一种包括有疫霉诱导性基因启动子的重组表达载体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，提供一种包括有疫霉诱导性基因启动子的重组表达载体及该疫霉诱导性基因启动子和重组表达载体的应用。本发明将大豆GmaKSTI36基因的启动子融合GUS报告基因构建到植物表达载体PMDC162中，并通过农杆菌介导的烟草瞬时表达和大豆根毛稳定表达系统，对启动子的病原菌诱导表达特性进行了分析。结果发现GmaKSTI36基因的启动子在两种不同的表达植物系统中，均能在疫霉的诱导下快速、高效的驱动GUS报告基因的上调诱导表达。由此可见，大豆的GmaKSTI36基因的启动子是病原诱导性启动子，为植物抗疫霉基因工程提供有价值的病原<诱导性启动子。
【专利说明】一种包括有疫霉诱导性基因启动子的重组表达载体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种包括有疫霉诱导性基因启动子的重组表达载 体及该疫霉诱导性基因启动子和重组表达载体的应用。
【背景技术】
[0002] 有效控制植物病害一直是植物病理学研究的核心问题。长期以来，使用化学农药 是病害控制的主要技术，但在实际应用中面临的问题是：一方面缺少有效的药剂，另一方面 在用药的过程中伴随的药害，环境污染等问题。后来又提出抗病育种策略，但因其周期长， 成本高，规模大，精准度低等一系列的问题，很难进行推广应用。随着分子生物学和生物技 术的发展，进一步提出了抗病基因工程的策略，但伴随的问题是：当组成性表达一个防卫反 应相关基因时，很难控制基因表达的精准度，往往会影响植物的正常生长发育。而病原诱导 性启动子可能为解决这一问题提供新的希望，因为病原诱导性启动子能在时空上精准的调 控基因在病原侵染点特异表达。
[0003] 大豆是世界上最重要的油料经济作物，也是最大的食用油和食用蛋白的来源。由 大豆疫霉（Phytophthora sojae)引起的大豆根、莖、苗和种子的腐烂病是一种重要的大豆 病害，该病害在世界范围内的大豆种植区几乎都可以检测到，它严重影响着大豆的产量和 质量，每年都造成巨大的经济损失。大豆疫霉属于卵菌，为土传病害，很多控制真菌的常用 方法对此病害的控制效果都不明显。目前控制大豆疫霉病害的主要方法是选育抗病品种， 但在生产上持续种植具有单一抗性的品种，其抗性会随着大豆疫霉菌的快速变异而丧失。 利用多基因控制的水平抗性也是生产上的一种常用策略，这种抗性虽然是可遗传的，但是 由于参与抗性的基因较多，常规育种的方法很难将其聚合到一个品种上。因此利用抗病转 基因工程策略，在大豆中筛选出疫霉诱导性启动子，将为大豆抗疫霉根腐病育种提供有价 值的启动子。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是解决现有技术中对大豆疫霉控制方法复杂、控制效果不明显，而 新型的抗病基因工程技术中缺少可用的病原诱导性启动子的问题，提供一个疫霉菌诱导性 启动子。该启动子来源于大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因，将该启动子构建在植物表 达载体PMDC162中，能在疫霉的诱导下特异的驱动下游⑶S报告基因的上调表达。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案实现
[0006] 1.本发明提供一种包括有疫霉诱导性基因启动子的重组表达载体，该重组表达载 体包括疫霉诱导性启动子，并包括由该启动子调控表达的报告基因；其中，疫霉诱导性启动 子位于大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因，GenBank:XM_003546586. 2的转录起始位点 ATG至上游1，500bp的区域。
