一种防治褐飞虱的混合配方制剂制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物防治【技术领域】，特别是涉及一种脐孢木霉菌（Trichodermabrevicompactum）0248代谢产物和吡虫啉混合配方制剂。本发明所述的脐孢木霉菌，定名为脐孢木霉菌0248。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCCNo.6985。本发明所述的脐孢木霉菌0248，经发酵提取可获得对褐飞虱类酵母共生菌具有抑制作用的代谢产物。本发明最显著的特征是将脐孢木霉菌0248代谢产物和常规杀虫剂吡虫啉按照一定的比例混合制备成新的配方，用这混合配方防治褐飞虱可以明显减少杀虫剂的使用量，有效提高褐飞虱的防治效果，延缓褐飞虱抗药性的发展。
【专利说明】一种防治褐飞虱的混合配方制剂制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物防治【技术领域】，特别是涉及脐孢木霉菌0248代谢产物和吡虫啉混合配方制剂的应用。
【背景技术】
[0002]褐飞風lugens StU)是水稻的重要害虫之一,主要以刺吸韧皮部汁液和传播水稻病毒的方式为害水稻植株。虫害大发生时会出现大面积的稻株枯死倒伏，造成粮食减产，甚至绝收。生产上，化学农药是防治褐飞虱的主要手段。但是，由于化学杀虫剂的大量频繁使用，褐飞虱对许多化学杀虫剂产生了抗药性，导致防治效果明显下降。因此，研究和应用减少水稻褐飞虱发生和为害的新手段已迫在眉睫。
[0003]昆虫与微生物的共生是一种普遍存在的现象，在进化过程中两者形成了密不可分的关系。昆虫为共生菌提供了稳定的小生境和营养，而昆虫依靠共生菌合成食物中缺乏的某些重要营养成分，同时共生菌对昆虫的代谢解毒也有一定作用，如为昆虫合成重要的营养成分，参与氮素循环，降解昆虫体内外源物质等。缺失共生菌会直接造成昆虫生长繁殖受阻、死亡率上升等。研究表明，褐飞虱体内腹部脂肪体中也存在多种类酵母共生菌，类酵母菌属子囊菌亚门焊,核菌纲(Pyrenomycetes) ,Candida属。褐飞風类酵母共生菌可为寄主合成提供必需氨基酸、固醇类物质以及蛋白质等多种营养成分，弥补了褐飞虱取食营养结构的不平衡，保证了褐飞虱的正常生长和繁殖；酵母类共生菌缺失会导致褐飞虱生长受阻、发育停滞、甚至死亡。既然褐飞虱与类酵母共生菌在生长繁殖中关系如此紧密，通过“抑制类酵母共生菌从而间接防治褐飞虱”的手段来控制褐飞虱发生以及减少其为害必将是今后防治褐飞 虱的一种重要手段。因为抑制褐飞虱体内的共生菌不但可直接或间接的达到控制褐飞虱的目的，而且还可有效提高目前杀虫剂的防治效果、延缓褐飞虱抗药性的发展。
【发明内容】
[0004]本发明将胳抱木霉菌brevicompacturn) 0248代谢产物和常规杀虫剂吡虫啉按照一定的比例混合制备成新的配方，并研究了该配方对褐飞虱体内类酵母共生菌的抑制作用和对褐飞虱的杀虫效果。该发明为水稻褐飞虱的有效防治提供了新的方法。
[0005]本发明的目的是针对褐飞虱对常规化学杀虫剂产生抗药性，导致化学防治效果明显下降的不足，提供一种利用脐孢木霉菌0248代谢产物抑制褐飞虱体内类酵母共生菌生长，进而引起褐飞虱死亡的新思路；本发明的另一目的是提供了一种防治褐飞虱的新方法和新药剂。
[0006]本发明脐孢木霉菌定名为脐孢木霉菌0248。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCC N0.6985。
