无机焦磷酸盐及其用途
【专利摘要】本发明提供了包含一定量的无机焦磷酸盐(PPi)的新型且改进的精子刺激添加剂。在用于人/动物体外受精(IVF)的介质中添加PPi改善了受精率；在用于农场动物人工授精(AI)的精液延长剂中添加PPi可以改善受孕率；此外，在包括PPi的介质中体外成熟的哺乳动物卵母细胞达到改善的受精和发育潜能，而在补充PPi的介质中培养的胚胎向囊胚的发育得到改善。
【专利说明】无机焦磷酸盐及其用途
[0001] 交叉引用相关申请
[0002] 本申请要求2011年12月9日提交的美国临时申请系列号61/630, 345的优先权， 所述申请的完整公开内容通过引用并入本文。
[0003] 关于联邦资助的研究的声明
[0004] 本发明是在来自USDA国家食品和农业研究院（USDA-NIFA)的拨款号 2007-35203-18274和2011-67015-20025的政府支持下进行的。政府在本发明中具有某些 权利。
【技术领域】
[0005] 本发明涉及用于人工授精的组合物及使用方法。更具体地，本发明涉及用于农场 动物的人工授精和人类不孕临床中的体外受精和胚胎培养的精子刺激添加剂。
【背景技术】
[0006] 人工授精（AI)是猪和牛养殖中的常用技术。新鲜射精的公猪精液必须储存在延 长剂溶液中用于在15_18°C或4_5°C保存，公牛精液必须在液氮中冷冻保存和储存之前进 行延长。已经开发各种类型的延长剂溶液和化合物，以降低精子代谢活性并允许延长保存。 然而，需要新型且改进的培养基和/或精子延长剂，以改善动物中的人工授精和人类中的 体外受精和胚胎培养。
【发明内容】
[0007] 在一个方面，本发明提供了包含无机焦磷酸盐（PPi)的精子保存介质。在一个实 施方案中，PPi的浓度为约luM至约200iiM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约liiM 至约20 iiM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约10 iiM。在又另一个实施方案中，保存 介质用于保存来自猪的精子。
[0008] 在另一个方面，本发明提供了包含无机焦磷酸盐（PPi)的精子转移的介质。在一 个实施方案中，PPi的浓度为约1 U M至约200 ii M。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约 1 U M 至约 20 ii M〇
[0009] 本发明的另一个方面提供了包含无机焦磷酸盐（PPi)的体外受精（IVF)或人工授 精（AI)的介质。在一个实施方案中，PPi的浓度为约luM至约200 iiM。在另一个实施方 案中，PPi的浓度为约1 U M至约20 ii M。
[0010]在另一个方面，本发明提供了精液性别鉴定方法，其包括：(a)在洗脱介质的帮助 下将第一培养介质中的混合的精子悬浮液分为具有x或具有y的精子的群体；(b)在第二 培养介质中保存具有x或具有y的精子，其中，将无机焦磷酸盐（PPi)添加至第一培养介 质、洗脱介质或第二培养介质中。
[0011] 在又另一个方面，本发明提供了精子保存的方法，其包括在包含无机焦磷酸盐 (PPi)的介质中储存精子。在一个实施方案中，PPi的浓度为约luM至约200 iiM。在其它 实施方案中，PPi的浓度为约luM至约20iiM，或PPi的浓度为约lOiiM。在又另一个实施 方案中，将精子在包含PPi的介质中储存最多达10天。
[0012] 本发明的另一个方面提供了体外受精（IVF)的方法，其包括在无机焦磷酸盐 (PPi)存在的情况下将卵母细胞与精子接触。在一个实施方案中，PPi的浓度为约luM至 约200 yM。在另一个实施方案中，PPi的浓度为约liiM至约20 yM。在另一个实施方案中， 在PPi存在的情况下储存精子。
[0013] 在另一个方面，本发明提供了培养胚胎的方法，其包括在包含无机焦磷酸盐的介 质中培养胚胎。
[0014] 在又另一个方面，本发明提供了人工授精的方法，其包括将精子和无机焦磷酸盐 (PPi)提供至雌性的生殖道。在一个实施方案中，将PPi逐渐释放到雌性的生殖道。
[0015] 本发明的另一个方面提供了体外成熟卵母细胞的方法，其包括在包含无机焦磷酸 盐的介质中培养卵母细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1:显示通过荧光分析测量焦磷酸盐（PPi)含量。（A)PPi标准品（最终浓度 0-200 iiM PPi)的荧光强度。（B)用公猪精浆（SP)、猪输卵管液（pOVF)、兔血清、小鼠血清 (最终浓度10 U g/ml)、公猪精子（lxlO6个精子/ml)和10mM H202工作溶液（阴性对照）的 PPi测定。在多个时间点测量荧光强度以遵循反应动力学（激发530nm;发射590nm)。重 复实验三次。值表示为荧光强度的平均值。
[0017] 图2 :显示PPi的生成。PPi由细胞中ATP水解成AMP而产生。无机焦磷酸酶（PPA1) 催化PPi的水解，以形成2个正磷酸盐（2Pi)，导致能量释放。