[0007] 该启动子区主要包含三类顺式作用元件：第一类是基础表达元件包括14个 CAAT-box，一个TAAT-box ;第二类是病原诱导性顺式作用元件，如有约20个GT-I元件，约5 个W-box, 3个WRKY转录因结合元件；第三类是物理因素或激素诱导反应顺式作用元件,如 包含1个赤霉素反应元件GARE，1个赤霉素反应核心元件MYB，一个乙烯诱导反应元件LEC， 5个细胞分裂素诱导反应元件ARR1，2个脱落酸反应元件RY repeat, 1个脱落酸或胁迫反应 元件E-box，一个暗诱导反应元件ACGT等。该启动子能够在疫霉菌侵染初期，快速的驱动其 下游基因的上调表达。
[0008] 2.上述1提供的重组表达载体，其中，所述报告基因为⑶S报告基因，疫霉诱导性 启动子在GUS报告基因的上游，可以在疫霉菌的诱导下驱动GUS报告基因的表达。
[0009] 选择GUS报告基因与疫霉诱导性启动子结合，利于检测疫霉诱导性启动子的这种 病原菌诱导表达特征；当然，如果采用任何生物【技术领域】可用的报告基因与该疫霉诱导性 启动子结合，能达到同样的目的，均可，比如绿色荧光蛋白GFP等。
[0010] 3.上述1或2提供的重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体的出发载体为 植物表达载体PMDC162。
[0011] 出发载体采用植物表达载体并不是唯一，本发明列举出的植物表达载体PMDC162 只是一种更适合用于本发明提供的目的基因的转化。
[0012] 4.本发明还提供疫霉诱导性基因启动子在构建含有疫霉诱导性启动子的重组表 达载体上的应用。
[0013] 5.本发明还提供疫霉诱导性基因启动子在构建具有疫霉菌诱导表达的转基因植 物中的应用。
[0014] 6.上述5提供的大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因的启动子在构建具有疫霉菌 诱导表达的转基因植物中的应用，其中，该转基因植物为烟草或大豆。
[0015] 7.本发明还提供一种宿主细胞，其包括上述1-3任一项所述重组表达载体。
[0016] 8.本发明还提供上述1-3任一项提供的重组表达载体在构建具有疫霉菌诱导表 达的转基因植物中的应用。
[0017] 9.本发明还提供上述8提供的重组表达载体在构建具有疫霉菌诱导表达的转基 因植物中的应用，其中，该转基因植物为烟草或大豆。
[0018] 10.本发明还提供上述7提供的宿主细胞在构建具有疫霉菌诱导表达的转基因烟 草或转基因大豆中的应用。
[0019] 有益效果：
[0020] 1.发明人通过大量试验，发现来源于大豆的胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因的启 动子受大豆疫霉菌的诱导，能特异驱动下游基因的快速上调表达。因此，该基因启动子在大 豆抗疫霉基因工程中具有较强的应用潜力。
[0021] 2.由于病原菌侵染速度非常快，如果能够使受侵染植物快速启动其防卫相关基因 的表达，对提高其抗病性是至关重要。本发明通过试验，证明用大豆疫霉游动孢子沾根接种 的方法，处理7d(day)左右的大豆苗根部，可以在接种后的0.5h和2h检测大该基因的快 速、高强度的表达，并且其表达强度强于已报道的病原诱导性基因 PRla。说明大豆胰蛋白酶 抑制子GmaKSTI36基因是一个在疫霉侵染早期快速上调表达的基因。
[0022] 3.提前在烟草或大豆根毛中表达如下重组质粒：组成型启动子CaMV35S融合 ⑶S报告基因的35S:⑶S重组质粒，由大豆的GmaKSTI36基因启动子融合⑶S报告基因的 GmaKSTI36:⑶S重组质粒，以及由组成型启动子CaMV35S中的-46?+8区域的35S小启动 子35S min融合⑶S报告基因的35S min:⑶S重组质粒。72h后分别接种烟草疫霉或大豆 疫霉，可以在侵染后0. 5h驱动报告基因快速上调表达，2h后其驱动报告基因的诱导上调表 达水平达到CaMV35S组成型强启动子的水平。说明GmaKSTI36基因的启动子是病原诱导性 启动子。该启动子能在烟草瞬时表达和大豆根毛稳定表达系统中分别表达，在疫霉诱导下 快速驱动下游GUS报告基因的上调表达，为植物抗疫霉基因工程提供有价值的病原诱导性 启动子，其成为植物抗疫霉基因工程的候选材料，进一步可为生产上提供有持久抗病潜力 的育种材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图lGmaKSTI36基因启动子序列以及其主要包含的已知功能顺式元件
