弗氏超级菌肥发酵工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种弗氏超级菌肥发酵工艺，包括以下几步：将诱变驯化的弗氏快生菌种接种到培养基A上，在无菌条件下，经过摇床培养获得快生菌群，然后将快生菌接种到种子罐内，在培养基B上，经过24小时扩大培养获得快生弗氏菌群；将所述的快生弗氏菌群接种到特定培养基C中，在发酵罐内，经过72～96h连续培养，直至达到发酵终点，酵罐内的调控参数包括：温度为27～39℃，pH为7.2～7.4，转速为150～180rpm，培养24h后补料扩大培养，发酵罐内通入最大氧通量提高氧分压。本发明的工艺流程简单，工艺参数易于控制，能够高效的获得液体菌肥和活体菌肥两种超级菌肥。
【专利说明】弗氏超级菌肥发酵工艺
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种菌肥发酵工艺方法，具体涉及一种Frankia弗氏超级菌肥发酵工 艺。
【背景技术】
[0002] 氮素是生命元素，没有它就没有五光十色的动植物世界。我国现有18亿亩耕地， 有2/3是中低产田，主要是缺氮肥和水，除豆科作物根瘤菌固氮能补充极少数氮素外，基本 上农作物氮肥的来源是靠化肥的补充。我国现有耕地年需化肥1.5亿吨，实际用量已达 1. 2亿吨，是世界上最大的化肥生产国、使用国和进口国，化肥总用量占世界25%。近15年来 我国化肥总用量增加了一倍以上，而粮食总产量仅增加9. 1%，氮素化肥的损失率高达45%， 每年浪费化肥多达100万吨，年损失上千亿元。大量、过量施用化肥，造成了土壤板结、盐碱 化、养分流失严重、地下水资源和农产品受污染、农产品品质严重下降，甚至影响到我国部 分农产品的出口。
[0003] 生物固氮供应植物所需要的氮素，是最经济、最有效、最环保的。但是，自生固氮 菌、联合固氮菌能提供植物对氮素的利用和吸收是十分有限的，共生固氮菌是最有前途的， 现在生产上所用的固氮微生物菌肥（固氮菌和根瘤菌)，它们虽能补充作物部分所需要的氮 素，又能熟化土壤，促进增产，提高品质；但是它们固氮效率偏低（13. 3kgN2/hm2/y)，存在着 严格的宿主侵染专一性的缺点，例如豌豆根瘤菌只能在豌豆、蚕豆根部形成根瘤，大豆根瘤 菌只能在黑豆、黄豆、青豆根部形成根瘤，豇豆根瘤菌只能在豇豆、花生根部形成根瘤，宿主 范围的狭窄，限制了菌肥的使用范围和效能，而且它们在土壤中生存，又仅不能自生固氮， 还需要消耗土壤中已有的氮素来保存它们的生命，要想利用固氮菌和根瘤菌必须连年施菌 肥。
[0004] 弗兰克（Frankia)氏菌肥，其固氮效率不仅高于根瘤细菌3-10倍以上，而且在土 壤中能自我繁殖，自生固氮，不需要连年施肥，当土壤中弗兰克菌含量达到一定数量后，它 们可以在土壤中与其它有益的菌类如磷细菌、钾细菌等组成庞大菌系，向植物提供N、P、k 营养，改良土壤理化性状，共同快速提高土壤肥力。此外，Frankia菌在侵染结瘤上无严格 的种属宿主侵染专一性，可侵染结瘤的植物数量庞大，至今已知它能侵染4亚纲7目8科25 属240多种树种共生结瘤固氮。但其缺点是弗氏菌自身不能侵染草本植物结瘤固氮。
[0005] 因此，现在及其需要不但能够在土壤中自我繁殖，又具有较高的固氮效率的弗氏 菌肥。
【发明内容】
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种能够获得液体菌肥和活体菌肥 的弗氏超级菌肥发酵工艺。