[0018] 图3:显示通过Western印迹检测无机焦磷酸酶（PPA1)。提取公猪精楽（SP; 20ug/ml)、猪输卵管液（p0VF;100iig/ml)和公猪、公牛、小鼠和人精子（均为lxlO 6个精 子/ml)以进行蛋白分析。使用相等蛋白上样量。通过兔多克隆抗PPA1抗体检测?32kDa 的明显条带。来自酿酒酵母的纯化PPA1 (最右侧泳道；1 ii g/ml ;Sigma 11643)用作对照蛋 白。
[0019] 图4:显示通过免疫荧光定位精子中的无机焦磷酸酶（PPA1;红）。（A，B)公猪精 子的全封固免疫荧光。在精子尾部连接件和精子头部的顶体后鞘中观察到最显著的标记。 (C)在IVF过程中配子混合后30min时，在附着至卵母细胞透明带的精子中观察到相同的标 记。（D)用全长PPA1蛋白免疫饱和的抗PPA1抗体的阴性对照。DNA用DAPI (蓝色）复染。 落射荧光显微照片与用DIC光学获得的齐焦透射光照片重叠。
[0020] 图5 :显示在有/无PPi的情况下精子储存过程中的精子活力和线粒体膜电位。 (A)基于SYBR14(活精子）和PI (死精子）标记的活精子的百分比。（B)具有极化（活）、 正在去极化（正在死亡）和去极化（死亡）线粒体膜的精子的百分比。重复实验三次。值 表示为荧光强度的平均百分比土SEM。各组列中不同的上标a&b表示p〈0. 05的显著性差 异。
[0021] 图6 :显示PPi对储存的公猪精子的蛋白酶体酶活性的影响。将新鲜公猪精子储 存在有和没有10 U M PPi的BTS中3或10天（未处理/PPi+BTS)。使用特异性荧光底物 Z-LLE-AMC (A)、Z-LLVY-AMC (B)、Z-LLL-AMC (C)和泛素-AMC (D)测量蛋白酶体蛋白水解和 去泛素活性。在独立处理中，在测量前将ppi添加至没有ppi的情况下保存的精子中（添 加PPi)。作为阴性对照，在第3天将lOiiM MG132(蛋白酶体抑制剂）添加至"未处理"和 "PPi+BTS"精子。重复实验三次。值表示为荧光强度的平均值。
[0022] 图7 :显示PPi对IVF过程中总精子和多精子受精的影响。值表示为荧光强度的平 均百分比土SEM。□ %单精子和 %多精子卵母细胞。各组列中不同的上标a-c表示p〈0. 05 的显著性差异。授精的卵子数标明在括号中。（A)在渐增浓度PPi存在的情况下用IX 106 个精子/ml的标准浓度授精体外成熟的猪卵母细胞。重复实验五次。（B)反映体外精子受 精能力（与小图A相同）的多精受精率在PPi存在的情况下显著增加。（C)在10iiM PPi 存在/不存在的情况下用不同浓度的精子授精的猪卵母细胞的受精率。重复实验三次。（D) 用在有/没有10 U M PPi的BTS中保存3天的公猪精子授精的卵母细胞受精率。将其它猪 卵母细胞用有和没有PPi的情况下储存的精子在有和没有10 U M PPi的情况下授精（精子 浓度5X 105个精子/ml)。重复实验三次。（E)外在PPA1酶对猪IVF的影响。将卵母细胞 用不同浓度的纯化的PPA1蛋白授精。重复实验两次。（F)将猪卵母细胞在兔多克隆抗PPA1 抗体或非免疫兔血清（PPA1抗体的对照）存在的情况下授精。重复实验两次。
[0023] 图8 :㈧显示PPi对精子-透明带结合的影响。将猪卵母细胞用各种浓度的 PPi (精子浓度5X 105个精子/ml)授精30min，固定并用DNA染料DAPI染色。在落射荧光 显微镜下计数每个透明带（ZP)结合的精子数。值表示为荧光强度的平均值土SEM。各组 列中不同的上标a-c表示p〈0. 05的显著性差异。授精的卵子数标明在括号中。（B)小图A 的顶体反应的精子的百分比（PNA-FITC染色的）。值表示为荧光强度的平均百分比土SEM。 各组列中不同的上标a&b表示p〈0. 05的显著性差异。（C)PPi补充对商购和定制BTS延长 剂中储存的精子活力的影响。在室温下将公猪精子在有和没有10uM PPi的BTS-IMV(IMV technologies, France)或BTS-HM(自制）中保存7天。通过在37. 5°C在光学显微镜下观 察评价精子活动性。与所有其它组相比，在第6天在具有PPi的BTS-MV中观察到较高的 精子活动性。重复实验两次。各组列中不同的上标a、b表示p〈0. 05的显著性差异。（D)将 过量浓度的PPi添加至IVF介质中。受精率随着高浓度的PPi下降。重复实验两次。值表 示为荧光强度的平均百分比土SEM。口％单精子和_%多精子卵母细胞。授精的卵子数标 明在括号中。（E)PPi对用在商售延长剂BTS-IMV中储存的精子受精的影响。使用在具有 10iiM PPi的BTS-B1V中保存（3天）的精子实现接近100%受精。重复实验两次。值表示 为荧光强度的平均百分比土SEM。口％单精子和_%多精子卵母细胞。授精的卵子数标明 在括号中。
【具体实施方式】
[0024] 本发明提供了用于精子保存、胚胎培养、体外受精（IVF)、人工授精（AI)的新型 介质和方法。具体而言，本发明代表了本领域中的进步，因为它报道并确认了无机焦磷酸 盐（PPi)存在于哺乳动物的精子、精浆（SP)和输卵管液（0VF)中，尽管以前的研究已经 显示胞质PPi的浓度在哺乳动物细胞中受到精确调节（Baykov等人，Prog Mol Subcell Biol23:127-150, 1999 ;Sivula等人，FEBS Lett 454:75-80, 1999)。在本发明的一个方面， PPi可能因此被用作精子活力的能源。