[0024] 图中标注+1位点的腺嘌呤A碱基为GmaKSTI36基因的起始位点。图中灰色加重 显示的碱基为启动子所包含的主要顺式元件，对应每个元件碱基序列的下部注明了该元件 的名称。
[0025] 图2构建疫霉诱导性启动子的重组植物表达载体pMDC162示意图
[0026] 图3GmaKSTI36基因是疫霉诱导早期快速上调表达的基因
[0027] A.GmaKSTI36基因在三个不同大豆品种中的基因芯片EST结果；B. GmaPRla基因在 三个不同大豆品种中的基因芯片EST结果；C. GmaKSTI36基因和GmaPRla基因的疫霉诱导 表达水平的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的验证结果。
[0028] 图4GmaKSTI36基因的启动子在烟草瞬时表达体系中的疫霉诱导表达
[0029] A. GmaKSTI36基因启动子，以及阳性对照CaMV 35S强启动子、阴性对照35S min小 启动子分别在烟草上表达3d后，用辣椒疫霉P.c35游动孢子（105/个）接种，并在接种后 的0,0. 5和2h检测⑶S报告基因的酶活性。
[0030] B. GmaKSTI36基因启动子，以及阳性对照CaMV 35S强启动子、阴性对照35S min小 启动子分别在烟草上表达3d后，用辣椒疫霉P.c35游动孢子（105/个）接种，并在接种后 的0,0. 5和2h用化学组织染色的方法检测GUS报告基因的活性。
[0031] C.GmaKSTI36基因启动子，在烟草上表达3d后，用辣椒疫霉P. c35游动孢子（105/ 个）接种，并在接种后的〇, 〇. 5和2h用实时荧光定量PCR的方法检测GUS报告基因转录水 平的表达。
[0032] 图5GmaKSTI36基因的启动子在大豆根毛稳定表达体系中的疫霉诱导表达
[0033] A.GmaKSTI36基因启动子转化大豆子叶，诱导产生根毛状组织后，用大豆疫霉 P. 6497游动孢子（105/个）接种，并在接种后的0,0. 5和2h检测⑶S报告基因的酶活性。
[0034] B. GmaKSTI36基因启动子，以及阳性对照CaMV 35S强启动子、阴性对照35S min小 启动子分别转化大豆子叶，诱导产生根毛状组织后，用大豆疫霉P6497游动孢子（105/个） 接种，并在接种后的〇,〇. 5和2h用化学组织染色的方法检测GUS报告基因的活性。
[0035] C.GmaKSTI36基因启动子转化大豆子叶，诱导产生根毛状组织后，用大豆疫霉 P6497游动孢子（105/个）接种，并在接种后的0,0. 5和2h用实时荧光定量PCR的方法检 测⑶S报告基因转录水平的表达。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0037] 实施例1
[0038] 大豆的GmaKSTI36基因是一个在疫霉侵染早期快速上调表达的基因
[0039] 1.芯片数据的筛选
[0040] 根据三个不同的大豆品种：V710370, Williams，Sloan(该三个大豆品种由南京农 业大学大豆疫霉与植物互作实验室保存）受大豆疫霉侵染过程全基因表达谱的芯片数据 文献（Zhou L, Mideros SX, Bao L, et al. Infection and genotype remodel the entire soybean transcriptome [J] · BMC Genomics, 2009, 10 (I) : 49-59.)，该文献分析了不同大豆 品种在疫霉侵染后的基因表达情况，结果表明几乎所有大豆基因的表达都受到疫霉侵染不 同程度地调节。我们依据该文献的基因芯片数据，首先筛选差异上调表达的芯片基因。三 个大豆品种的数据单独分析：根据接种Id的数据即侵染Id处理（疫霉侵染）与对照（未 侵染）的比值来筛选。