一种用于防治苹果树腐烂病的糖丝菌及其制备方法
【专利摘要】一种用于防治苹果树腐烂病的糖丝菌及其制备方法，本发明公开了一种杨凌糖丝菌（Saccharothrix?yanglingensis）的Hhs.015菌株，保藏编号为CGMCC?No.3023。杨凌糖丝菌（Saccharothrix?yanglingensis）Hhs.015菌株分泌的抗菌活性物质主要为抗生素物质，具有效果持久、植物不会产生药害等特点，对苹果树腐烂病具有显著的防治效果并有一定的促生作用。
【专利说明】一种用于防治苹果树腐烂病的糖丝菌及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物农药【技术领域】，具体涉及一种糖丝菌、其微生物制剂以及将其应用于防治苹果树腐烂病的病害。
【背景技术】 [0002]由于化学农药的长期使用，使植物病害存在对杀菌剂的适应性变异，在某些杀菌剂的长期选择压力下，可以产生明显的抗药性，从而导致化学防治的失败。生产中应综合地考虑不同杀菌剂的应用策略，以充分发挥各种杀菌剂的作用，尽量避免抗药性的产生。放线菌是一种常见的拮抗微生物，有助于开发和利用这类微生物资源。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。内生放线菌指存在于健康植物体内，产生系列活性物质并能与宿主植物共同生活的放线菌。它们的代谢活动及产物可促进宿主植物适应外界各种(生物、非生物)环境压力，维持生态系平衡。
[0003]苹果是我国的重要经济作物和出口水果，栽培面积和产量均居世界首位。然而，病害却严重制约着我国苹果产业的发展，特别是苹果树腐烂病在我国分布广、危害重、防治难，果农将其称之为苹果树“癌症”。
[0004]目前苹果树腐烂病的防治方法主要有物理防治和化学防治。化学农药的大量使用造成严重的环境污染，农产品的农药残留，病菌抗药性、耐药性。这些问题已对人们的生活产生了严重影响，而生物防治可以最大限度地减少化学农药的用量，以改善生态环境。农用抗生素作为生物农药中的重要类群，较其它生物农药具有更高效、快速、安全等优点，且均在农作物病虫害防治工作中发挥着重要作用。
[0005]但是，目前我国生物农药的市场占有率仅有2%~3%，其潜力远没有得到充分的开发和应用。目前国内尚无利用拮抗菌防治苹果树腐烂病的生防制剂。
【发明内容】
[0006]鉴于现有技术的不足，本发明的目的旨在于探寻生物农药的新来源，利用内生微生物资源而开发一种可以用于苹果树腐烂病害防治的高效、可产业化生产的生防菌菌株。本发明提供了一种杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株以及该菌株的筛选、鉴定方法；进一步地，提供该菌株发酵工艺及抗菌活性物质制备工艺，以及提供该菌株抗菌活性物质防治苹果树腐烂病的应用。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0008]本发明所述的杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株分离自温室大棚内黄瓜根部组织中，经形态特征、培养特性、生理生化特性、细胞壁组分分析和16S rDNA同源性序列分析，确定该菌株为杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015。具有以下特征:
[0009]1、菌株在高氏一号培养基上基内菌丝杏黄色，气生菌丝浅粉色，不产生可溶性色素；[0010]2、基生菌丝细长，舒展，发达；多分枝，无隔。气生菌丝细密柔曲，顶部螺旋状，生长不旺盛，易断裂。培养后期，气生菌丝成熟，分化成孢子链，少螺旋，松散；
[0011]3、生理生化反应表现为:不能使牛奶凝固，也不能胨化，可使石蕊牛奶变红；可水解淀粉；产卵磷脂酶；不产生硫化氢；产生黑色素；不能使明胶水解；产生纤维素酶；能还原硝酸盐。生长温度15~37 °C，最适生长温度为28 0C ；能利用糊精、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、半乳糖、麦芽糖、甘油、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、肌醇、木糖、山梨醇；不能利用甘露糖、马尿酸钠、棉子糖。能以甘氨酸、丙氨酸、色氨酸为氮源；不能利用赖氨酸、L-半胱氨酸、胱氨酸、瓜氨酸、尿素、D, L-酪氨酸、天门冬氨酸；
[0012]4、16S rDNA序列分析结果在GeneBank中进行最大同源性比较,发现16S rDNA测序结果与糖丝菌属16s rDNA序列同源性最大达到99%。
[0013]本发明所述的杨凌糖丝菌(Saccharothrixyanglingensis)Hhs.015 已于 2009 年04月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.3023。保藏期限30年，30年内免费提供活菌。
[0014]本发明所制备的微生物制剂含有保藏编号为CGMCC N0.3023的杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015 的代谢产物。
[0015]制备具有保藏编号为CGMCC N0.3023的杨凌糖丝菌(Saccharothrixyanglingensis) Hhs.015的微生物制剂方法如下:
[0016]将-80 °C保藏的保藏编号为CGMCC N0.3023的杨凌糖丝菌(Saccharothrixyanglingensis)Hhs.015菌株接种在高氏一号培养基上,于28°C培养4天后,将其单菌落接种到IOOmL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养48小时，然后按照1%的种子液接种到IOOmL的黄豆粉培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养120小时，所得发酵液经5000rpm离心20min，取上清液即为无菌培养滤液。