[0025] 在一个实施方案中，本发明提供了新型且改进的精子保存介质，也称作精子延长 齐U，其可以延长精液储存期且维持精子活力，因此改善动物中的AI。本发明还提供了用于动 物中胚胎转移的新型且改进的培养介质。
[0026] 在另一个实施方案中，本发明提供了动物和人类临床中IVF和AI的新型且改进的 方法以及胚胎培养介质。
[0027] 在本发明的又另一个方面，描述了采用Ppi进行精液性别鉴定的新型且改进的方 法。本精液性别鉴定方法包括在精液性别鉴定程序过程中在介质中添加一定量的Ppi以增 强精子寿命和活力的步骤。例如，根据本发明的某些实施方案，本精液性别鉴定方法可以包 括在起始精子处理介质中（含有具有x和具有y的精子两者；在常规分开/分选步骤之前） 中，在洗脱介质，或在性别分开精子介质中添加PPi的步骤。
[0028] 传统上，将Beltsville解冻溶液（BTS)作为解冻溶液添加至冻融精子，并且也用 于液体储存3-5天（Johnson等人，Zuchthygiene 23:49 - 55, 1988)。由BTS延长的液体 精液通常由于其简单组成和运输的发展已用于AI。然而，在延长剂中保存的精子的运动性 在储存过程中由于自然老化、ATP和cAMP的损失以及降低的钙摄取而逐渐降低（Johnson 等人，Anim R印rod Sci 62143-172,2000)。收集后保存5天的延长精液显示约50 %的 产仔率降低，相比之下，收集后保存2天的精液显示约65-70 %的产仔率降低（Johnson等 人，Anim Reprod Sci 62143-172; Johnson 等人，Zuchthygiene 23:49 - 55, 1988; Johnson and Rath, (Eds), Proc. 2nd Int.Conf.Deep Freezing Boar Semen. Reprod. Domest. Anim. , Suppl. 1, p. 402, 1991 ;Rath 等人，（Eds) Proc. Int. Conf. Deep Freezing of Boar Semen. Reprod. Domest. Anim. Suppl. 1. p. 342, 1996 ；Johnson, Proc. 15th Int. Pig Vet. Sci. Congress 1,225 - 229, 1998)。最近，Yeste等人（Anim R印rod Scil08:180-195, 2008) 表明，将前列腺素F2a (PGF2a)添加至BTS中稀释的精子在冷却6天后较好地维持了精子活 力和运动性。
[0029] 无机焦磷酸盐（PPI)是晶体成核和生长（Fleisch等 人，Nature212:901-903, 1966)的有效的矿物质结合的小分子抑制剂，并且存在于大多 数组织的细胞外基质和体液包括血浆（Fleisch等人，Am J Physiol203:671-675, 1962; Russell等人，J Clin Invest 50:961-969,1971)。已经在培养的肝细胞和软骨细胞中 观察到 PPi 代谢（^Davidson 等人，Biochem J254:379-384, 1988 ; Johnson 等人，1999 ; Rosen 等人，Arthritis Rheum40:1275_1281, 1997 ;Rosenthal 等人，Calcif Tissue Int 59:128_133，1996;Rosenthal 等人，J Rheumatol 26:395_401，1999;Ryan 等 人，Arthritis Rheum42:555-560, 1999)。细胞内PPi在线粒体中生成，并且细胞内和细 胞外PPi浓度受线粒体能量代谢调节（Davidson等人，Biochem J 254:379-384,1988; Johnson 等人，Arthritis Rheum 43:1560-1570,2000)。在原核生物中，PPi 提供"高能 量"化合物，并且能够在衰减呼吸下的糖酵解相关反应中代替ATP (Chi等人，J Biol Chem 275:35677-35679, 2000)。此外，PPi 产生具有 PPA 的线粒体膜电位（Pereira-da-Silva 等 人，Arch Biochem Biophys304:310-313, 1993)，且ATP-衍生的PPi充当在酵母线粒体中以 及哺乳动物细胞中蛋白磷酸化的磷酸供体（da Silva等人，Biochem Biophys Res Commun 178:1359-1364, 1991 ；Terkeltaub et al,Am J Physiol Cell Physiol281:C1-C11, 2001)〇 因此，PPi可以用作活力的能量来源。
[0030] 细胞PPi由各种生物合成过程中产生，并且被无机焦磷酸酶（PPA1)水解为两种无 机磷酸盐（Pi)。PPA1是广泛存在的金属依赖性酶，其为许多生物合成反应，诸如DNA、RNA、 蛋白、多糖合成和细胞寿命提供热力学拉力（Chen等人1990, Lundin等人1991，Sonnewald 1992, Lahtil983，Peller 1976)。PPA1 已经在细菌（Chen 等人 1990)和酵母（Lundin 等人 1991)中检测到，且可溶性PPA1在猪支原体（属于附着于宿主红细胞表面的嗜红细胞细 菌）中鉴定和表征（Hoelzle等人）。然而，PPi尚未用于与精子保存或AI或IVF程序相关 的任何介质中。