具体采用如下用两种方法筛选，其一 ：SAM(Significance Analysis of Microarrays)方法，设置 Fold change>1.5SFDR(False discovery rate)〈0· 05,结果 Williams品种筛选出148个差异上调表达的芯片基因，V710370品种84个，Sloan品种55 个。其二：T-test方法，设置Fold change>1.5且T-test〈0. 05,结果与上面SAM得到的结 果一致。分别筛选出三个品种的差异芯片基因后，合并起来去除冗余后，最后得到198个芯 片基因在至少一个品种里上调表达。接着把这198个芯片基因 blast比对大豆基因，得到 180个大豆基因。进一步在180个基因中筛选42个基因是综合以下两个条件：第一、至少在 两个大豆品种里的表达量>1. 5倍；至少在一个大豆品种里的表达量>2倍；第二、芯片基因 与对应大豆基因 overlap的序列在大豆基因组里是唯一的，没有其他同源序列。共筛选到 42个差异上调表达的基因。进一步用荧光定量PCR的方法验证这42个基因的疫霉诱导表 达情况，初步获得8个疫霉诱导表达基因。本发明所涉及到的大豆GmaKSTI36基因及其启 动子是其中的一个，该启动子位于GmaKSTI36转录起始位点ATG的A碱基至上游的1，500bp 区段。对三个大豆品种V710370, Williams，Sloan经基因芯片技术检测GmaKSTI36基因的 EST结果见图3-A，结果表明该基因在大豆疫霉侵染后的3d在三个品种中分别上调表达约 104、53、113倍，在侵染后的5(1分别上调表达约198、99、171倍。而已报道的病原诱导性基 因 GmaPRla基因的EST对应的结果见图3-B，结果表明该基因在在三个大豆品种中在大豆疫 霉侵染后的3d分别上调表达约19、80、75倍，在侵染后的5d分别上调表达约71、167、263 倍。
[0041] 2.用大豆疫霉处理大豆根部
[0042] 将参试的大豆=Williams种子播种在蛭石培养基中，在25°C，16/8h光周期的温室 中培养。待大豆生长至两片真叶完全展开后，轻轻将豆苗从蛭石中拔出，用清水冲洗根部的 蛭石，小心尽量不要弄伤根部。将新鲜的大豆根浸泡在大豆疫霉菌游动孢子悬浮液，浓度为 IO5个/ml中，以清水浸泡作为对照，分别在接种后的0h，0. 5h，a取样，迅速用滤纸吸干水 分并剪下根部，保存在液氮中待用。
[0043] 3.实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)
[0044] 将有大豆疫霉菌孢子处理后的大豆根部材料，置研钵中加液氮研磨成粉末，力口 入试剂盒 RNeasy kit (Tiangen)的相应试剂，提取总 RNA。用 iScript cDNA Synthesis kit (TaKaRa)反转录为 cDNA，并定量到 IOOng μ Γ1。用 SYBR master mix (TaKaRa)试剂盒，在 ABI 7500Real_time PCR system荧光定量仪上采用SYBR green I荧光染料法进行qRT-PCR 分析，采用相对定量AAet法分析基因的转录水平表达情况。实验设计3个生物学重复。
[0045] 其中，检测大豆GmaKSTI36基因表达量的引物：上游引物Gmg2-QF :序列如SEQ ID NO. 1所示；下游引物Gmg2-QR :序列如SEQ ID NO. 2所示
[0046] 检测大豆GmaPRla基因表达量的引物：上游引物Gmg3-QF :序列如SEQ ID NO. 3所 示；下游引物Gmg3-QR :序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0047] 以大豆的 ACT2〇 (Genbank accession no. XMJW353I5I8. 1)作为内参基因，其引 物：上游引物ACT20-QF :序列如SEQ ID NO. 7所示；下游引物ACT20-QR :序列如SEQ ID NO. 7 所示。
