专利名称：一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物组培方法，属于生物技术领域，具体地说是一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法。
背景技术：
苯蓝{Brassica oleraces var.carlorapa),又名球莖甘蓝、擘蓝等。据营养学家分析，每500g苯蓝中含蛋白质5.9g、糖llg、粗纤维4.lg、灰分3.3g、.丐81mg、磷122mg、铁1.lmg、胡萝卜素微量、硫胺素0.19mg、核黄素0.07mg、尼克酸1.5mg、维生素C 152mg。苤蓝维生素含量十分丰富，尤其是鲜品绞汁服用，对胃病有治疗作；其所含的维生素C等招牌营养素，有止痛生肌的作用，能促进胃与十二指肠溃疡的愈合；其所含大量水分和膳食纤维，可宽肠通便，防治便秘，排除毒素；苤蓝还含有丰富的维生素E，有增强人体免疫功能的作用；所含微量元素钥，能抑制亚硝酸胺的合成，因而具有一定的防癌抗癌作用。最近有报道苤蓝提取物具有抗菌和抗氧化的作用，目前，苤蓝的种苗繁育有播种育苗和扦插育苗两种方法。但是，苤蓝未熟抽薹问题严重，往往造成重大损失或严重影响商品质量，所以目前并未实现大规模的人工栽培。组织培养是植物细胞组织培养是指在离体条件下利用人工培养基对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。由于组织培养法繁殖作物的突出特点是快速，因此，对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”作物品种的繁殖意义更大。组织培养技术在药用植物上已经得到了大量应用，它具有外植体来源广泛、繁殖系数高等优点，在短时间内便可获得大量优质种苗。所以组织培养及再生体系的建立对于缓解苤蓝资源开发利用与保护之间的矛盾有着重要意义。到目前为止，国内外关于苤蓝组织培养方面的研究鲜见报道，本技术通过对培养基组分、激素配比及环境因子的确定，建立了苤蓝完整的再生体系，为苤蓝的大规模快繁及其遗传转化研究奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法，是以苤蓝叶片为外植体，经过消毒处理后，接种于诱导愈伤培养基上，待愈伤形成后，再接入分化培养基，诱导芽的形成，之后接入生根培养基，幼苗的根生长到一定程度时，进行炼苗与移栽即可；由于苤蓝未熟抽薹问题严重，往往造成重大损失或严重影响商品质量，采用本发明植物组织培养法外植体来源广泛、繁殖系数高短时间内便可获得大量优质种苗，解决传统种植方法出现的早抽薹现象。为实现上述目的，本发明所述一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法，其特征在于:
一、将新鲜苤蓝叶片用洗洁精仔细擦洗表 面，流动水冲洗10min，75%乙醇消毒30s，0.1 0.2%升汞消毒5 12min并加2 4滴吐温80，再用含有0.2%的Na2S2O3无菌水清洗3 5遍；
二、将消毒后的苤蓝叶片切成小块作为外植体，接种于基础培养基MS+3%蔗糖+NAA
0.05 3.0mg/L+6-BA0.01 2.0mg/L+2.4-D 0.01 2.0mg/L 进行愈伤诱导，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕榈酸酯作为抗褐化剂；
三、愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基为基础培养基MS+NAA0.05 3.0mg/L+IBA 0.05 3.0mg/L+6-BA 0.01 2.0mg/L,或基础培养基 B5+TDZ 0.005 2.0mg/L+GA3 0.05 1.0mg/L诱导芽形成及丛芽的增殖；
四、生根培养基选用基础培养基B5+0.05 3.0mg/L ΝΑΑ+0.05 3.0mg/L IBA ；
五、当幼苗的根长到2 3cm，幼苗形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以石英砂:草炭土:腐殖质为基质，在温度20 25°C，湿度60 80%的条件下炼苗5 30天，炼苗后，将幼苗移栽入大田即可。所述苤蓝的叶片切块大小为0.8 1.2cm2 ；
所述苤蓝叶片在9 20°C，1500 2500Lux，20 60天愈伤诱导率40 60%，可利用愈伤为20 30% ；
所述愈伤出芽在9 20°C，1500 3000Lux，20 60天，出芽率20 40% ；
所述丛芽增殖繁殖比1: 15 25 ;
所述单苗高23cm，47片叶在19 24°C，2000 3000Lux，830天生长出58条根长I 2cm白根，生根率90 100% ；
所述基质石英砂:草炭土:腐殖质为1:1:1。
本发明所述的一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法，其有益效果在于:在本发明中，分别选用聚丙三醇棕榈酸酯和Na2S2O3作抗褐化剂，有效的解决了苤蓝在生长过程中易未熟抽薹，造成重大损失或严重影响商品质量的问题，以及愈伤诱导过程中的褐化现象，在出芽培养时使用NAA+IBA+6-BA或TDZ+GA3的组合使出芽和扩繁率有所提高，并且炼苗采用石英砂+腐殖植+草炭土为基质，不仅通气、保水性好，又有充足的营养，充分满足苤蓝幼苗生长需求，使成活率达到95%。
具体实施例方式以下实施例为本发明作进一步出阐述。实施例1
一、将苤蓝新鲜叶片用洗洁精仔细擦洗表面，流动水冲洗10min，75%乙醇消毒30s，
0.2%升汞消毒5min并加2滴吐温80，再用含有0.2%的Na2S2O3无菌水清洗3遍；
二、将消毒后的苤蓝其叶片切成0.Scm2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为 MS+3% 蔗糖 +NAA1.0mg/L+6-BAl.0mg/L+2.4-D 0.01mg/L 的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕榈酸酯作为抗褐化剂；苤蓝叶片在9°C，1500Lux,60天愈伤诱导率40%，可利用愈伤为20% ；
三、愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为MS+NAA1.0mg/L+IBA 1.0mg/L+6-BA 0.05mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1:25，愈伤出芽在9°C，1500Lux，60 天， 出芽率 20% ；四、待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养基选用1/2MS培养基+0.005mg/11^六，单苗高2011，4片叶在19°C，2000Lux，8天生长出5条根长I 2cm白根，生根率90%;