[0031] 本发明将PPi途径鉴定为哺乳动物精子生理学的重要组分。参照图2，PPi (P20广） 由细胞中ATP水解为AMP形成，然后，被无机焦磷酸酶（PPA1)水解为两个分子的无机正磷 酸盐（Pi)。PPA1，一种能量代谢的重要酶（Chen 等人，J Bacteriol 172:5686-5689, 1990 ; Lundin等人，J Biol Chem 266:12168-12172, 1991)，已经牵涉于植物中代谢、生长和发 育的调节（Sonnewald, Plant J 2:571-581，1992)，甚至牵涉于寄生的蛔虫属蛔虫的发育 和蜕皮（Islam等人，Infect Immun 73:1995-2004, 2005)。在酿酒酵母的细胞分裂过程 中，PPA1对于线粒体基因组复制是必需的（Lundin等人，Biochim Biophys Acta 1098; 217-223, 1992)。
[0032] 尽管PPA1在精子尾部连接件，携带型精子中心粒和锚固鞭毛外致密纤维和微管 双峰中是可检测的，但本发明表明，来自这些部位，PPi的代谢途径可以在精子-透明带穿 透过程中传递能量用于鞭毛运动和用于顶体功能。此外，本发明还表明，精子头部和鞭毛中 的PPi途径可以支持在输卵管精子贮库中在体外和体内观察到的精子获能过程中的蛋白 磷酸化。
[0033] 本发明进一步描述了当精子经历获能、顶体反应和精子-透明带穿透时哺乳动物 精子在精子运输和精子-卵相互作用过程中利用PPi作为能量来源的能力。本发明公开了 PPi可用作对于大型动物生物技术的精液储存和转移过程中改善精子活力和对于哺乳动物 物种（包括人）中辅助生殖治疗增强精子穿透和受精率增强的稳定廉价的能量来源。本发 明进一步提供了在培养介质、精子延长剂、IVF介质或者精子性别鉴定中采用的介质中添加 PPi以便在精子保存和受精中提供有益效果，诸如在精子保存和转移过程中增加精子长寿 和活力，和在受精过程维持和增强精子活力、穿透和受精率。
[0034] 因此，本发明的介质可以包含PPi，其浓度可以根据动物物种而变化。在某些实施 方案中，本发明的介质可以包含约1至200 ii M的PPi。在另一个实施方案中，本发明的介质 可以包含约1至20 yM。本发明可以用于各种哺乳动物，包括农场动物，诸如公猪和公牛。
[0035]对于IVF或AI，可以将PPi直接添加或逐渐释放到介质中。如果需要，PPi释放在 AI过程中可以精确控制/调节，特别是当含有的PPi-缓释凝胶用作AI导管的一部分时，以 便将PPi逐渐释放至雌性生殖道。
[0036] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语和本发明所属领域普通技术人 员通常理解的具有相同含义。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都 以其整体通过引用并入。
[0037] 实施例
[0038] 以下公开的实施方案仅仅是可以以各种形式体现的本发明的代表。因此，在以下 实施例中公开的具体结构、功能和程序详情不被解释为限制性的。
[0039] 实施例1
[0040] 精液采集与处理
[0041] 在University of Missouri-Columbia(UM-C)的批准的动物护理和使用委员会 (ACUC)方案的指导下从15-22个月龄的证明能生育的成体杜洛克公猪（Duroc boars)收 集精液。将公猪置于每周一次收集的常规收集时间表。将射精物中富含精子的级分收集到 绝缘的真空瓶中。使用具有大于85%活动精子的富含精子的级分。用刻度量筒确定精液 体积。通过血细胞计数器（Fisher Scientific, Houston, TX)估计精子浓度。以250X放大 率通过光学显微镜在38. 5°C估计活动精子的百分比。使精液到收集后2h缓慢冷却至室温 (20-23°C )，并用Beltsville解冻溶液（BTS ;100. 0ml蒸馏水中3. 71g葡萄糖、0? 60g柠檬 酸三钠、1. 25g乙二胺四乙酸、1. 25g碳酸氢钠、0. 75g氯化钾、0. 06g青霉素G和0. 10g链霉 素）（Pursel和Johnson 1975)稀释剂稀释至100ml BTS稀释剂中35X 106个精子/ml的 最终浓度。将稀释精液在室温在Styrofoam?盒中储存10天。除非另有说明，否则本研究 中使用的所有化学品购自Sigma Chemical Co. (St. Louis, M0)。
[0042] 实施例2
[0043] 猪卵母细胞的收集和体外成熟（IVM)