[0017]根据试验结果表明，以本发明保藏编号为CGMCC N0.3023的杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015制备的微生物制剂对苹果树腐烂病害有良好防治作用，并且对油菜菌核病、番茄灰霉病等也有较好的防治效果，具备了工业化生产的基本性状。
[0018]需要说明的是，对本发明的抗菌活性物质成分进行分析，包括通过硅胶柱、凝胶柱和反向柱技术所得，鉴定为抗生素类。
[0019]本发明有益效果在于，具有稳定的天然原料来源，菌种来源于植物内部，筛选方法简单；发酵过程中所用原料主要有大豆粉和葡萄糖，成本较低；抗菌活性物质制备简单，操作方便，产品质量稳定，对光、热、酸碱均有良好的稳定性。本物质对农作物无药害，绿色环保，防治苹果树腐烂病病害效果较好。
[0020]生物保藏信息说明:
[0021]分类命名:杨凌糖丝菌(Saccharothrixyanglingensis) Hhs.015 于 2009 年 04月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.3023。保藏期限30年，30年内免费提供活菌。【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制作用；
[0023]图2为本发明对苹果离体叶片接种处理后3天病斑扩展情况；
[0024]图3为本发明对苹果离体叶片接种处理后10天病斑扩展情况；
[0025]图4为本发明施药后各处理小区平均新生病疤数的周年消长情况；
[0026]图5为实施例2中刮斑并涂抹本发明后病疤的平均愈合宽度。
【具体实施方式】
[0027]下面将结合附图对本发明作进一步的描述。需要说明的是，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0028]需要说明的是，本发明杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015的分
离与鉴定:
[0029]黄瓜根采自陕西杨凌高新技术示范区蔬菜大棚，用自来水冲洗后展开晾干，取植株的根段样 品各称取Ig进行表面消毒，其中使用99%乙醇中浸Imin,然后在3.125%的NaOCl中浸6min,再次放入99%乙醇中浸30sec,最后用无菌生理盐水冲洗5次。将最后一次冲洗过的无菌水取200 UL涂在高氏一号平板上，用于检测表面消毒是否彻底。取消毒后的材料用无菌手术刀切成0.5X0.5_大小的薄片，将表面消毒后的黄瓜根薄片，置于含有高氏一号平板上，28±1°C培养箱中培养21d后统计放线菌菌落数并进行纯化，可分离到杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株,将所得菌株采用甘油法保藏于-80°C冰箱。
[0030]根据内生杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株对苹果树腐烂病的离体试验调查结果，筛选到一种高效防病的活性菌株，经菌落和形态的显微观察、细胞化学组成分析、常规生理生化特性实验、16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为的一个糖丝菌属菌株杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)。
[0031]根据上述所得的杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株制备其菌体的方法:
[0032]将一80°C保藏的杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015 菌株接种在高氏一号培养基上，28°C培养4d后，将其单菌落接种到IOOmL黄豆粉液体培养液中，于280C、150rpm黑暗振荡培养48小时，然后按照1%的种子液接种到IOOmL的黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养120小时，发酵液经5000rpm离心20min后，所得沉淀物即为杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株的菌体。
[0033]需要说明的是，所述的黄豆粉液体培养液由豆粉20g (沸水煮30min，过滤保留滤液)，蔗糖 10g，可溶性淀粉 5g，蛋白胨 2g，酵母膏 2g，NaC12g, CaCO3Ig, MgSO4 ? 7H200.5g，KH2PO40.5g，琼脂 15g，H2OlOOOmL 组成，且 pH 值为 7.2。
[0034]进一步地,本发明所述杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015菌株的抗菌活性物质的制备方法为:
[0035]将-80°C保藏的杨凌糖丝菌(Saccharothrixyanglingensis) Hhs.015 菌株接种在高氏一号培养基上，28°C培养4天后，将其单菌落接种到IOOmL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养48小时，然后按照1%的种子液接种到IOOmL的黄豆粉培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养120小时，所得菌液经5000rpm离心20min，取上清液即为
无菌培养滤液。
[0036]其中，所述黄豆粉培养液包括豆粉2%、葡萄糖2%、NaCl0.8%、CaCO30.2%、(NH4)2SO40.32%，起始 pH7.0。
