一种基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂的方法
【专利摘要】一种基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂的方法。本发明公开了一种基因工程菌发酵提取海藻液尿素增效剂的方法，应用分子生物学手段提取光合菌、乳酸菌、放线菌中能使用海藻中不溶性大分子分解为可溶性小分子的遗传基因分子，与酵母菌细胞质连接重组DNA基因组，在大肠杆菌细胞中表达，构建出一株基因工程菌，提高了微生物的生物活性，增强了分解海藻大分子的能力。采用了高密度发酵工艺，提高了发酵强度，缩短了发酵时间。采用微滤膜和超滤膜分离技术，完整的保留了海藻中的生物活性物质和营养物质，使得海藻提取液与尿素结合成网络载肥体系，延缓尿素的分解，并为农作物提供多种养分，促进农作物的生长，达到尿素增效的目的。
【专利说明】一种基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到肥料增效剂的制备方法直接涉及到一种基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂的方法。
技术背景
[0002]目前我国农业普遍施肥量大，肥效利用率低，特别是以尿素为主的氮肥利用率在25%以下。大量氮肥分解挥发或随水流失又对生态环境造成污染。近二十几年来农业和肥料专家研究了包膜控释肥、抑制剂缓释肥、添加多肽肥、对抑制尿素分解延长肥效期，节省肥料起到积极作用，但普遍存在成本高、增加营养少等缺点。
[0003]海藻提取液极大地保留了天然活性组分，含有大量的非含氮有机物，陆地植物无法比拟的丰富的K、Ca、Mg、Zn、I等40多种矿物质和维生素，特别含有海藻中的海藻多糖、藻朊酸、高度不饱和脂肪酸和多种天然植物生长调节剂，具有很高的生物活性，可刺激植物体内非特异性因子的产生，调节内源激素平衡。在尿素中添加海藻提取液，在氢键的作用下，海藻提取物和尿素形成α-螺旋或高分子网络结构的载肥体，不仅能延缓尿素的分解，更重要的是为农作物提供多种养分，促进作物生长，因此说海藻提取液是当今最好的尿素增效剂。国内外曾采用化学水解法和菌群堆积发酵法。化学水解法严重破坏海藻内源物质的活性，营养成分损失严重；菌群堆积发酵法发酵时间长达10天左右，难以实现工业化生产，寻求一种高效简便易 行的海藻提取液的制备方法，是亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是提供一种高效、简便、完整保留海藻天然活性的海藻液提取方法。
[0005]本发明的目的是这样实现的:基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂生产方法步骤如下:
基因工程菌的构建:选择对海藻发酵能降解海藻大分子为小分子的光合菌、乳酸菌为供体，提取其细胞中的遗传基因组DNA，选择酵母菌提取其细胞质作为载体，连接重组质粒DNA基因组，选择大肠杆菌为宿主受体，将重组质粒DNA基因植入大肠杆菌细胞内，构建基因工程菌。
[0006]基因工程菌的培育筛选:将构建基因的工程菌细胞植入培养基内进行培养，每培养12h后筛选出生长态势好的菌株继续培养，如此培育筛选五代，筛选出的优良菌种。
[0007]三级种子培养:筛选出的优良菌株在培养基培养后，移种到摇床培养8小时移种到200L —级种子罐培养10h，再移种到1000L 二级种子罐培养12h。
[0008]两级扩大发酵:由1000L种子罐移种到IOt发酵罐发酵16小时，将IOt罐发酵液移植到20t发酵罐采用流加补料连续发酵30h。
[0009]微滤膜滤除固体杂质:将发酵液用泵打入微滤膜分离器滤除固体杂质。
[0010]超滤膜滤除菌丝:除去固体杂质的发酵液用泵打入超滤膜滤除菌丝。[0011]离子交换除盐:将滤除菌丝的滤清液用泵打入离子交换器除盐。
[0012]负压蒸发浓缩:除盐后的海藻液进行负压蒸发浓缩得到海藻液。
[0013]根据本发明的一种优选实施方式:三级种子培养中培养基的配制比例为:纯净水800g/L、蛋白胨 2.6g/L、酵母粉 2g/L、KH2PO3 2g/L, K2HPO3 lg/L、ZnSO4.8H20 0.5g/L、MgSO42g/L。
[0014]根据本发明的另一种优选实施方式:两级扩大发酵中发酵液配方为:海藻粉200目25质量份，葡萄糖5质量份，无机盐1质量份，豆质蛋白2质量份，水77质量份。发酵温度45°C，PH值为6，溶氧比:1:4.【专利附图】
【附图说明】:
附图1示出了本发明一种基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂的方法的工艺流程示意图。
【具体实施方式】 [0015]附图1示出了本发明一种基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂的方法的工艺流程图。下面结合附图做进一步说明。