[0044] 卵巢收集自当地屠宰场的青春期前母猪，并在暖箱（25-30°C )中运输至实验室。 从窦性卵泡（直径3_6111111)抽吸卵丘卵母细胞复合体（0)〇，在含有0.01%(?八）聚乙烯 醇（PVA)的HEPES缓冲的Tyrode乳酸盐（TL-HEPES-PVA)介质中洗涤三次，然后用成熟介 质洗涤三次（Abeydeera 等人，Biol R印rod 58:1316-1320,1998)。每次，将总共 50 个 C0C 转移至含有500 y 1成熟介质的4孔多皿（Nunc, Roskilde, Denmark)，所述4孔多皿已经 用矿物油覆盖并在38. 5°C用空气中5% C02平衡。用于卵母细胞成熟的介质是补充0. 1% PVA、3. 05mM D-葡萄糖、0. 91mM 丙酮酸钠、0. 57mM 半胱氨酸、0. 5 ii g/ml LH(L5269, Sigma)、 0? g/ml FSH(F2293, Sigma)、10ng/ml 表皮生长因子（E4127, Sigma)、10 % 猪滤泡 液、75 ii g/ml青霉素G和50 ii g/ml链霉素的组织培养介质（TCM) 199 (Gibco, Grand Island, NY)。培养22h后，在38. 5°C、5% C02将卵母细胞无LH和FSH的TCM199中洗涤两 次并培养。
[0045] 实施例3
[0046] 猪卵母细胞的体外受精（IVF)和培养
[0047] 卵母细胞成熟后，将卵丘细胞用TL-HEPES-PVA介质的0. 1 %透明质酸酶取出并用 TL-HEPES-PVA 介质和含有 0.2% BSA(A7888, Sigma)的 Tris-缓冲（mTBM)介质（Abeydeera 等人，Biol R印rod 58:1316-1320,1998)分别洗涤三次。此后，将25-30个卵母细胞置于 35mm聚苯乙烯培养皿中已经用矿物油覆盖的四滴50 ill mTBM介质中的每一滴。使所述皿 在培养箱中平衡30min，直至添加精子用于受精。将lml BTS稀释剂中保存的液体精液在含 有0. 1%PVA(PBS-PVA)的PBS中以800Xg洗涤两次，每次5min。在洗涤程序结束时，将精子 悬浮在mTBM介质中。适当稀释后，将50 ill这种精子悬浮液添加至50 ill含有卵母细胞的 介质中，以得到1-10 X 105个精子/ml的最终精子浓度。在精子添加时将不同浓度的无机焦 磷酸盐（PPi ;S6422, Sigma)添加至受精滴（最终浓度；0-20 ii M)。在38. 5°C，5% C02将卵母 细胞与精子共同孵育6h。在IVF后6h时，将卵母细胞转移至含有0. 4% BSA(A6003, Sigma) 的NCSU23中，用于在16-20h过程中进一步培养。
[0048] 实施例4
[0049] 免疫荧光和受精率的评估
[0050] 将精子/卵母细胞在室温在2%多聚甲醛中固定40min，洗涤，在含有0. 1% Triton-X-100的PBS (PBS-TX)中透化，并在含有5%正常山羊血清的PBS-TX中封 闭25min。将精子/卵母细胞与兔多克隆抗焦磷酸酶1(PPA1)抗体（1:200稀释 度；#ab96099, Abeam, San Francisco, CA)或兔多克隆抗 ANKH 抗体（1:200 稀释度； #SAB1102581，Sigma)孵育 40min，然后用山羊抗兔（GAR)-IgG-TRITC (1/80 稀释度； Zymed Inc.，San Francisco, CA)孵育。对于受精的评估，将卵母细胞/受精卵在室温 用2 %甲醛固定40min，用PBS洗涤三次，在室温用PBS-TX透化40min，并用2. 5 ii g/ml DAPI (Molecular Probes, Eugene, OR)染色40min。在卵质中具有两个或更多个原核和至 少一个精子尾部的卵母细胞被记录为受精的。为了计数结合至透明带的精子或顶体反应 精子的数目，在IVF 30min(5X105个精子/ml)后，将卵母细胞固定和并用DAPI和顶体结 合凝集素PNA-FITC (Molecular Probes)染色。图像采集在具有Cool Snap摄像头（Roper Scientific, Tucson, AZ)和 MetaMorph 软件（Universal Imaging Corp.，Downington，PA)的 Nikon Eclipse 800 显微镜（Nikon Instruments Inc.，Melville, NY)上进行。
[0051] 如图4中显示，免疫荧光法检测到公猪精子的精子尾部连接件和顶体后鞘中PPA1 的显著标记。体外受精的30min时在附着在卵母细胞透明带的精子中发现相同标记，而抗 PPA1抗体被全长重组PPA1蛋白免疫饱和的阴性对照显示没有此类荧光，并且未穿透精子 的标记也显示没有此类突光。
[0052] 实施例5
[0053] Western印迹和免疫荧光
[0054] 对于western印迹，每个泳道上样1 X 106个精子/ml的提取物。将精子在PBS中 洗涤并用上样缓冲液（50禮1'1^匕116.8]，1501111恥(：1，2%505,20%甘油，5%3-巯基 乙醇，0.02%溴酚蓝）煮沸。凝胶电泳在4-20%梯度凝胶（PAGEl?⑧预制凝胶，Lonza Rockland Inc.，Rockland, ME)上进行，随后使用 Owl 湿转系统（Fisher Scientific)以恒定 50V持续4h转移至PVDF膜（Mi 11 ipore)。将膜依次与10 %脱脂乳孵育lh，然后与抗PPA1或 抗ANKH抗体（1:2, 000稀释）孵育过夜。然后将膜与HRP缀合的山羊抗兔IgG(GAR-IgG-HRP; 1:10, 000稀释）孵育lh。将膜与化学发光底物（SuperSignal, Pierce, Rockford, IL)反应 并通过暴露于 Kodak BioMax Light 胶片（Kodak, Rochester, NY)可视化。
