一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基；⑵制备种子培养基；⑶制备发酵培养基；⑷杯珊瑚菌菌丝接种至马铃薯葡萄糖斜面培养基，经恒温培养得菌丝体；⑸菌丝体接种至种子培养基，经振荡培养得菌种种子液；⑹菌种种子液接种至发酵培养基，经振荡培养得发酵液；发酵液离心、洗涤、烘干、磨粉后，得到菌丝体干粉末；⑺菌丝体干粉末先超声提取再浸提得到多糖浸提液；⑻多糖浸提液离心、过滤、浓缩后得到多糖浓缩液；⑼多糖浓缩液加Sevag试剂离心后得多糖提取液；⑽多糖提取液脱色后得多糖流出液；⑾多糖流出液加乙醇静置，得沉淀物；⑿离心干燥即得多糖干品。本发明操作简单，成本低，多糖得率高。
【专利说明】一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及真菌多糖【技术领域】，尤其涉及一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法。
【背景技术】
[0002]陇南康县地处西秦岭南侧陇南山中，最高海拔2483m，最低海拔560m，垂直高差较大，具有明显的立体气候特点。复杂的地形、气候环境，造就了该地区亚热带向暖温带过渡气候，温和湿润，雨量充沛，自然资源十分丰富，拥有高等植物172科1000余种，活立木蓄积量800多万立方米，森林覆盖率高达60%以上，国家和省列珍贵树种28种，天麻、杜仲等野生药材576种，各种菌类96种，尤其是大型真菌中的珊瑚菌类。杯珊瑚菌，别名杯冠瑚菌，属非褶菌目、珊瑚菌科、杯珊瑚菌属，近白色或淡黄色、浅粉红色，柄纤细，顶端杯状。在我国主要分布于吉林、河北、河南、湖南、福建、陕西、四川、甘肃等省。杯珊瑚菌是我国珍贵的野生食用菌资源，具有很高的营养和药用价值。杯珊瑚菌多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、增强免疫功能等多种生理活性。目前对杯珊瑚菌多糖的提取研究领域基本空白。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、成本低、多糖得率高的杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法。
[0004]为解决上述问题，本发明所述的一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg琼脂，使其pH值为6.0-8.0,在9(Tl00°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121 °C的条件下灭菌20min即得；
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在9(T10(TC温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得；
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在90-100C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得；
⑷真菌的发酵培养:接一环杯珊瑚菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养4-10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体；
(5)接一环所述活化培养后的菌丝体至装有IOmL所述种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以10(T200 r/min的速率进行振荡培养4~10天，制得pH值为5.0-7.0的菌种种子液；(6)将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以10(T200 r/min的速率进行振荡培养4-1Ο天，即得发酵液；所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；所述菌丝体用蒸懼水洗涤后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末；所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10-30% ；
⑴在所述菌丝体干粉末中按I g:10 mL~30mL的料液比加入去离子水，在功率为10(T300W的条件下超声提取1(T30 min后，在温度为8(T95°C的条件下浸提次数I~3次，每次llh，合并提取液，得到多糖浸提液；
⑶将所述多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心l(T20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为60°C、真空度为0.06、.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5~1/3，得到多糖浓缩液；
⑶在所述多糖浓缩液中按其体积的1/4加入Sevag试剂,充分混合搅拌20min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到所述上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液；
(10)将50-l00mL所述多糖提取液以2~5 mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床进行脱色，得到多糖流出液；
(11)在所述多糖流出液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A ;
(12)将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r / min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0005]所述步骤⑷中杯珊瑚菌菌丝是指采集于陇南康县的杯珊瑚菌Artomycespyxidatus KX320SH按常规方法经组织分离获得的杯珊瑚菌菌丝；所述杯珊瑚菌Artomyces pyxidatus KX320SH在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2012112 (保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086388。
[0006]所述步骤⑶中Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL: ImL混合而成的混合液。
[0007]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用超声波辅助热水浸提法取代以往的单独水提，利用超声波空化产生的极大压力和刺激效应，加速了有效成分的释放、扩散及溶解，具有操作简单、提取效率高、时间短、不易破坏多糖的立体结构且多糖得率高等优点。
[0008]2、本发明整个过程中无需试剂和化学反应，不但设备简单，可操作性强，而且成本低。
【具体实施方式】
[0009]实施例1 一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5g葡萄糖和5g琼脂，使其pH值为6.0-8.0，在90°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0010]⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0,在90°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0011]⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0,在90°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0012]⑷真菌的发酵培养:接一环杯珊瑚菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养4天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体。
[0013]其中:杯珊瑚菌菌丝是指采集于陇南康县的杯珊瑚菌pyxidatusKX320SH按常规方法经组织分离获得的杯珊瑚菌菌丝；杯珊瑚菌pyxidatusKX320SH在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012112 (保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086388。
[0014](5)接一环活化培养后的菌丝体至装有IOmL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以100 r/min的速率进行振荡培养4天，制得pH值为5.0-7.0的菌种种子液。
[0015](6)将菌种种子液按`5%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以100 r/min的速率进行振荡培养4天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；菌丝体用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
[0016]其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为10%。
[0017](7)在菌丝体干粉末中按I g:10 mL的料液比加入去离子水，在功率为100W的条件下超声提取30 min后，在温度为80°C的条件下浸提次数I次，每次lh，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0018]⑶将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心IOmin过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为60°C、真空度为0.06MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5，得到多糖浓缩液。
[0019]⑶在多糖浓缩液中按其体积的1/4加入Sevag试剂,充分混合搅拌20min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液；
其中:Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL =ImL混合而成的混合液。
[0020](IQ)将50 mL多糖提取液以2 mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床进行脱色，得到多糖流出液。
[0021]该多糖流出液用紫外分光光度计在460 nm波长测量其比色值，并按下式计算脱水率:脱色率=[(脱色后的透色比-脱色前的透色比)/脱色后的透色比]*100%。
[0022](11)在多糖流出液中按其体积的2倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A。
[0023](12)将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0024]采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并按下式计算:
粗多糖含量(mg/g菌丝干重)=粗多糖总质量(mg)/菌丝体干粉末质量(g)。
[0025]实施例2 —种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入IOg葡萄糖和IOg琼脂，使其PH值为6.0-8.0，在100°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0026]⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入10g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在100°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0027]⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入10g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在100°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0028]⑷真菌的发酵培养:接一环杯珊瑚菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28 V恒温培养10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体。