[0048] 实验结果如3-C所示表明，大豆的GmaKSTI36基因在疫霉的侵染过程中，与Oh未 接种相比，能在接种后的0. 5h上调表达74倍左右，在接种后的2h上调表达81倍左右；而已 报道的病原诱导性基因 GmaPRla，分别在接种后的0. 5和2h上调表达23和28倍左右。由此 可见，大見的GmaKSTI36基因的疫霉诱导表达能力强于已报道的病原诱导性基因 GmaPRla。 说明来源于大豆的GmaKSTI36基因是一个在大豆疫霉侵染早期高效表达的基因，即疫霉诱 导性基因。
[0049] 实施例2大豆GmaKSTI36基因的启动子是病原诱导性启动子
[0050] 1.启动子的克隆与载体构建
[0051] 根据 Chai C, Lin Y, Shen D, et al. Identification and Functional Characteri-zation of the Soybean GmaPPOI2 Promoter Conferring Phytophthora sojae In-duced Expression[J]· Plos One, 2013, 8(6) :1_6.文章中构建启动子融合 GUS 报告基因的植物表达载体方法分别获得由组成型启动子CaMV35S融合GUS报告基因的 35S:⑶S重组质粒，由大豆的GmaKSTI36基因转录起始位点ATG上游1，500bp的启动子区 即疫霉诱导性启动子融合GUS报告基因的GmaKSTI36:GUS重组质粒，以及由组成型启动子 CaMV35S中的-46?+8区域的35S小启动子35S min融合⑶S报告基因的35S min:⑶S重 组质粒，构建以上重组质粒用到的植物表达载体是PMDC162。载体的构建模式图如图2所 示，图中的"启动子构入区"是分别把大豆的GmaKSTI36基因启动子，组成型CaMV35S启动 子，以及组成型CaMV35S启动子中的-46?+8区域分别经KpnI和BgLII双酶切后插入到 该区，形成相应启动子融合GUS报告基因的重组植物表达载体。
[0052] 2.农杆菌介导的本氏烟瞬时表达与接种
[0053] 将35S:⑶S、GmaKSTI36:⑶S和35S min:⑶S重组质粒的植物表达载体pMDC162通 过电转化技术转入GV3101农杆菌（Biovector)菌株（该菌株由南京农业大学大豆疫霉与 植物互作实验室保存）中，将农杆菌的阳性转化子于3ml添加卡那霉素（50μ g/ml)的LB培 养液中，220rpm，28-30°C培养48h，4000rpm离心4min，收集菌体，用IOmM MgCl2重悬，重复 三次后，用IOmM MgCl2定容至0D600 = 0.4-0. 6。取生长6-8周的烟草，从上数第三至第六 片完全展开的真叶被用于渗透接种农杆菌。用针头在烟草下表皮造成一小伤口，用ImL无 针头的注射器将30-50μ1农杆菌悬液渗透到本氏烟叶片中。注射后72h接种。剪下注射 的烟草叶片，浸泡在辣椒疫霉孢子悬浮液中，孢子浓度为IO 5个/mL，分别在接种后0,0. 5和 2h分别取样，迅速用液氮冻存，以备检测⑶S酶活性。实验重复三次，每次设三个生物学重 复，用于检测烟草瞬时表达体系中的疫霉诱导表达的报告基因 GUS活性。
[0054] 3.农杆菌介导的大豆根毛转化与接种
[0055] 大豆根毛转化主要参考Savka(Savka MA, Ravillion B, Noel GR, et al. Induction of Hairy Roots on Cultivated Soybean Genotypes and Their Use to Propagate the Soybean Cyst Nematode [J] · Phytopathology, 1990, 80 (5) : 503-508.)报道的方法：将作为 阳性对照的35S:⑶S、GmaKSTI36:⑶S和作为阴性对照的35S min:⑶S重组质粒的植物表达 载体PMDC162通过电转化技术转入发根农K599 (该菌株由南京农业大学大豆疫霉与植物互 作实验室保存）杆菌中，挑取转化的单克隆，在含有卡那霉素（50 μ g ml/1)的液体LB培养 基中，28°C震荡培养48h，3000r/min离心IOmin收集菌体，用IOmM MgCL2重悬浮，稀释至终 浓度0D_为0. 5-0. 6备用。将无菌大豆种子种在1/2MS培养基（正常的MS培养基中所有 添加元素减半后配置的培养基）中，在25°C，16/8h光暗交替培养室中生长5-6d，在超净台 上剪下大豆子叶，用无菌手术刀在每个子叶的背面挖洞，然后摆放在含有头孢和羧苄霉素 (各250 μ g ml/1)的Whiter培养基上，将稀释好的菌液滴在挖好的洞里，放置在25°C黑暗 条件下的培养箱中生长18-20d。待根毛长出4-8cm长时，剪下根毛浸泡在大豆疫霉游动孢 子悬浮液（1〇 5个/mL)中。分别在接种后011，0.511，211取样，用于检测大豆根毛稳定表达体 系中报告基因 GUS活性。