[0037]将本发明所述的杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株活性物质进行分析，包括多种层析技术分离提纯，得到淡黄色粉末状纯品，经鉴定为抗生素类物质。
[0038]进一步地，如图1中的A、B、C、D所示，其中A为杨凌糖丝菌(Saccharothrixyanglingensis) Hhs.015琼脂块对苹果腐烂病菌的抑制作用；B是光镜下苹果腐烂病菌菌丝；C和D分别是用本发明处理后苹果腐烂病菌菌丝出现膨胀和原生质渗出。
[0039]如图2所示，离体叶片接种后，对照组发病快速、病斑扩展速度快，3天病斑直径达到20.3mm ;杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015发酵液原液处理组，发病缓慢，有的重复甚至不发病，3天后病斑直径仅4.23mm。
[0040]如图3所示，离体叶片接种后，对照组10天后病斑上出现大量孢子器；而杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015发酵液原液处理组没有产抱；苯醚甲环唑处理组，不产孢。
[0041]为了进一步描述本发明的效果，下面将结合具体实施例进行分析。
[0042]实施例1
[0043]杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株代谢活性物质对苹果树腐烂病的田间预防试验。
[0044]处理:发病对照(刮除病疤涂无菌水)；Hhs.015发酵液原液,5倍液涂树干；10%世高(苯醚甲环唑)水分散粒剂，500倍涂树干；45%代森铵水剂(施那宁)，500倍涂树干；43%好力克(戊唑醇)悬浮剂，1000倍涂树干。
[0045]选取小区进行试验，设三次重复，每重复小区至少有5个腐烂病斑，10棵树，病疤在调查以后都统一刮除，之后所有树体(无论有无病斑、新旧病斑)按处理进行中心干涂药统一涂至离地面2米高，大枝离分叉点0.4米。排列根据果园情况进行，其他管理措施按常规统一进行。
[0046]每个时间分别选取小区进行试验，在每个施药时间开始涂药，间隔15d，3次药后调查记录不同时期所选小区的新生病斑数，并统计预防效果。
[0047]如图4所示，在2010年4月、6月、9月及11月涂抹本发明发酵液，都能够明显减少新生病疤数的产生，且持效期长，I年之后的防效均稳定在50%以上，显著高于化学药剂戊唑醇、苯醚甲环唑及代森铵对照，其中2010年4月施用后，I年的防效高达74.42%。
[0048]实施例2
[0049]杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015菌株代谢活性物质对苹果树腐烂病的田间刮斑治疗试验。
[0050]处理:对照(刮除病疤涂无菌水);Hhs.015发酵液原液；10%世高(苯醚甲环唑)，100倍涂斑；45%代森铵水剂(代森铵)，100倍涂斑；海岛素(壳寡糖)，1000倍涂斑，43%好力克(戊唑醇)悬浮剂，200倍涂斑。[0051]采用刮除病斑法:每处理设三次重复，每重复7个病斑，施药前将病斑部位及其周边2cm处的健康部位用刀立刮刮至韧皮部，周围露出健康组织，然后用毛刷将搅拌均匀的处理药剂涂抹于伤口处及周围3cm范围内的健康树皮上，其他管理措施按常规统一进行。
[0052]4月刮除病斑后涂抹处理药剂，间隔15d涂抹I次，共涂药3次，分别在2个月、6个月、9个月后调查记录各处理病斑的愈和宽度及复发情况。
[0053]如图5所示了不同时间的调查结果，其中，壳寡糖处理组愈合效果最好，9个月后的愈合宽度达到8.5mm ;本发明发酵液原液效果次之，9个月的愈合宽度为6.54mm，高于化学药剂戊唑醇、苯醚甲环唑及代森铵对照。同时，病疤复发情况调查结果显示，施药9个月后，戊唑醇及壳寡糖处理组的复发率最低，相对防效达到77.42%;其次是苯醚甲环唑及本发明发酵液原液，相对防效为61.29%o
[0054]对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)的菌株Hhs.015,其特征在于,保藏编号为 CGMCC N0.3023。
2.一种根据权利要求1所述菌株的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂含有保藏编号 CGMCC N0.3023 的杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015 的代谢产物。
3.一种根据权利要求2所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，将_80°C保藏的保藏编号为 CGMCC N0.3023 的杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis) Hhs.015 菌株接种在高氏一号培养基上，于28°C培养4天后，将其单菌落接种到IOOmL黄豆粉液体培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养48小时，然后按照1%的种子液接种到IOOmL的黄豆粉培养液中，于28°C、150rpm黑暗振荡培养120小时，所得发酵液经5000rpm离心20min，取上清液即为无菌培养滤液。
4.以保藏编号为CGMCC N0.3023 的杨凌糖丝菌(Saccharothrix yanglingensis)Hhs.015菌株的代谢产品成份所制备的微生物制剂用于防治苹果树腐烂病的病害。
【文档编号】A01P3/00GK103667116SQ201310571781
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】黄丽丽, 颜霞, 高小宁, 涂璇, 李正鹏, 康振生 申请人:西北农林科技大学