[0029]其中:杯珊瑚菌菌丝同实施例1。
[0030](5)接一环活化培养后的菌丝体至装有IOmL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以200 r/min的速率进行振荡培养10天，制得pH值为5.0-7.0的菌种种子液。
[0031](6)将菌种种子液按20%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以200 r/min的速率进行振荡培养10天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；菌丝体用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
[0032]其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为30%。
[0033](7)在菌丝体干粉末中按1 g:30mL的料液比加入去离子水，在功率为300W的条件下超声提取10 min后，在温度为95°C的条件下浸提次数3次，每次3h，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0034]⑶将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为60°C、真空度为0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/3，得到多糖浓缩液。
[0035]⑶在多糖浓缩液中按其体积的1/4加入Sevag试剂,充分混合搅拌20min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
[0036]其中:Sevag试剂同实施例1。
[0037](IQ)将100 mL多糖提取液以5 mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床进行脱色，得到多糖流出液。
[0038]该多糖流出液用紫外分光光度计在460 nm波长测量其比色值，并按实施例1中的公式计算脱水率。
[0039](11)在多糖流出液中按其体积的4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A。
[0040](12)将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0041]采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并按实施例1中的公式计算。
[0042]实施例3 —种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g琼脂，使其pH值为6.0-8.0，在95°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0043]⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B 补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0,在95°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0044]⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0,在95°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0045]⑷真菌的发酵培养:接一环杯珊瑚菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28 V恒温培养7天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体。
[0046]其中:杯珊瑚菌菌丝同实施例1。
[0047](5)接一环活化培养后的菌丝体至装有IOmL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以150 r/min的速率进行振荡培养7天，制得pH值为5.0-7.0的菌种种子液。
[0048](6)将菌种种子液按12%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以150 r/min的速率进行振荡培养7天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；菌丝体用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
[0049]其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为20%。
[0050](7)在菌丝体干粉末中按I g:20mL的料液比加入去离子水，在功率为200W的条件下超声提取20 min后，在温度为8(T95°C的条件下浸提次数2次，每次2h，合并提取液，得到多糖浸提液。[0051]⑶将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心15min过滤后,得到上清液A，该上清液A在温度为60°C、真空度为0.07MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/4，得到多糖浓缩液。
[0052]⑶在多糖浓缩液中按其体积的1/4加入Sevag试剂,充分混合搅拌20min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
[0053]其中:Sevag试剂同实施例1。
[0054](IQ)将75 mL多糖提取液以3.5 mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床进行脱色，得到多糖流出液。
[0055]该多糖流出液用紫外分光光度计在460 nm波长测量其比色值，并按实施例1中的公式计算脱水率。
[0056](11)在多糖流出液中按其体积的3倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A。
[0057](12)将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心20 min后,得到沉淀物B,
该沉淀物B置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
[0058]采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并按实施例1中的公式计算。
【权利要求】
1.一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤: ⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg琼脂，使其pH值为6.0-8.0,在9(Tl00°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121 °C的条件下灭菌20min即得； ⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在9(T10(TC温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得； ⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在9(T10(TC温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得； ⑷真菌的发酵培养:接一环杯珊瑚菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养5-10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体； (5)接一环所述活化培养后的菌丝体至装有IOmL所述种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以10(T200 r/min的速率进行振荡培养4~10天，制得pH值为5.0-7.0的菌种种子液； (6)将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以10(T200 r/min的速率进行振荡培养5-1Ο天，即得发酵液；所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；所述菌丝体用蒸懼水洗涤后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末；所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10-30% ； ⑴在所述菌丝体干粉末中按I g:10 mL~30mL的料液比加入去离子水，在功率为10(T300W的条件下超声提取1(T30 min后，在温度为8(T95°C的条件下浸提次数I~3次，每次llh，合并提取液，得到多糖浸提液； ⑶将所述多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心l(T20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为60°C、真空度为0.06、.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5~1/3，得到多糖浓缩液； ⑶在所述多糖浓缩液中按其体积的1/4加入Sevag试剂,充分混合搅拌20min,再用高速冷冻离心机以5000 r/min离心20 min除掉变性蛋白质,弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到所述上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液； (10)将5(Tl00mL所述多糖提取液以2~5 mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床进行脱色，得到多糖流出液； (11)在所述多糖流出液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A; (12)将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r / min离心20 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得多糖干品。
2.如权利要求1所述的一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，其特征在于:所述步骤⑷中杯珊瑚菌菌丝是指采集于陇南康县的杯珊瑚菌Artomyces pyxidatus KX320SH按常规方法经组织分离获得的杯珊瑚菌菌丝；所述杯珊瑚菌Ario焊cm pyxidatus KX320SH在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012112，其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086388。
3.如权利要求1所述的一种杯珊瑚菌菌丝多糖的提取方法，其特征在于:所述步骤⑶中Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL:lmL混`合而成的混合液。
【文档编号】A01G1/04GK103554286SQ201310480672
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】陈朋, 严晓娟, 梁宁, 胡先望 申请人:甘肃省商业科技研究所