[0055] PPA1在哺乳动物的精浆、输卵管液和精子中检测到。如图3中显示，通过使用兔 多克隆抗PPA1抗体的Western印迹在公猪精浆中、猪输卵管液中、和公猪、公牛、小鼠和人 精子中检测到对应于PPA1的计算质量（32kDa)的蛋白条带。每个精子样品中观察到较高 (?51和75kDa)或较低质量（公猪中?13kDa和公牛中?18kDa)的小条带，可能对应于 PPA1的翻译后蛋白修饰和降解产物。用作阳性对照蛋白的来自面包酵母（酿酒酵母）的纯 化PPA1也显示出在32和13kDa的额外条带。
[0056] 实施例6
[0057] 焦磷酸盐测定
[0058] 遵循制造商的方案使用PiPer?焦磷酸盐测定试剂盒（目录号P22062, Molecular Probes)进行焦磷酸盐（PPi)的测量。使用IX反应缓冲液（试剂盒）用公猪精浆（SP)、 猪输卵管液（0VF)、兔血清、小鼠血清（最终浓度10 y g/ml)、公猪精子（lxlO6个精子/ml) 和lOmM H202工作溶液（阴性对照）制备样品。通过稀释50mM PPi标准溶液（最终浓度 0-200 ii M PPi)制备PPi标准品。100 ii M Amplex? Red试剂的工作溶液含有0. 02U/ml无 机焦磷酸酶（PPA1)、4U/ml麦芽糖磷酸化酶、0. 4mM麦芽糖、2U/ml葡萄糖氧化酶和0. 4U/ml HRP。在该反应中，PPA1将PPi水解为两个无机焦磷酸盐（Pi)。在Pi存在的情况下，麦芽 糖磷酸化酶将麦芽糖转化为葡萄糖1-磷酸和葡萄糖。然后葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化为 葡萄糖酸内酯和h2o2。在辣根过氧化物酶（hrp)存在的情况下，h2o2与Amplex?Red试剂 (1〇-乙酰基-3,7-二轻基吩卩惡嗪（(1；[115^(?5^11611(?32；[116))反应生成试齒灵0^80；1011 ：丨11), 其通过突光检测。分别将50 li 1样品上样至黑色96孔板（Coster-Corning, Corning, NY)， 然后将50 ill工作溶液添加至样品。将96孔板在37. 5°C孵育30min，并在多个时间点测定 突光以遵循反应的动力学。使用530nm激发和590nm的发射波长通过Thermo Fluoroskan Ascent (ThermoFisher Scientific)测量突光强度。
[0059] 通过荧光测定法测量公猪SP、p0VF和公猪精子中PPi的含量的的结果显示在图1A 和1B中。不同浓度的PPi作为标准品测量（0-200 ii M PPi)，并且荧光强度随着渐增浓度 的PPi渐进地增加（图1A)。p0VF、SP、精子、小鼠血清和兔血清中的荧光强度也增加。如 图1B中显示，公猪精子、小鼠血清和兔血清在采集40min时比SP或pOVF显示较高的荧光 强度（98. 2-101. lvs. 83. 8&85. 5)。然而，pOVF、小鼠血清和兔血清的强度逐渐下降。只有 SP和精子在测量过程中显示荧光强度的连续增加（荧光强度：在60min时111. 5&117.7， p〈0.05)。阴性对照，10mMH202，显示渐减模式，最可能是由于荧光漂白。
[0060] 实施例7
[0061] 精子活力和线粒体膜电位的流式细胞术分析
[0062] 公猪精子用PBS-PVA洗涤2次，并且将精子浓度调整至PBS-PVA中1X10 6个精子/ ml。遵循制造商的方案，通过LIVE/DEAD⑧精子活力试剂盒（L-7011, Molecular Probes) (其含有DNA染料SYBR14和碘化丙啶（PI))评估精子活力。将精子样品（198 ill)上样至 96孔板上。将SYBR14(liil ;最终浓度100nM)和PI(liil ;最终浓度12iiM)添加至精子 样品并在37. 5°C在黑暗中孵育10min。使用Guava EasyCyteTM Plus流式细胞仪（Guava Technologies, IMV Technologies, L'Aigle, France)进行流式细胞术分析。对于每份样品， 使用标准的制造商设置通过Guava ExpressPro Assay程序分析5, 000个事件。为了评估 精子线粒体电位（mitopotential)，将公猪精子用JC-1 (目录号4500-0250, MitoPotential Kit, MV)染色，并使用制造商的设置进行测量。对于阴性对照，向精子样品添加DMS0或不 添加染色溶液。
[0063] 遵循公猪精液储存的行业惯例，将新鲜公猪精液在BTS延长剂中稀释并在室温 (15-17°C )储存10天。设计基础延长剂用于短期储存（3-5天）；然而，将储存期限延长至 10天，以便比较在10 U M PPi存在/不存在的情况下在存储3天和10天之间的精子活力线 粒体膜电位。如上所述，使用SYBR14/PI活力试剂盒通过流式细胞术评估精子活力，并使用 JC-1染料测量线粒体电位。补充PPi改变了上述探针产生的荧光的直方图和散点图，媒介 物对照DMS0没有产生荧光。
