一种冬小包脚菇的菌种培养基及其制备方法及利用其的菌种培养方法
【专利摘要】一种冬小包脚菇的菌种培养基及其制备方法及利用其的菌种培养方法，菌种培养基，玉米芯80％，米糠18％，过磷酸钙1％，葡萄糖1％；玉米芯；制备方法：玉米芯加入沸水使其全部淹没原料，浸泡0.8h～1.2h，过滤去水分，加入上述配方的米糠、过磷酸钙、蔗糖，搅拌均匀，形成培养基；检查并调整所述培养基的水分，含水量50％～55％；装瓶，灭菌。菌种培养方法：菌种分离，培养并转接：再按相同方法，再进行2次以上的转接。本发明采用组织分离法，不经过试管培养，直接接入经制备好的玉米芯+米糠+过磷酸钙+葡萄糖原料培养基培养，通过转接纯化，成功获得了冬小包脚菇纯培养菌种。本发明具有分离及培养基制作方便、不经过试管分离培养，缩短了菌种培养周期。
【专利说明】一种冬小包脚菇的菌种培养基及其制备方法及利用其的菌种培养方法
【技术领域】 [0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，尤其是涉及一种冬小包脚菇的菌种培养基及其制备方法及利用其的菌种培养方法。
【背景技术】
[0002]冬小包脚燕(Volvariella brumal is He sp.),俗称低温草燕、谷桩菌、鸡丝菌。野生冬小包脚菇仅贵州有分布报道，每年11月至翌年4月，生长于收割水稻后种植小麦、油菜、蚕豆、豌豆、马铃薯等作物地里。该菌是草菇属中目前发现的唯一低温型品种，填补了现有草菇属均为中高温型的缺陷。该菌菇肉细嫩、味道鲜美、营养丰富，具有很大的开发利用价值。但是，有关冬小包脚菇的菌种分离及培养技术却是现有技术中的空白，严重制约着该产业的发展。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于设计一种冬小包脚菇的菌种培养基及其制备方法及利用其的菌种培养方法。
[0004]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0005]一种冬小包脚菇的菌种培养基，质量百分百:玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1% ；
[0006]要求:
[0007]玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ；
[0008]米糠:无霉变，含水量< 13% ；
[0009]过磷酸钙:含有效P20514%~20%，其中80%~95%溶于水；
[0010]葡萄糖:化学纯；
[0011]所述培养基的水分，含水量达到:50%~55%。
[0012]一种冬小包脚菇的菌种培养基的制备方法，包括步骤如下:
[0013]第一步，准备原料:按照质量百分比玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1% ；
[0014]要求:
[0015]玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ；
[0016]米糠:无霉变，含水量< 13% ；
[0017]过磷酸钙:含有效P20514%~20%，其中80%~95%溶于水；
[0018]葡萄糖:化学纯；
[0019]第二步，培养基制作:称取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹没原料，浸泡0.Sh~1.2h，过滤去水分，加入上述配方的米糠、过磷酸钙、蔗糖，搅拌均匀，形成培养基；检查并调整所述培养基的水分，含水量50%~55%。[0020]还包括步骤如下:
[0021]第三步，装瓶:将第二步中制备的培养基装入菌种瓶中，装量至菌种瓶瓶肩，压紧瓶内表面的培养基，松紧程度为:将菌种瓶倒置，培养基不下落；然后，用清水洗净瓶外，再用纱布伸进瓶内，洗净瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮纸抱住瓶口，捆扎；
