以上。
实施例9根据CMV中的卫星RNA的cDNA的5’端116个碱基、胰岛素原类似物基因(其DNA长度为30bp、氨基酸序列为Arg-Arg-Gly-Ser-Arg-Lys)的序列和3’端218个碱基的序列，用DNA合成仪人工全合成一个364个碱基的重组卫星DNA；并组装到RNA体外转录试剂盒中外源DNA载体的SP6启动子的下游，通过用体外转录试剂盒转录获得含胰岛素原类似物基因的重组卫星RNA，后者与不含卫星RNA的CMV共同接种无病毒马铃薯幼苗，并在80％以上的马铃薯薯块中检测到胰岛素原类似物。
权利要求
1.一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法，其特征在于它以黄瓜花叶病毒(CMV，下同)的卫星RNA作为表达载体，通过构建含外源基因的重组卫星RNA，然后将含外源基因的重组卫星RNA与CMV共同接种植物并表达外源基因，或共同接种植物细胞培养物，并在组织培养条件下表达外源基因；所述含外源基因的重组卫星RNA是指含有一种外源基因的卫星RNA序列，其外源基因的长度为30bp～1800bp，或含有以串联方式连接的两种或两种以上外源基因的卫星RNA序列，其外源基因的总长度为60bp～1800bp。
2.如权利要求1所述的一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法，其特征在于所述的含外源基因的重组卫星RNA的构建。是指以卫星RNA为模板通过逆转录和PCR获得其cDNA，在cDNA上以替换或插入的方式组装外源基因，获得重组卫星DNA，并将重组卫星DNA组装到转录载体上然后在CMV的存在下转录，或将重组卫星DNA进行体外转录，获得具有含外源基因的重组卫星RNA。
3.如权利要求1所述的一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法，其特征在于所述的含外源基因的重组卫星RNA的构建是指通过根据卫星RNA的序列，用DNA合成仪人工合成包含卫星RNA两端序列的PCR引物，然后用PCR方法克隆外源基因获得重组卫星DNA，并将其组装到转录载体上然后在CMV的存在下转录，或将重组卫星DNA进行体外转录，获得具有含外源基因的重组卫星RNA。
4.如权利要求1所述的一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法，其特征在于所述的含外源基因的重组卫星RNA的构建是指通过根据卫星RNA两端序列和外源基因的序列，用DNA合成仪人工全合成重组卫星DNA，并将重组卫星DNA组装到转录载体上然后在CMV的存在下转录，或将重组卫星DNA进行体外转录，获得具有含外源基因的重组卫星RNA。
5.如权利要求1所述的一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法，其特征在于所述的外源基因的长度的优选范围为30bp～300bp。
6.如权利要求1所述的一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法，其特征在于所述的外源基因的长度的最优范围为50bp～150bp。
7.如权利要求1所述的一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法，所述的CMV可以含有卫星RNA或不含卫星RNA。
全文摘要
本发明提供了一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法,它以黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA作为表达载体,通过构建含外源基因的重组卫星RNA,接种植物并表达外源基因,或接种植物细胞培养物并在组织培养条件下表达外源基因。本发明不会破坏CMV复制体系的完整性,通过在卫星RNA上装载不同的目的基因并接种侵染不同植物,可持续高效表达不同的基因工程蛋白质,其表达量大大高于已有表达系统。
文档编号C12N15/83GK1247231SQ9811892
公开日2000年3月15日 申请日期1998年9月8日 优先权日1998年9月8日
发明者陈集双, 张耀洲, 冯明光, 柴立红 申请人:陈集双