[0056] 4.⑶S活性分析
[0057] 4. 1⑶S化学组织染色
[0058] 参照 Jefferson 等方法（Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants [J]. EMBO J, 1987, 6(13) :3901-3907.)测定烟草叶片和根毛中的⑶S报告基 因的表达。将需要染色的叶片（来源于实例2的方法2的样品材料）或根毛（来源于实例 2的方法3中取到的样品材料）浸泡在⑶S染液（50mmol Γ1磷酸钠缓冲液pH 7. 0, IOmol T1EDTAammol Ll-GluhO.l% Triton X-100，10mmol Ρβ-巯基乙醇）中，置于 37°C温 育12h，75%乙醇冲洗两次，再用95%乙醇脱色，直至底色完全消失。分别在烟草上表达3天 后，用辣椒疫霉P. c35游动孢子（105/个）接种，并在接种后的0,0. 5和2h用化学组织染色 的方法检测GUS报告基因的活性。图4-B显示的是三个重组质粒瞬时表达烟草的化学组织 染色结果表明：与阴性对照（35Smin)相比，GmaKSTI36启动子能在瞬时转化的烟草叶片上 驱动报告基因的表达，并且在疫霉接种过程中其诱导表达水平不断提高，表现为染色的蓝 色深度与Oh相比在逐渐加深；在2h的表达能力几乎能达到阳性对照（35S)组成性启动子 的水平，表现为这两个点染色的蓝色深度几乎相同。图5-B显示的是三个重组质粒稳定表 达大豆根毛的化学组织染色结果表明：GmaKSTI36基因启动子能在转基因大豆根毛中，在 疫霉的诱导下持续的驱动GUS报告基因的表达，并且随着疫霉接种诱导的时间增长而活性 提高。在2h GUS染色的强度几乎接近了阳性对照（35S)的强度，而在阴性对照（35S min) 中没有颜色变化。
[0059] 4. 2⑶S酶活检测
[0060] 将需要测定GUS酶活性的材料：叶片（来源于实例2的方法2的样品材料）或根毛 (来源于实例2的方法3中取到的样品材料）各约IOOmg置研钵中加液氮研磨成粉末加入 提取缓冲液 500 μ I (50mM NaH2PO4, pH 7. 0, IOmM EDTA, 0· 1% Triton X-100, 0· I (w/v)十二 烷基磺酸钠，ΙΟπιΜβ-巯基乙醇），4°C离心，上清为⑶S蛋白提取液。用BSA法测定蛋白浓 度。取出部分加⑶S反应底物4-MUG，于37°C反应30min，在激发光365nm发射光455nm的 条件下进行荧光测定，3次生物学重复，最终以单位时间内产物的相对变化量来计算GUS报 告基因的酶活性值。图4-A显示的是三个重组质粒瞬时表达烟草检测GUS报告基因酶活的 结果表明，与未接种的样品相比，GmaKSTI36启动子能在接种后的0. 5h驱动报告基因上调 表达5. 7倍，在接种后的2h驱动报告基因上调表达9. 9倍。在阴性对照样品中几乎检测不 到GUS酶的活性，在阳性对照样品中，组成性表达的35S启动子能持续驱动报告基因的高水 平表达。图5-A显示的是GmaKSTI36:⑶S重组质粒稳定转化大豆根毛检测⑶S报告基因酶 活的结果表明：疫霉接种后的0. 5h和2h，GmaKSTI36基因启动子驱动GUS报告基因的酶活 性与Oh相比，分别提高到5. 7倍和10. 4倍。
[0061] 4. 3⑶S基因转录水平的检测
[0062] 以实施例2方法2和实施例2方法3获得的材料为对象，采用实时荧光定量PCR 的方法检测以检测GUS报告基因转录水平的表达，其具体实施方法同实施例1中的方法3。