[0022]第四步，灭菌:所述菌种瓶放入高压蒸汽灭菌锅中，在1.5kg/cm2压力下，保持Ih ；将灭菌好的所述菌种瓶移到超净工作台内，让其自然冷却，形成成品菌种瓶。
[0023]一种利用所述的冬小包脚菇的菌种培养基的冬小包脚菇的菌种培养方法，包括步骤如下:
[0024]第一步，菌种分离:
[0025]I)取当天采集的新鲜未全开伞的冬小包脚菇子实体，剪去菌柄基部泥土，用无菌湿脱脂棉擦去菌盖上的杂物，装入经过灭菌的塑料袋，放到塑料盒中并及时带回实验室；
[0026]2)用75%酒精棉擦拭所述无菌塑料袋外壁，移到超净工作台，无菌条件下，用解剖刀划开所述无菌塑料袋一小口，使菌盖顶部刚好露出，再用解剖刀削去菌盖表皮，露出菌盖内的白色组织，挑取白色组织约5_大小作为组织块，将所述组织块接入菌种瓶培养基中部，使其与培养基有较好接触 。
[0027]第二步，培养并转接:
[0028]I)将所述成品菌种瓶置于18°C~22°C恒温箱培养。每天观察接入的所述组织块的萌发状况:若所述组织块及周围无污染，单菌落，为正常，菌种分离成功；否则为污染，要及时检出；
[0029]2)对上述正常萌发，形成单一菌落的所述菌种瓶，不等长满瓶，当菌丝开始吃料，在培养基上形成一圈直径为2.5cm~3.5cm菌落时，及时转接，使之纯化；转接所使用的培养基和第一步中的培养基相同，转接方法如下:
[0030]SI，在超净工作台无菌条件下，用接种针挑取菌落的边缘菌丝体，转接到另一个菌种瓶培养基上，置于18°C~22°C恒温箱培养；每天观察接入菌体生长状况，菌丝吃料，生长整齐，浓密，健壮，无污染，为正常，进入下一步；
[0031]S2，再按相同方法，再进行2次以上的转接，形成为冬小包脚菇菌种。
[0032]本发明中的超净工作台(clean bench)是指为了适应现代化工业、光电产业、生物制药以及科研试验等领域对局部工作区域洁净度的需求而设计的。超净工作台原理是在在特定的空间内，室内空气经预过滤器初滤，由小型离心风机压入静压箱，再经空气高效过滤器二级过滤，从空气高效过滤器出风面吹出的洁净气流具有一定的和均匀的断面风速，可以排除工作区原来的空气，将尘埃颗粒和生物颗粒带走，以形成无菌的高洁净的工作环境。超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率，预备时间短，开机10分钟以上即可操作，基本上可随时使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。超净台由三相电机作鼓风动力，功率145~260W左右，将空气通过由特的微孔泡沫塑料片层叠合组的“超级滤清器”后吹送出来，形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，即所谓“有效的特殊空气”，它除去了大于0.3 μ m的尘埃、真菌和细菌孢子等等。超净空气的流速为24~30m/min，这已足够防止附近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒。工作人员就在这样的无菌条件下操作，保持无菌材料在转移接种过中不受污染。但是万一操作中途遇到停电，暴露在未过滤空气中的材料便难以幸免污染。这时应迅速结束工作，并在瓶上作出记号，内中的材料如处增殖阶段，则以后不再用作增殖而转入生根培养。如为一般性生产材料，极其丰富也可弃去。如处生根过，则可留待以后种植用。
[0033]本发明包括具体步骤如下:
[0034]一、菌种分离
[0035](一 )材料
[0036]1、菌株来源
[0037]冬小包脚菇子实体，2010年4月6日采自贵州省龙里县。
[0038]2、培养基及制备
[0039](I)培养基配方
[0040]玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1%。pH值自然。 [0041](2)制备
[0042]玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm。