[0007]本发明所述的脐孢木霉菌0248，经发酵可获得对褐飞虱类酵母共生菌具有抑制作用的代谢产物。
[0008]本发明目的通过以下技术方案来实现:
脐孢木霉菌0248代谢产物和吡虫啉混合配方制剂在防治褐飞虱中的应用，按以下步骤进行:
(O菌种的活化培养:将分离保存的脐孢木霉菌0248菌种移至马铃薯葡萄糖培养基(PDA)平板上，在28°C ± 1°C条件下，培养至培养皿长满绿色孢子，加入IOml无菌水，用涂布棒轻轻刮，洗下的孢子液用无菌滤纸过滤，得到孢子悬液，并用血细胞技术板计数使孢子悬液浓度为1.0X IO6个/ml ；
(2)发酵培养:发酵培养液为每1000ml中含有葡萄糖Sg，牛肉膏10g，NaCl2g，每300ml三角瓶装发酵培养液60ml ;配制后立即1211:灭菌201^11，待冷却至401:在无菌条件下接种浓度为1.0X IO6个/ml的孢子悬液lml，在28°C ±2°C条件下，培养3天；
(3)发酵代谢产物收集:发酵完毕，离心，弃菌丝体，收集发酵液，此发酵液即为脐孢木霉菌0248代谢产物；
(4)药液配制:将步骤(4)获得的脐孢木霉菌0248代谢产物和常规杀虫剂配比，用于褐飞虱的防治。
[0009]本发明的有益效果:本发明提供了一种利用脐孢木霉菌0248代谢产物和吡虫啉混合配方防治褐飞虱的新方法。
【具体实施方式】
[0010]实施例1:(脐孢木霉菌0248代谢产物的制备)
按以下步骤进行:
(O菌种的活化培养:将分离保存的脐孢木霉菌0248菌种移至马铃薯葡萄糖培养基(PDA)平板上，在28°C ±1°C条件下，培养96h，至培养皿长满绿色孢子，加入IOml无菌水，用涂布棒轻轻刮，洗下的孢子液用无菌滤纸过滤，得到无菌丝体孢子悬液，并用血细胞技术板计数使孢子悬液浓度为1.0X IO6个/ml ；
(3)发酵培养:发酵培养液为每1000ml中含有葡萄糖Sg，牛肉膏10g，NaCl2g，每300ml三角瓶装发酵培养液60ml ;配制后立即1211:灭菌201^11，待冷却至401:在无菌条件下接种浓度为1.0X IO6个/ml的孢子悬液lml，在28°C ±2°C条件下，培养3天；
(4)发酵物代谢产物收集:发酵完毕,收集发酵液,此发酵液即为脐孢木霉菌0248代谢产物；
实施例2:(脐孢木霉菌0248代谢产物和吡虫啉混合配方的制备)
吡虫啉水分散粒剂(有效成分质量百分比为70 %)由拜耳公司生产，将吡虫啉水分散粒剂用自来水溶解，配成浓度为0.01g/L吡虫啉药液，而后与脐孢木霉菌0248代谢产物等体积混合,制备成吡虫啉和脐孢木霉菌0248代谢产物混合配方(以下内容中称“产品A”)。浓度为0.01g/L吡虫啉药液与脐孢木霉菌0248代谢产物以1:2体积比混合，制备成另一种吡虫啉和脐孢木霉菌0248代谢产物混合配方(以下内容中称“产品B”)。
[0011]实施例3:(脐孢木霉菌0248代谢产物和吡虫啉混合配方在防治褐飞虱若虫中的应用)
按以下步骤进行:(O分蘖拔节期TNl水稻，清除部分根和基部叶鞘后洗净，自然晾干；
(2)以清水作对照，分别喷施实施例2制备的“产品A”和“产品B”，要求药液雾滴分布均匀，覆盖率高，药液量适当，以湿润目标物表面不产生流失为宜，自然晾干；
(3)经步骤(2)处理后的稻苗放入事先注入20ml水稻培养液的大试管中，每管3根稻苗，接入3龄褐飞虱若虫30头，以喷施清水后的水稻苗处理作为阴性对照，喷施0.04g/L吡虫啉药液处理为阳性对照，每个处理3次重复；