[0007] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 一种弗氏超级菌肥发酵工艺，包括以下几步： 第一步，获得种子菌群：将诱变驯化的弗氏快生菌种接种到培养基A上，在无菌条件 下，经过摇床培养获得快生菌群，然后将快生菌接种到种子罐内，在培养基B上，经过24小 时扩大培养获得快生弗氏菌群； 第二步，发酵培养：将所述的快生弗氏菌群接种到特定培养基C中，在发酵罐内，经过 72?96h连续培养，直至达到发酵终点，酵罐内的调控参数包括：温度为27?39°C，pH为 7. 2?7. 4,转速为150?180rpm，培养24h后补料扩大培养，发酵罐内通入最大氧通量提高 氧分压； 第三步，菌体冻干：将所述发酵培养后获得的菌液经过超速离心后获得含水菌泥，然后 再通过-50?-60°C的冷冻干燥机冷冻后的冻干活菌粉，作为活菌粉的商品肥料原料； 第四步，成品包装：将所述冻干活菌给添加泥炭土辅料和吸湿硅胶保存剂制成干菌粉， 然后包装成商品肥料。
[0008] 优选的，所述第二步发酵培养中，发酵罐内的调控参数还包括：在发酵罐内添加丙 二醛作为促进剂，添加消泡剂来消除发酵罐内发酵过程中产生的泡沫。
[0009] 优选的，所述第二步发酵培养过程中，判断发酵终点的方法为：发酵罐内80%的菌 丝转化为孢子。
[0010] 优选的，还包括菌液浓缩，经过所述第二步发酵培养后，通过超速离心获得不含菌 体的发酵菌液，菌液中含有菌体的代谢产物和残留的培养基成分，富含抗生素、激素和营养 物质作为叶面肥，在40?50°C下浓缩获得菌液浓缩物。
[0011] 优选的，还包括消毒包装，获得所述菌液浓缩物后，再对所述菌液浓缩物进行消毒 包装，制成液体商品肥料。
[0012] 优选的，第一步中所述的培养基A的配方为： 优选的，第一步中所述的培养基B的配方为： 优选的，第一步中所述的培养基C的配方为： 说明：以上给出的A、B、C培养基，就是发酵过程中使用的三种培养基。
[0013] 本发明的有益效果是： 其一、本发明的工艺流程简单，工艺参数易于控制，能够高效的获得液体菌肥和活体菌 肥两种超级菌肥。
[0014] 其二、本发明的获得的弗氏超级菌肥能够使弗兰克菌在土壤中长期生存，自我繁 殖，能够自生固氮，提高了白茬地的肥力。
[0015] 其三、本发明的弗氏超级菌肥能够产生抗生素和植物激素，提高了农作物的抗病 力和品质；并且弗氏超级菌肥发酵液作为叶面肥提高了蔬菜的产量。
[0016] 其四、本发明的弗氏超级菌肥属于无毒菌，对人、畜、动植物均无毒害，符合绿色生 产的要求。
[0017] 其五、本发明的发酵工艺中，没有任何废物、废气和废料产生，是属于全方位额绿 色环保生产工艺，并且属于生物工程中的微生物工程项目，是附加值更高的高新技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中 所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他的附图。
[0019] 图1是本发明发酵工艺流程图。
【具体实施方式】
[0020] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0021] 实施例1 根据培养基A的配方配制培养基A : 根据培养基B的配方配制培养基B : 根据培养基C的配方配制培养基C : 如图1中所示，弗氏超级菌肥发酵工艺，包括以下几步： 第一步，获得种子菌群：将诱变驯化的弗氏快生菌种接种到培养基A上，在无菌条件 下，经过摇床培养获得快生菌群，然后将快生菌接种到种子罐内，在培养基B上，经过24小 时扩大培养获得快生弗氏菌群。
[0022] 第二步，发酵培养：将上述的快生弗氏菌群接种到特定培养基C中，在发酵罐内， 经过72h连续培养，直至达到发酵终点，酵罐内的调控参数包括：温度为27°C，pH为7. 2,转 速为150rpm，培养24h后补料扩大培养，发酵罐内通入最大氧通量提高氧分压；在发酵罐内 添加丙二醛作为促进剂，添加消泡剂来消除发酵罐内发酵过程中产生的泡沫。