[0043]米糠:无霉变，含水量< 13%。
[0044]过磷酸钙:含有效P20514%~20% (其中80%~95%溶于水)。
[0045]葡萄糖:化学纯。
[0046]培养基制作:按上述配方称取玉米芯于容器中，加入沸水，使其全部淹没原料，浸泡Ih左右，滤去多余水分，按配方加入米糠、过磷酸钙、蔗糖，搅拌均匀，然后检查培养基的水分，含水量50%~55%。
[0047]装瓶:将配制好的培养基装入菌种瓶中，装量至菌种瓶瓶肩，压紧瓶内表面的培养基，松紧程度为:将菌种瓶倒置，培养基不下落，用清水洗净瓶外，再用纱布伸进瓶内，洗净瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮纸抱住瓶口，捆扎。
[0048]灭菌:将装好的菌种瓶放入高压蒸汽灭菌锅中，在1.5kg/cm2压力下，保持lh。将灭菌好的菌种瓶移到超净工作台内，让其自然冷却。
[0049]( 二)分离方法
[0050]取当天采集的新鲜未全开伞的冬小包脚菇子实体，剪去菌柄基部泥土，用无菌湿脱脂棉擦去菌盖上的杂物，装入经过灭菌的塑料袋，放到塑料盒中及时带回实验室。
[0051]用75%酒精棉擦拭塑料袋外壁，移到超净工作台无菌条件下，用解剖刀划开塑料袋一小口，使菌盖顶部刚好露出，再用解剖刀削去菌盖表皮，露出菌盖内的白色组织，挑取白色组织一小块(约5mm左右)，接入菌种瓶培养基中部，使其与培养基有较好接触。
[0052]二、菌种培养
[0053](一 )培养观察
[0054]将已接种的上述菌种瓶置于18°C~22°C恒温箱培养。每天观察接入的组织块萌发状况，组织块及周围无污染，单菌落，即为正常，说明菌种分离成功。否则为污染，要及时检出。
[0055]( 二 )纯化
[0056]对上述正常萌发，形成单一菌落的菌种瓶，不能等长满瓶。即当菌丝开始吃料，在培养基上形成一圈(直径为2.5cm~3.5cm)菌落时,要及时转接纯化,转接所使用的培养基和上述相同，至少要进行3次纯化。[0057]转接方法:在超净工作台无菌条件下，用接种针挑取菌落的边缘菌丝体，转接到另一个菌种瓶培养基上，置于18°C~22°C恒温箱培养。每天观察接入菌体生长状况，菌丝吃料，生长整齐，浓密，健壮，无污染，即为正常。再按相同方法，进行第二次、第三次转接培养，即为冬小包脚菇菌种。
[0058]本发明的有益效果可以总结如下:
[0059]1、本发明采用组织分离法，不经过试管培养，直接接入经制备好的玉米芯+米糠+过磷酸钙+葡萄糖原料培养基培养，通过转接纯化，成功获得了冬小包脚菇纯培养菌种。
[0060]2、本发明具有分离及培养基制作方便、不经过试管分离培养，缩短了菌种培养周期。
【具体实施方式】
[0061]为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0062]实施例1
[0063]一种冬小包脚菇的菌种培养基，质量百分百:玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1% ;要求:
[0064]玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ；
[0065]米糠:无霉变，含水量< 13% ；
[0066]过磷酸钙:含有效P20514%，其中80%溶于水；
[0067]葡萄糖:化学纯；
[0068]所述培养基的水分，含水量达到:50%。
[0069]一种冬小包脚菇的菌种培养基的制备方法，包括步骤如下:
[0070]第一步，准备原料:按照质量百分比玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1% ;要求:
[0071]玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ；
[0072]米糠:无霉变，含水量< 13% ；
[0073]过磷酸钙:含有效P20514%，其中80%溶于水；
[0074]葡萄糖:化学纯；