(4)分别在处理后I天，2天和4天测定褐飞虱体内共生菌数量，并统计褐飞虱死亡率。其中褐飞虱体内共生菌数量测定方法为:分别取各处理中存活的褐飞虱3头，用75%的酒精消毒，无菌水漂洗，去掉翅膀、头部和胸部，将腹部放入1.5ml离心管中，加入0.9%的生理盐水50 μ 1， 匀浆，然后取2 μ I匀浆液滴于血细胞计数板上，盖上盖破片，在显微镜(16X40)下统计共生菌数量。
[0012]实施例4:(脐孢木霉菌0248代谢产物和吡虫啉混合配方在防治褐飞虱雌成虫中的应用)
按以下步骤进行:
(1)分蘖拔节期TNl水稻，清除部分根和基部叶鞘后洗净，自然晾干；
(2)以清水作对照，分别喷施实施例2制备的“产品Α”和“产品B”，，要求药液雾滴分布均匀，覆盖率高， 药液量适当，以湿润目标物表面不产生流失为宜，自然晾干；
(3)经步骤(2)处理后的稻苗放入事先注入20ml水稻培养液的大试管中，每管4根稻苗，接入刚羽化的短翅雌成虫30头，以喷施清水后的水稻苗处理作为阴性对照，喷施
0.08g/L吡虫啉药液处理为阳性对照，每个处理3次重复；
(4)分别在处理后I天，2天和4天测定短翅雌虫褐飞虱体内共生菌数量，并统计褐飞虱死亡率。其中褐飞虱体内共生菌数量测定方法为:分别取各处理中存活的短翅雌虫3头，用75%的酒精消毒，无菌水漂洗，去掉翅膀、头部和胸部，将腹部放入1.5ml离心管中，加入
0.9%的生理盐水50μ 1，匀衆，然后取2μ I匀浆液滴于血细胞计数板上，盖上盖破片，在显微镜(16 X 40 )下统计共生菌数量。
[0013]试验例:(本发明的产品与常规农药防治效果对比试验)
试验结果见表1和表2。从表1和表2看出，利用产品A和产品B均明显抑制了褐飞虱体内共生菌的数量,从而引起褐飞虱死亡率上升。
[0014]表1脐孢木霉菌0248代谢产物和吡虫啉混合药液对褐飞虱若虫的防治效果
【权利要求】
1.一种防治褐飞虱的混合配方制剂制备方法，这种混合配方制剂包含脐孢木霉菌 0248代谢产物和吡虫啉。
2.权利要求1所述的混合配方制剂，其中所述的脐孢木霉菌0248代谢产物由菌种活化培养、发酵培养、发酵代谢产物收集方法制得。
3.权利要求1所述的混合配方制剂，其中所述的脐孢木霉菌0248代谢产物和0.01g/L吡虫啉药液的体积比为1:1-2:1。
4.权利要求1所述的混合配方制剂，由以下方法获得: (O菌种的活化培养:将分离保存的脐孢木霉菌0248菌种移至马铃薯葡萄糖培养基(PDA)平板上，在28°C ±1°C条件下，活化培养至培养皿长满绿色孢子，加入IOml无菌水，用涂布棒轻轻刮，洗下的孢子液用无菌滤纸过滤，得到孢子悬液，并用血细胞技术板计数使孢子悬液浓度为1.0X IO6个/ml，所述的脐孢木霉菌0248已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCC N0.6985 ； (2)发酵培养:发酵培养液为每1000ml中含有葡萄糖Sg，牛肉膏10g，NaCl2g，每300ml三角瓶装发酵培养液60ml ;配制后立即121°C灭菌20min，待冷却至40°C在无菌条件下接种浓度为1.0X IO6个/ml的孢子悬液lml，在28°C ±2°C条件下，培养3天； (3)发酵代谢产物收集:发酵完毕，离心，弃菌丝体，收集发酵液，此发酵液即为脐孢木霉菌0248代谢产物； (4)药液配制:将步骤(4)获得的脐孢木霉菌0248代谢产物和常规杀虫剂配比，用于褐飞虱的防治。
【文档编号】A01N63/04GK103975957SQ201410191331
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】俞晓平, 申屠旭萍, 李丹婷, 郝培应, 许益鹏, 马正, 王正亮 申请人:中国计量学院