[0064] 图5A和5B比较了在有和无PPi的情况下精子储存过程中的精子活力和线粒体膜 电位。如图5A中显示，活精子的百分比在第3天时比第10天时更高（p〈0. 05)，但对照精子 和添加10 iiM PPi的精子之间没有显著差异。与活力相反，PPi补充增强了代谢活跃精子 的含量，其中在第3天具有极化的线粒体膜（图5B)。在用10 y M PPi储存10天的精子中 观察到类似倾向（图5B)。
[0065] 实施例8
[0066] 蛋白酶体-蛋白水解活性的测量
[0067] 在有或没有PPi的情况下在储存3天和10天的精子中使用特异性荧光底物 Z-LLL-AMC、Z-LLVY-AMC、Z-LLE-AMC和泛素-AMC测定对于受精必不可少的蛋白酶体-蛋白 水解和去泛素活性。或者，在测定时将10 UM PPi+BTS添加至在没有PPi的情况下保存的 精液（"添加PPi"处理）。作为阴性对照，在测定前将10uM MG132(蛋白酶体抑制剂）添 加至精子样品。
[0068] 将有和没有lOiiM PPi的情况下在BTS中保存的精子上样至96孔黑板（最 终精子浓度1 x 106个精子/ml)，并在37. 5 °C与Z-LLE-AMC (对MG132不敏感的20S 糜蛋白酶样肽基-谷氨酰肽水解[PGPH]活性的特异性底物，最终浓度100iiM;Enz 〇 Life Sciences, Plymouth, PA)、Z-LLVY-AMC (20S蛋白酶体和其它糜蛋白酶样蛋白酶 以及钙激活中性蛋白酶的特异性底物；最终浓度l〇〇yM;Enzo)、Z-LLL-AMC(对蛋 白酶体抑制剂MG 13 2敏感的2 0 S糜蛋白酶样活性的特异性底物；最终浓度10 0 y M; BostonBiochem, Cambridge, MA)或泛素-AMC (泛素-C-末端水解酶活性的特异性底物；最 终浓度luM;EnZ〇)孵育lh。荧光蛋白酶体核心底物由偶联至荧光探针氨基甲基香豆素 (AMC)的小肽（LLL/LLE/LLVY)构成。完整的AMC-偶联底物不发射荧光。在适当的20S核 心活性存在的情况时，AMC分子被裂解下来，并变为荧光。每10min测量这种发射的荧光， 持续lh期限，得到相对突光（无单位）的曲线。使用380nm激发和460nm发射通过Thermo Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific)测量突光强度。
[0069] 图6A至6D显示PPi对储存的公猪精子的蛋白酶体酶活性的影响。如图6A中显 示，与其它处理相比，在第3天的添加PPi处理（392. 1的相对荧光；无单位）和在第10天 的PPi+BTS(388的相对荧光）中测量到较高的糜蛋白酶样PGPH活性（Z-LLE-AMC底物） (363. 1-386. 1 ;p〈0. 05)。如图6B中显示，糜蛋白酶样蛋白酶体核心活性（Z-LLVY-AMC底 物）在所有组中测量过程中逐渐增加，并且与对照组相比，用这种底物的PPi+BTS和添加 PPi处理显示较高的荧光强度（110. 8-121. 5vs. 85. 7 ;p〈0. 05)。在10min在添加PPi中观 察到最高荧光强度，但强度在测量过程中渐进降低，并且糜蛋白酶样活性在处理之间没有 显示差异（图6C)。相反，与其它处理相比，在第10天在PPi+BTS处理中观察到较高的去泛 素活性（泛素-AMC) (138. 9vs. 98. 4-122. 7的相对荧光；图6D)。如预期，在用蛋白酶体抑 制剂MG132处理的精子中检测到低糜蛋白酶样活性。总体而言，补充PPi增加了精子中的 蛋白酶蛋白水解和去泛素活性，并且在精子保存过程中显示有益效果。
[0070] 实施例9
[0071] PPi增强延长储存之后受精过程中的精子-透明带穿透和受精能力。
[0072]图7A至7F和图8A至8E说明PPi对猪IVF过程中的总受精和多精子受精的影响 (图7A至7F)，和PPi对精子-透明带结合的影响（图8A-8E)。猪卵母细胞在不同浓度的 PPi存在的情况下受精（图7A)。总受精和多精子受精率随着PPi的渐增浓度显著和渐进增 加（最多达10 U MPPi) (p〈0. 05)。在添加10 y M PPi之后观察到最高的多精受精（84. 9% 多精受精；图7B)。结合至ZP的精子的平均数目略微下降，但不随着PPi的渐增浓度显著 下降（图8A)。然而，与0-15iiM PPi相比，在20iiM PPi存在的情况下，顶体反应的精子的 百分比显著较高（P〈〇. 05,图8B)。由于授精剂量的降低在AI设置中是所需的，所以猪卵母 细胞也在有和没有10 UM PPi的情况下用降低的精子浓度授精。一致地，总受精和多精子 受精的百分比在1、2和5X 105个精子/ml时被PPi增强；PPi诱导的增加在5X 105个精子 /ml浓度是统计学显著的（图7C)。为了确定PPi-补充的BTS延长剂中的精子储存是否对 精子受精能力具有有益效果，将新鲜射精的公猪精子有或没有10 UM PPi的情况下储存在 BTS中3-4天，并在存在或不存在10 y M PPi的情况下用于IVF。在TBM中不存在PPi的情 况下，受精率较高，并且多精受精率在IVF过程中添加PPi的所有处理中最高（图7D ;第二 列）。然而，当用于没有PPi添加（图7D ;第三列）或IVF介质中具有PPi (图7D ;第四列） 的IVF时，使用以BTS中10 y M PPi保存的精子观察到最高的组合（单精子+多精子）受 精率。总之，PPi对精子保存和精子受精能力的统计学显著的（p〈〇.05)有益效果。