[0075]第二步，培养基制作:称取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹没原料，浸泡0.8h，过滤去水分，加入上述配方的米糠、过磷酸钙、蔗糖，搅拌均匀，形成培养基；检查并调整所述培养基的水分，含水量50%。
[0076]第三步，装瓶:将第二步中制备的培养基装入菌种瓶中，装量至菌种瓶瓶肩，压紧瓶内表面的培养基，松紧程度为:将菌种瓶倒置，培养基不下落；然后，用清水洗净瓶外，再用纱布伸进瓶内，洗净瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮纸抱住瓶口，捆扎；
[0077]第四步，灭菌:所述菌种瓶放入高压蒸汽灭菌锅中，在1.5kg/cm2压力下，保持Ih ；将灭菌好的所述菌种瓶移到超净工作台内，让其自然冷却，形成成品菌种瓶。
[0078]—种利用所述的冬小包脚菇的菌种培养基的冬小包脚菇的菌种培养方法，包括步骤如下:[0079]第一步，菌种分离:
[0080]I)取当天采集的新鲜未全开伞的冬小包脚菇子实体，本实施例中，冬小包脚菇子实体2010年4月6日采自贵州省龙里县。
[0081]剪去菌柄基部泥土，用无菌湿脱脂棉擦去菌盖上的杂物，装入经过灭菌的塑料袋，放到塑料盒中并及时带回实验室；
[0082]2)用75%酒精棉擦拭所述无菌塑料袋外壁，移到超净工作台，无菌条件下，用解剖刀划开所述无菌塑料袋一小口，使菌盖顶部刚好露出，再用解剖刀削去菌盖表皮，露出菌盖内的白色组织，挑取白色组织约5mm大小作为组织块，将所述组织块接入菌种瓶培养基中部，使其与培养基有较好接触。
[0083]第二步，培养并转接:
[0084]I)将所述成品菌种瓶置于18°C恒温箱培养。每天观察接入的所述组织块的萌发状况:若所述组织块及周围无污染，单菌落，为正常，菌种分离成功；否则为污染，要及时检出；
[0085]2)对上述正常萌发，形成单一菌落的所述菌种瓶，不等长满瓶，当菌丝开始吃料，在培养基上形成一圈直径为2.5cm~3.5cm菌落时，及时转接，使之纯化；转接所使用的培养基和第一步中的培养基相同，转接方法如下: [0086]SI，在超净工作台无菌条件下，用接种针挑取菌落的边缘菌丝体，转接到另一个菌种瓶培养基上，置于18°C恒温箱培养；每天观察接入菌体生长状况，菌丝吃料，生长整齐，浓密，健壮，无污染，为正常，进入下一步；
[0087]S2，再按相同方法，再进行2次以上的转接，形成为冬小包脚菇菌种。
[0088]本发明采用组织分离法，不经过试管培养，直接接入经制备好的玉米芯+米糠+过磷酸钙+葡萄糖原料培养基培养，通过转接纯化，成功获得了冬小包脚菇纯培养菌种。本发明具有分离及培养基制作方便、不经过试管分离培养，缩短了菌种培养周期——本实施例中，用时45天，而现有技术中通常经过试管分离，纯化，培养，获得母种，再转接原种、栽培种，需要60-75天，本技术45-60天，可缩短菌种培养周期15天。
[0089]冬小包脚菇菌种的鉴定:
[0090]菌落特征:白色，菌丝绒毛状，匍匐生长，菌落边缘整齐，边缘与中央部位颜色一致，质地均匀。
[0091]菌丝体特征:肉眼观察菌丝体白色，显微镜下菌丝透明，分枝，有隔，初生菌丝体纤细，次生菌丝体较粗壮。
[0092]经过出菇试验证明，本实施例中获得的为冬小包脚菇菌种的实体。
[0093]实施例2
[0094]一种冬小包脚菇的菌种培养基，质量百分百:玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1% ;要求:
[0095]玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ；
[0096]米糠:无霉变，含水量≤13% ；
[0097]过磷酸钙:含有效P20520%，其中95%溶于水；
[0098]葡萄糖:化学纯；
[0099]所述培养基的水分，含水量达到:55%。[0100]一种冬小包脚菇的菌种培养基的制备方法，包括步骤如下:
[0101]第一步，准备原料:按照质量百分比玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1% ;要求:
[0102]玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ；
[0103]米糠:无霉变，含水量≤ 13% ；
[0104]过磷酸钙:含有效P20520%，其中95%溶于水；
[0105]葡萄糖:化学纯；
[0106]第二步，培养基制作:称取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹没原料，浸泡1.2h，过滤去水分，加入上述配方的米糠、过磷酸钙、蔗糖，搅拌均匀，形成培养基；检查并调整所述培养基的水分，含水量55%。
[0107]第三步，装瓶:将第二步中制备的培养基装入菌种瓶中，装量至菌种瓶瓶肩，压紧瓶内表面的培养基，松紧程度为:将菌种瓶倒置，培养基不下落；然后，用清水洗净瓶外，再用纱布伸进瓶内，洗净瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮纸抱住瓶口，捆扎；[0108]第四步，灭菌:所述菌种瓶放入高压蒸汽灭菌锅中，在1.5kg/cm2压力下，保持Ih ；将灭菌好的所述菌种瓶移到超净工作台内，让其自然冷却，形成成品菌种瓶。
[0109]一种利用所述的冬小包脚菇的菌种培养基的冬小包脚菇的菌种培养方法，包括步骤如下:
[0110]第一步，菌种分离:
[0111]I)取当天采集的新鲜未全开伞的冬小包脚菇子实体，本实施例中，冬小包脚菇子实体2010年4月6日采自贵州省龙里县。
[0112]剪去菌柄基部泥土，用无菌湿脱脂棉擦去菌盖上的杂物，装入经过灭菌的塑料袋，放到塑料盒中并及时带回实验室；
[0113]2)用75%酒精棉擦拭所述无菌塑料袋外壁，移到超净工作台，无菌条件下，用解剖刀划开所述无菌塑料袋一小口，使菌盖顶部刚好露出，再用解剖刀削去菌盖表皮，露出菌盖内的白色组织，挑取白色组织约5mm大小作为组织块，将所述组织块接入菌种瓶培养基中部，使其与培养基有较好接触。
[0114]第二步，培养并转接:
[0115]I)将所述成品菌种瓶置于22°C恒温箱培养。每天观察接入的所述组织块的萌发状况:若所述组织块及周围无污染，单菌落，为正常，菌种分离成功；否则为污染，要及时检出；
[0116]2)对上述正常萌发，形成单一菌落的所述菌种瓶，不等长满瓶，当菌丝开始吃料，在培养基上形成一圈直径为2.5cm~3.5cm菌落时，及时转接，使之纯化；转接所使用的培养基和第一步中的培养基相同，转接方法如下:
[0117]SI，在超净工作台无菌条件下，用接种针挑取菌落的边缘菌丝体，转接到另一个菌种瓶培养基上，置于22°C恒温箱培养；每天观察接入菌体生长状况，菌丝吃料，生长整齐，浓密，健壮，无污染，为正常，进入下一步；
[0118]S2，再按相同方法，再进行2次以上的转接，形成为冬小包脚菇菌种。
[0119]本发明采用组织分离法，不经过试管培养，直接接入经制备好的玉米芯+米糠+过磷酸钙+葡萄糖原料培养基培养，通过转接纯化，成功获得了冬小包脚菇纯培养菌种。本发明具有分离及培养基制作方便、不经过试管分离培养，缩短了菌种培养周期。本实施例中，用时68天，而现有技术中通常经过试管分离，纯化，培养，获得母种，再转接原种、栽培种，需要60-75天，本技术45-60天，可缩短菌种培养周期15天。
[0120] 冬小包脚菇菌种的鉴定:
[0121]菌落特征:白色，菌丝绒毛状，匍匐生长，菌落边缘整齐，边缘与中央部位颜色一致，质地均匀。
[0122]菌丝体特征:肉眼观察菌丝体白色，显微镜下菌丝透明，分枝，有隔，初生菌丝体纤细，次生菌丝体较粗壮。
[0123]经过出菇试验证明，本实施例中获得的为冬小包脚菇菌种的实体。
[0124]实施例3
[0125]一种冬小包脚菇的菌种培养基，质量百分百:玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1% ;要求:
[0126]玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ；