五、当幼苗的根长到Icm时，幼苗长出4片叶形体己显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别石英砂:草炭土:腐殖质为1:1:1基质，在温度20°C，湿度60%的条件下炼苗10天，炼苗后，将幼苗移栽入大田即可。实施例2
一、将苤蓝新鲜叶片用洗衣粉仔细擦洗表面，流动水冲洗10min，75%乙醇消毒30s，
0.1%升汞消毒7min并加3滴吐温80，再用含有0.2%的Na2S2O3无菌水清洗4遍；
二、将消毒后的苤蓝其叶片切成1.0m2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为 MS+3% 蔗糖 +NAA 0.05mg / L+6-BA 1.0mg/L+2.4-D 0.05mg/L 的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕榈酸酯作为抗褐化剂，苤蓝叶片在12°C，1800Lux,40天愈伤诱导率45%，利用愈伤23% ；
三、愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为B5+NAA0.05mg/L+IBA 1.0mg/L+6-BA 0.05mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1:18，愈伤出芽在12°C，1800Lux，40 天，出芽率 22% ；
四、待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养基选用1/2MS培养基+1.0mg/LIBA,单苗高3cm，5片叶在19°C，2000Lux，15天生长出6条根长I 2cm白根，生根率92% ；
五、当幼苗的根长到2cm，幼苗长出5片叶形体己显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以石英砂:草炭土:腐殖质为1:1:1为基质，在温度22°C，湿度70%的条件下炼苗8天，炼苗后，将幼苗移栽入大田即可。实施例3
一、将苤蓝新鲜叶片用洗洁精仔细擦洗表面，流动水冲洗10min，75%乙醇消毒30s，
0.15%升汞消毒5min并加2滴吐温80，再用含有0.2%的Na2S2O3无菌水清洗4遍；
二、将消毒后的苤蓝其叶片切成1.2m2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为 B5+3% 蔗糖 +NAA 2.0mg/L+6-BA 0.05mg/L+2.4-D 0.08mg/L 的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕榈酸酯作为抗褐化剂，苤蓝叶片在15°C，2000Lux，30天愈伤诱导率50%，可利用愈伤为25% ；
三、愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为B5+NAA2.0mg/L+IBA 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1:20，愈伤出芽在15°C，2000Lux，40 天，出芽率 30% ；
四、待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养 基选用B5培养基+2.0mg/L IBA，单苗高2.5cm，6片叶在19°C，2000Lux，18天生长出7条根长I 2cm白根，生根率95% ；
五、当幼苗的根长到2cm，幼苗长出5片叶形体己显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以石英砂:草炭土:腐殖质为1:1:1为基质，在温度25°C，湿度75%的条件下炼苗20天，炼苗后，将幼苗移栽入大田即可。
权利要求
1.一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法，其特征在于: ①将新鲜苤蓝叶片用洗洁精仔细擦洗表面，流动水冲洗10min，75%乙醇消毒30s，0.1 0.2%升汞消毒5 12min并加2 4滴吐温80，再用含有0.2%的Na2S2O3无菌水清洗3 5遍； ②将消毒后的苤蓝叶片切成小块作为外植体，接种于基础培养基MS+3%蔗糖+NAA0.05 3.0mg/L+6-BA0.01 2.0mg/L+2.4-D 0.01 2.0mg/L 进行愈伤诱导，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2%聚丙三醇棕榈酸酯作为抗褐化剂； ③愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基为基础培养基MS+NAA0.05 3.0mg/L+IBA 0.05 3.0mg/L+6-BA 0.01 2.0mg/L,或基础培养基 B5+TDZ 0.005 2.0mg/L+GA3 0.05 1.0mg/L诱导芽形成及丛芽的增殖； ④生根培养基选用基础培养基B5+0.05 3.0mg/L ΝΑΑ+0.05 3.0mg/L IBA ； ⑤当幼苗的根长到2 3cm，幼苗形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以石英砂:草炭土:腐殖质为基质，在温度20 25°C，湿度60 80%的条件下炼苗5 30天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土，视幼苗长势移入大田即可。
2.如权利要求1所述一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法，其特征在于:所述苤蓝的叶片切块大小为0.8 1.2cm2。
3.如权利要求1所述一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法，其特征在于:所述苤蓝叶片生长环境为9 20°C，1500 2500Lux。
4.如权利要求1所述一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法，其特征在于:所述基质石英砂:草炭土:腐殖质为1 :1:1。
全文摘要
本发明公开一种用生物组织培养法制备苤蓝的方法，涉及一种植物组培方法，属于生物技术领域。其特征在于是以苤蓝叶片为外植体，经过消毒处理后，接种于诱导愈伤培养基上，待愈伤形成后，再接入分化培养基，诱导芽的形成，之后接入生根培养基，幼苗的根生长到一定程度时，进行炼苗与移栽。其有益效果在于在本发明中，分别选用聚丙三醇棕榈酸酯和Na2S203作抗褐化剂，有效的解决了苤蓝在生长过程中易未熟抽薹，造成重大损失或严重影响商品质量的问题。
文档编号A01H4/00GK103141386SQ20131006416
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者康建国 申请人:康建国