[0073] 用纯化PPA1的形式的外在无机焦磷酸酶进行对照实验以耗竭精子PPi。为了使精 子源性PPA1丧失能力，在抗PPA1抗体存在的情况下使猪卵母细胞受精。通过Western印 迹确立两种试剂的特异性（参见图3)。PPA和抗PPA1抗体两者都以剂量依赖的方式降低 受精率（图7E&F)。当受精过程中用正常血清替代抗PPA1抗体时，观察到受精率没有显著 性差异（图7F)。
[0074] 为了评估精子储存介质之间的可能变化，在10UM PPi存在的情况下将公猪精子 批次保存在商售BTS (BTS-MV, MV Technologies, L' Aigle, France)或自制BTS (BTS-HM) (Pursel等人，J Anim Sci 40:99-102,1975)中7天。与所有其它组相比，在第6天 在BTS-MV+10iiM PPi中发现较高的精子活动性（图8C)。添加至IVF介质中的过量 PPi (100-500 iiM PPi)以剂量依赖的方式降低受精率（图8D)。在独立试验中，将公猪精子 储存在具有10 U M PPi的BTS-MV中3天，并用于IVF。与BTS-MV中没有PPi的低于70% 受精相比，使用以10 UM PPi保存的精子观察到接近100%受精（图8E)。
[0075] 实施例10
[0076] 统计分析
[0077] 在完全随机设计中使用SAS软件包实施方差分析（AN0VA)分析。使用Duncan氏 多范围检验来比较当F值显著（p〈0. 05)时的个体处理的数值。
[0078] 尽管本发明已经结合其具体实施方案进行描述，但可以理解，本发明的设计能够 进行进一步修改。本专利申请旨在覆盖本发明的任何变化、用途或修改，所述变化、用途或 修改通常遵循本发明的原理，包括如在本发明所属领域内已知或习惯的实施内容范围内且 可适用于本文前面记载的基本特征的与本公开内容不同的内容。
【权利要求】
1. 包含无机焦磷酸盐（PPi)的精子保存介质。
2. 权利要求1的精子保存介质，其中PPi的浓度为约1 U M至约200 y M。
3. 权利要求1的精子保存介质，其中PPi的浓度为约1 U M至约20 y M。
4. 权利要求1的精子保存介质，其中PPi的浓度为约10 U M。
5. 权利要求1的精子保存介质，其中所述保存介质用于保存来自猪的精子。
6. 包含无机焦磷酸盐（PPi)的精子处理介质。
7. 权利要求6的介质，其中PPi的浓度为约1 y M至约200 y M。
8. 权利要求6的介质，其中PPi的浓度为约1 y M至约20 y M。
9. 包含无机焦磷酸盐（PPi)的用于体外受精（IVF)或人工授精（AI)的介质。
10. 权利要求9的介质，其中PPi的浓度为约1 ii M至约200 ii M。
11. 权利要求9的介质，其中PPi的浓度为约liiM至约20 yM。
12. -种精液性别鉴定方法，包括： (a) 在洗脱介质的帮助下将第一培养介质中的混合的精子悬浮液分为具有x或具有y 的精子的群体； (b) 在第二培养介质中保存具有x或具有y的精子， 其中，将无机焦磷酸盐（PPi)添加至第一培养介质、洗脱介质或第二培养介质中。
13. -种保存精子的方法，包括在包含无机焦磷酸盐（PPi)的介质中储存精子。
14. 权利要求13的方法，其中PPi的浓度为约1 y M至约200 y M。
15. 权利要求13的方法，其中PPi的浓度为约1 y M至约20 y M。
16. 权利要求13的方法，其中PPi的浓度为约10 ii M。
17. 权利要求13的方法，其中将所述精子在所述包含PPi的介质中储存最多达10天。
18. -种体外受精（IVF)方法，所述方法包括在无机焦磷酸盐（PPi)存在的情况下将卵 母细胞与精子接触。
19. 权利要求18的方法，其中PPi的浓度为约1 ii M至约200 ii M。
20. 权利要求19的方法，其中PPi的浓度为约1 y M至约20 y M。
21. 权利要求18的方法，其中在PPi存在的情况下储存精子。
22. -种培养胚胎的方法，包括在包含无机焦磷酸盐的介质中培养胚胎。
23. -种人工授精的方法，包括将精子和无机焦磷酸盐（PPi)提供至雌性的生殖道。
24. 权利要求23的方法，其中将所述PPi逐渐释放到雌性的生殖道。
25. -种体外成熟卵母细胞的方法，包括在包含无机焦磷酸盐的介质中培养卵母细胞。
【文档编号】A61D19/04GK104394689SQ201280069434
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2012年12月7日 优先权日:2011年12月9日
【发明者】P·索托维斯基, 李映周 申请人:密苏里大学管理者