[0127]米糠:无霉变，含水量< 13% ；
[0128]过磷酸钙:含有效P20518%，其中87.5%溶于水；
[0129]葡萄糖:化学纯；
[0130]所述培养基的水分，含水量达到:52.5%。
[0131]一种冬小包脚菇的菌种培养基的制备方法，包括步骤如下:
[0132]第一步，准备原料:按照质量百分比玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1% ;要求:
[0133]玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ；
[0134]米糠:无霉变，含水量< 13% ；
[0135]过磷酸钙:含有效P20518%，其中87.5%溶于水；
[0136]葡萄糖:化学纯；
[0137]第二步，培养基制作:称取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹没原料，浸泡lh，过滤去水分，加入上述配方的米糠、过磷酸钙、蔗糖，搅拌均匀，形成培养基；检查并调整所述培养基的水分，含水量52.5%。
[0138]第三步，装瓶:将第二步中制备的培养基装入菌种瓶中，装量至菌种瓶瓶肩，压紧瓶内表面的培养基，松紧程度为:将菌种瓶倒置，培养基不下落；然后，用清水洗净瓶外，再用纱布伸进瓶内，洗净瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮纸抱住瓶口，捆扎；
[0139]第四步，灭菌:所述菌种瓶放入高压蒸汽灭菌锅中，在1.5kg/cm2压力下，保持Ih ；将灭菌好的所述菌种瓶移到超净工作台内，让其自然冷却，形成成品菌种瓶。
[0140]一种利用所述的冬小包脚菇的菌种培养基的冬小包脚菇的菌种培养方法，包括步骤如下:
[0141]第一步，菌种分离:
[0142]I)取当天采集的新鲜未全开伞的冬小包脚菇子实体，本实施例中，冬小包脚菇子实体2010年4月6日采自贵州省龙里县。
[0143]剪去菌柄基部泥土，用无菌湿脱脂棉擦去菌盖上的杂物，装入经过灭菌的塑料袋，放到塑料盒中并及时带回实验室；[0144]2)用75%酒精棉擦拭所述无菌塑料袋外壁，移到超净工作台，无菌条件下，用解剖刀划开所述无菌塑料袋一小口，使菌盖顶部刚好露出，再用解剖刀削去菌盖表皮，露出菌盖内的白色组织，挑取白色组织约5mm大小作为组织块，将所述组织块接入菌种瓶培养基中部，使其与培养基有较好接触。
[0145]第二步，培养并转接:
[0146]I)将所述成品菌种瓶置于20°C恒温箱培养。每天观察接入的所述组织块的萌发状况:若所述组织块及周围无污染，单菌落，为正常，菌种分离成功；否则为污染，要及时检出；
[0147]2)对上述正常萌发，形成单一菌落的所述菌种瓶，不等长满瓶，当菌丝开始吃料，在培养基上形成一圈直径为2.5cm~3.5cm菌落时，及时转接，使之纯化；转接所使用的培养基和第一步中的培养基相同，转接方法如下:
[0148]SI，在超净工作台无菌条件下，用接种针挑取菌落的边缘菌丝体，转接到另一个菌种瓶培养基上，置于20°C恒温箱培养；每天观察接入菌体生长状况，菌丝吃料，生长整齐，浓密，健壮， 无污染，为正常，进入下一步；
[0149]S2，再按相同方法，再进行2次以上的转接，形成为冬小包脚菇菌种。
[0150]本发明采用组织分离法，不经过试管培养，直接接入经制备好的玉米芯+米糠+过磷酸钙+葡萄糖原料培养基培养，通过转接纯化，成功获得了冬小包脚菇纯培养菌种。本发明具有分离及培养基制作方便、不经过试管分离培养，缩短了菌种培养周期。本实施例中，用时75天，而现有技术中通常经过试管分离，纯化，培养，获得母种，再转接原种、栽培种，需要60-75天，本技术45-60天，可缩短菌种培养周期15天。
[0151]冬小包脚菇菌种的鉴定:
[0152]菌落特征:白色，菌丝绒毛状，匍匐生长，菌落边缘整齐，边缘与中央部位颜色一致，质地均匀。