[0023] 当监测到发酵罐内80%的菌丝转化为孢子即为发酵终点。
[0024] 第三步，菌体冻干：将上述发酵培养后获得的菌液经过超速离心后获得含水菌泥， 然后再通过_50°C的冷冻干燥机冷冻后的冻干活菌粉，作为活菌粉的商品肥料原料。
[0025] 第四步，成品包装：将上述冻干活菌给添加泥炭土辅料和吸湿硅胶保存剂制成干 菌粉，然后包装成商品肥料。
[0026] 上述完成第二步后，还包括菌液浓缩这一步的分支工艺，具体方法为：经过上述第 二步发酵培养后，通过超速离心获得不含菌体的发酵菌液，菌液中含有菌体的代谢产物和 残留的培养基成分，富含抗生素、激素和营养物质作为叶面肥，在40°C下浓缩获得菌液浓缩 物。
[0027] 获得上述菌液浓缩物后，再对上述菌液浓缩物进行消毒包装，制成液体商品肥料。
[0028] 实施例2 如图1中所示，弗氏超级菌肥发酵工艺，包括以下几步： 第一步，获得种子菌群：将诱变驯化的弗氏快生菌种接种到培养基A上，在无菌条件 下，经过摇床培养获得快生菌群，然后将快生菌接种到种子罐内，在培养基B上，经过24小 时扩大培养获得快生弗氏菌群。
[0029] 第二步，发酵培养：将上述的快生弗氏菌群接种到特定培养基C中，在发酵罐内， 经过84h连续培养，直至达到发酵终点，酵罐内的调控参数包括：温度为33°C，pH为7. 3,转 速为165rpm，培养24h后补料扩大培养，发酵罐内通入最大氧通量提高氧分压；在发酵罐内 添加丙二醛作为促进剂，添加消泡剂来消除发酵罐内发酵过程中产生的泡沫。
[0030] 当监测到发酵罐内80%的菌丝转化为孢子即为发酵终点。
[0031] 第三步，菌体冻干：将上述发酵培养后获得的菌液经过超速离心后获得含水菌泥， 然后再通过_55°C的冷冻干燥机冷冻后的冻干活菌粉，作为活菌粉的商品肥料原料。
[0032] 第四步，成品包装：将上述冻干活菌给添加泥炭土辅料和吸湿硅胶保存剂制成干 菌粉，然后包装成商品肥料。
[0033] 上述完成第二步后，还包括菌液浓缩这一步的分支工艺，具体方法为：经过上述第 二步发酵培养后，通过超速离心获得不含菌体的发酵菌液，菌液中含有菌体的代谢产物和 残留的培养基成分，富含抗生素、激素和营养物质作为叶面肥，在45°C下浓缩获得菌液浓缩 物。
[0034] 获得上述菌液浓缩物后，再对上述菌液浓缩物进行消毒包装，制成液体商品肥料。
[0035] 实施例3 如图1中所示，弗氏超级菌肥发酵工艺，包括以下几步： 第一步，获得种子菌群：将诱变驯化的弗氏快生菌种接种到培养基A上，在无菌条件 下，经过摇床培养获得快生菌群，然后将快生菌接种到种子罐内，在培养基B上，经过24小 时扩大培养获得快生弗氏菌群。
[0036] 第二步，发酵培养：将上述的快生弗氏菌群接种到特定培养基C中，在发酵罐内， 经过96h连续培养，直至达到发酵终点，酵罐内的调控参数包括：温度为39°C，pH为7. 4,转 速为IlSOrpm，培养24h后补料扩大培养，发酵罐内通入最大氧通量提高氧分压；在发酵罐 内添加丙二醛作为促进剂，添加消泡剂来消除发酵罐内发酵过程中产生的泡沫。
[0037] 当监测到发酵罐内80%的菌丝转化为孢子即为发酵终点。
[0038] 第三步，菌体冻干：将上述发酵培养后获得的菌液经过超速离心后获得含水菌泥， 然后再通过_60°C的冷冻干燥机冷冻后的冻干活菌粉，作为活菌粉的商品肥料原料。
[0039] 第四步，成品包装：将上述冻干活菌给添加泥炭土辅料和吸湿硅胶保存剂制成干 菌粉，然后包装成商品肥料。