[0016]基因工程菌的构建1:选择对海藻发酵能分解海藻不溶性大分子为可溶性小分子的光合菌、乳酸菌、放线菌作为供体菌，将选择的供体菌在培养基中分别培养，从供体光合菌、乳酸菌、放线菌细胞中获得具有分解海藻特性的遗传基因分子，把酵母菌的细胞质切割作为载体，将获得的光合菌、乳酸菌遗传基因与载体结合起来，将重组的遗传基因组导入大肠杆菌的细胞中，遗传基因在大肠杆菌中表达，这样对构建的新的微生物细胞称之基因工程菌。
[0017]基因工程菌的培育筛选2:制备培养基:纯净水800g/L、蛋白胨2.6g/L、酵母粉2g/L,KH2PO3 2g/L,K2HPO3 lg/L、ZnSO4.8H20 0.5g/L、MgSO4 2g/L，搅拌均匀，然后将构建的基因工程菌植入培养基中培养24小时后取样，选取长势良好的菌株继续培养，淘汰长势弱的菌株，如此连续培养筛选五代，最后选出优良菌株。
[0018]三级种子培养3:将选出的优良菌株植入摇床培养基培养8小时后，移种到200L种子罐培养10小时，再移种到1000L种子罐培养12小时，三级培养温度45°C，PH值为6，溶氧比:1:4，移种时菌种生长繁殖期均处于对数期。
[0019]两级扩大发酵4:发酵液的制备:海藻粉200目25质量份，葡萄糖5质量份，无机盐I质量份，豆质蛋白2质量份，水77质量份。将发酵液分别装入10t、20t发酵罐中，将种子液移种到IOt发酵罐，发酵16小时，菌种生长繁殖期仍处于对数期，种子量150g/L，将一级发酵液倒入二级发酵罐，采取流加补料，将发酵液浓度保持在30%，种子量保持150g/L，发酵温度45 °C，PH值为6，溶氧比:1:4.，发酵时间30小时。
[0020]微滤膜滤除固体杂质5:用泵将发酵液用泵打入微滤膜分离器，发酵液一微滤膜分离器上封头进入每根膜管清液透过膜孔在分离器圆筒内富集后从清液出口排出，固体杂质以下封头杂质出口排出。
[0021]超滤膜滤除菌体6:微滤膜滤除的清液用泵打入超滤膜分离器，液体从上封头进入每根超滤膜管，海藻提取液渗透膜壁，在筒体内富集后从滤清液出口排出，大分子菌丝阻隔在管内从下封头菌丝出口排出。[0022]离子交换除盐7:滤清液用泵打入阳离子交换器Ca、Mg、Na等阳离子被吸收，再通过阴离子交换器乳酸根、硫酸根等阴离子被吸收，达到除盐的目的。
[0023]负压蒸发浓缩8:除盐后的滤清液用泵打入三效蒸发机组，在负压-0.99MPa,温度80°C下蒸发浓缩到90%的浓度，得到海藻提取液。
[0024]本发明的主要特点是:应用分子生物学的手段构建的基因工程菌集光合菌、乳酸菌、放线菌、酵母菌在海藻中发酵能分解海藻不溶性大分子的特征于一体，在大肠杆菌中表达，大大提高了生物活性，增强了分解海藻大分子的能力，采用了高密度发酵工艺，提高了发酵强度，缩短了发酵时间，采用微滤膜和超滤膜分离技术，完整的保留了海藻中的生物活性物质和营养物质，使得海藻提取液与尿素结合成网络载肥体系，延缓尿素的分解，并为农作物提供多种养分，促进农作物的生长，达到尿素增效的目的。
【权利要求】
1.一种基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂的方法，其特征在于该方法的步骤如下: 基因工程菌的构建:选择对海藻发酵能降解海藻大分子为小分子的光合菌、乳酸菌为供体，提取其细胞中的遗传基因组DNA，选择酵母菌提取其细胞质作为载体，连接重组质粒DNA基因组，选择大肠杆菌为宿主受体，将重组质粒DNA基因植入大肠杆菌细胞内，构建出基因工程菌； 基因工程菌的培育筛选:将构建的基因工程菌细胞植入培养基内进行培养，每培养12h后筛选出生长态势好的菌株继续培养，如此培育筛选五代，筛选出的优良菌种； 三级种子培养:筛选出的优良菌株在培养基培养后，移种到摇床培养8小时移种到200L —级种子罐培养10h，再移种到1000L 二级种子罐培养12h ； 两级扩大发酵:由1000L种子罐移种到IOt发酵罐发酵16小时，将IOt罐发酵液移植到20t发酵罐采用流加补料连续发酵30h ； 微滤膜滤除固体杂质:将发酵液用泵打入微滤膜分离器滤除固体杂质； 超滤膜滤除菌丝:除去固体杂质的发酵液用泵打入超滤膜滤除菌丝； 离子交换除盐:将滤除菌丝的滤清液用泵打入离子交换器除盐； 负压蒸发浓缩:除盐后的海藻液进行负压蒸发浓缩得到海藻液。
2.根据权利要求1所述一种基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂的方法，其特征在于:三级种子培养中培养基的配制:纯净水800g/L、蛋白胨2.6g/L、酵母粉2g/L、KH2P03 2g/UK2HPO3 lg/L、ZnSO4.8H20 0.5g/L、MgSO4 2g/L。
3.根据权利要求1所述一种基因工程菌发酵提取海藻液肥料增效剂的方法，其特征在于:两级扩大发酵中发酵液配方为:海藻粉200目25质量份，葡萄糖5质量份，无机盐I质量份，豆质蛋白2质量份，水77质量份，发酵温度45°C，PH值为6，溶氧比:1:4。
【文档编号】C05G3/00GK103833461SQ201310616623
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】王爱云, 陈吉强, 刘云 申请人:山东润银生物化工股份有限公司