[0153]菌丝体特征:肉眼观察菌丝体白色，显微镜下菌丝透明，分枝，有隔，初生菌丝体纤细，次生菌丝体较粗壮。
[0154]经过出菇试验证明，本实施例中获得的为冬小包脚菇菌种的实体。
[0155]可见，现有技术中通常经过试管分离，纯化，培养，获得母种，再转接原种、栽培种，需要60-75天，本技术45-60天，可缩短菌种培养周期15天。
[0156]以上通过具体的和优选的实施例详细的描述了本发明，但本领域技术人员应该明白，本发明并不局限于以上所述实施例，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种冬小包脚菇的菌种培养基，其特征在于: 质量百分百:玉米芯80%，米糠18%，过磷酸钙1%，葡萄糖1% ； 要求: 玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ； 米糠:无霉变，含水量< 13% ； 过磷酸钙:含有效P2O5H%~20%，其中80%~95%溶于水； 葡萄糖:化学纯； 所述培养基的水分，含水量达到:50%~55%。
2.—种根据权利要求1所述的冬小包脚燕的菌种培养基的制备方法，其特征在于，包括步骤如下: 第一步，准备原料:按照质量百分比玉米芯80 %，米糠18 %，过磷酸钙I %，葡萄糖I % ； 要求: 玉米芯:无霉变，含水量≤12%，粉碎颗粒≤5mm ； 米糠:无霉变，含水量< 13% ； 过磷酸钙:含有效P20514%~20%，其中80%~95%溶于水； 葡萄糖:化学纯； 第二步，培养基制作:称取上述配方的玉米芯于容器中，加入沸水使其全部淹没原料，浸泡0.Sh~1.2h，过滤去水分，加入上述配方的米糠、过磷酸钙、蔗糖，搅拌均匀，形成培养基；检查并调整所述培养基的水分，含水量50%~55%。
3.根据权利要求2所述的冬小包脚菇的菌种培养基的制备方法，其特征在于:还包括步骤如下: 第三步，装瓶:将第二步中制备的培养基装入菌种瓶中，装量至菌种瓶瓶肩，压紧瓶内表面的培养基，松紧程度为:将菌种瓶倒置，培养基不下落；然后，用清水洗净瓶外，再用纱布伸进瓶内，洗净瓶口瓶肩，擦干瓶口水分，塞上棉塞，用牛皮纸抱住瓶口，捆扎； 第四步，灭菌:所述菌种瓶放入高压蒸汽灭菌锅中，在1.5kg/cm2压力下，保持Ih ;将灭菌好的所述菌种瓶移到超净工作台内，让其自然冷却，形成成品菌种瓶。
4.一种利用权利要求1所述的冬小包脚燕的菌种培养基的冬小包脚燕的菌种培养方法，其特征在于，包括步骤如下: 第一步，菌种分离: 1)取当天采集的新鲜未全开伞的冬小包脚菇子实体，剪去菌柄基部泥土，用无菌湿脱脂棉擦去菌盖上的杂物，装入经过灭菌的塑料袋，放到塑料盒中并及时带回实验室； 2)用75%酒精棉擦拭所述无菌塑料袋外壁，移到超净工作台，无菌条件下，用解剖刀划开所述无菌塑料袋一小口，使菌盖顶部刚好露出，再用解剖刀削去菌盖表皮，露出菌盖内的白色组织，挑取白色组织约5mm大小作为组织块，将所述组织块接入菌种瓶培养基中部，使其与培养基有较好接触。 第二步，培养并转接: I)将所述成品菌种瓶置于18°C~22°C恒温箱培养。每天观察接入的所述组织块的萌发状况:若所述组织块及周围无污染，单菌落，为正常，菌种分离成功；否则为污染，要及时检出；2)对上述正常萌发，形成单一菌落的所述菌种瓶，不等长满瓶，当菌丝开始吃料，在培养基上形成一圈直径为2.5cm~3.5cm菌落时，及时转接，使之纯化；转接所使用的培养基和第一步中的培养基相同，转接方法如下: SI，在超净工作台无菌条件下，用接种针挑取菌落的边缘菌丝体，转接到另一个菌种瓶培养基上，置于18°C~22°C恒温箱培养；每天观察接入菌体生长状况，菌丝吃料，生长整齐，浓密，健壮，无污染，为正常，进入下一步； S2，再按相同方法，再 进行2次以上的转接，形成为冬小包脚菇菌种。
【文档编号】C05G1/00GK103980027SQ201410234837
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】潘高潮, 夏荣盛, 邹方伦, 龙汉武, 陈宵 申请人:贵州省山地资源研究所