[0063] 用本氏烟的EFla(Genbank accession no. AF120093. 1)作为烟草的内参基因，其 引物：上游引物EFla-QF:序列如SEQ ID NO. 5所示；下游引物EFla-QR:序列如SEQ ID NO. 6 所示。
[0064] 用大豆的ACT20 (Genbank accession ηο· ΧΜ_003531518· 1)作为大豆内参基因，其 弓丨物为：上游引物ACT20-QF:序列如SEQ ID NO. 7所示；下游引物ACT20-QR:序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0065] 检测⑶S转录水平表达用到的引物：上游引物mGUS-QF :序列如SEQ ID NO. 9所示； 下游引物mGUS-QR :序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0066] 图4-C显示的是GmaKSTI36:⑶S重组质粒瞬时表达烟草检测⑶S报告基因转录水 平的表达，结果表明：GmaKSTI36基因启动子在疫霉接种后的0. 5h能够驱动GUS报告基因 在转录水平上调表达3. 4倍，接种后的2h上调表达6. 2倍。图5-C显示的是GmaKSTI36:⑶S 重组质粒稳定转化大豆根毛检测GUS报告转录水平的表达，结果表明：在疫霉接种后的 0. 5h和2h，GmaKSTI36基因启动子驱动报告基因的转录表达能力分别提高3. 0倍和6. 8倍。
[0067] 用两种植物表达系统，三种不同的检测GUS报告基因活性的方法，最终验证了大 豆的GmaKSTI36基因的启动子能在疫霉诱导早期快速驱动其下游报告基因上调表达。由此 可见，GmaKSTI36基因的启动子是病原诱导性启动子。本研究中所用到的引物见表1。
[0068] 表1本研究中所用到的荧光定量引物
[0069]
【权利要求】
1. 一种包括有疫霉诱导性基因启动子的重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体 包括疫霉诱导性启动子，并包括由该启动子调控表达的报告基因；其中，疫霉诱导性启动子 位于大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因 GenBank:XM_003546586. 2的转录起始位点ATG 至上游1，500bp的区域。
2. 权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于：所述报告基因为GUS报告基因，疫霉 诱导性启动子在GUS报告基因的上游，可以在疫霉菌的诱导下驱动GUS报告基因的表达。
3. 权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体的出发载体为 植物表达载体PMDC162。
4. 疫霉诱导性基因启动子在构建含有疫霉诱导性启动子的重组表达载体上的应用。
5. 疫霉诱导性基因启动子在构建具有疫霉菌诱导表达的转基因植物中的应用。
6. 权利要求5所述的大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因的启动子在构建具有疫霉菌 诱导表达的转基因植物中的应用，其特征在于：该转基因植物为烟草或大豆。
7. -种宿主细胞，其特征在于：包括权利要求1-3任一项所述重组表达载体。
8. 权利要求1-3任一项所述的重组表达载体在构建具有疫霉菌诱导表达的转基因植 物中的应用。
9. 权利要求8所述的重组表达载体在构建具有疫霉菌诱导表达的转基因植物中的应 用，其特征在于：该转基因植物为烟草或大豆。
10. 权利要求7所述的宿主细胞在构建具有疫霉菌诱导表达的转基因烟草或转基因大 豆中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK104212831SQ201410469888
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】窦道龙, 柴春月, 曾文韬 申请人:南京农业大学