[0040] 上述完成第二步后，还包括菌液浓缩这一步的分支工艺，具体方法为：经过上述第 二步发酵培养后，通过超速离心获得不含菌体的发酵菌液，菌液中含有菌体的代谢产物和 残留的培养基成分，富含抗生素、激素和营养物质作为叶面肥，在50°c下浓缩获得菌液浓缩 物。
[0041] 获得上述菌液浓缩物后，再对上述菌液浓缩物进行消毒包装，制成液体商品肥料。
[0042] 性能测试 1、将本发明获得的弗氏菌肥按表1中的量施加到白茬地上，然后再检测土壤中可溶性 三大营养元素（N、P、K)的含量变化，其实验结果如表1中所示： 表1施入白茬土壤中的弗氏菌对土壤肥效的增效作用
【权利要求】
1. 一种弗氏超级菌肥发酵工艺，其特征在于，包括以下几步： 第一步，获得种子菌群：将诱变驯化的弗氏快生菌种接种到培养基A上，在无菌条件 下，经过摇床培养获得快生菌群，然后将快生菌接种到种子罐内，在培养基B上，经过24小 时扩大培养获得快生弗氏菌群； 第二步，发酵培养：将所述的快生弗氏菌群接种到特定培养基C中，在发酵罐内，经过 72?96h连续培养，直至达到发酵终点，酵罐内的调控参数包括：温度为27?39°C，pH为 7. 2?7. 4,转速为150?180rpm，培养24h后补料扩大培养，发酵罐内通入最大氧通量提高 氧分压； 第三步，菌体冻干：将所述发酵培养后获得的菌液经过超速离心后获得含水菌泥，然后 再通过-50?-60°C的冷冻干燥机冷冻后的冻干活菌粉，作为活菌粉的商品肥料原料； 第四步，成品包装：将所述冻干活菌给添加泥炭土辅料和吸湿硅胶保存剂制成干菌粉， 然后包装成商品肥料。
2. 根据权利要求1所述的弗氏超级菌肥发酵工艺，其特征在于，所述第二步发酵培养 中，发酵罐内的调控参数还包括：在发酵罐内添加丙二醛作为促进剂，添加消泡剂来消除发 酵罐内发酵过程中产生的泡沫。
3. 根据权利要求2所述的弗氏超级菌肥发酵工艺，其特征在于，所述第二步发酵培养 过程中，判断发酵终点的方法为：发酵罐内80%的菌丝转化为孢子。
4. 根据权利要求3所述的弗氏超级菌肥发酵工艺，其特征在于，还包括菌液浓缩，经过 所述第二步发酵培养后，通过超速离心获得不含菌体的发酵菌液，菌液中含有菌体的代谢 产物和残留的培养基成分，富含抗生素、激素和营养物质作为叶面肥，在40?50°C下浓缩 获得菌液浓缩物。
5. 根据权利要求4所述的弗氏超级菌肥发酵工艺，其特征在于，还包括消毒包装，获得 所述菌液浓缩物后，再对所述菌液浓缩物进行消毒包装，制成液体商品肥料。
6. 根据权利要求1所述的弗氏超级菌肥发酵工艺，其特征在于，第一步中所述的培养 基A的配方为： 磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾lg/L、硫酸镁lg/L、氯化钙0. 025g/L、丙酸钠0. 02g/L、水 解络蛋白4g/L、马铃薯糖化液6g/L、微量元素液3ml、维生素液2ml、Fe-Na-EDTA盐2ml、纯 化水，调节所述筛选培养基pH为7. 2。
7. 根据权利要求1所述的弗氏超级菌肥发酵工艺，其特征在于，第一步中所述的培养 基B的配方为： 磷酸二氢钾1. 4g/L、磷酸氢二钾1. 4g/L、硫酸镁lg/L、氯化钙0. 05g/L、丙酸钠0. 02g/ L、水解络蛋白5g/L、马铃薯糖化液10g/L、微量元素液3ml、维生素液2ml、Fe-Na-EDTA盐 2ml、纯化水，调节所述筛选培养基pH为7. 2。
8. 根据权利要求1所述的弗氏超级菌肥发酵工艺，其特征在于，第一步中所述的培 养基C的配方为：磷酸二氢钾1. 5g/L、磷酸氢二钾1. 5g/L、硫酸镁lg/L、氯化钙0. 05g/L、 丙酸钠0. 02g/L、水解络蛋白5g/L、玉米粉糖化液15g/L、微量元素液3ml、维生素液2ml、 Fe-Na-EDTA 盐 2ml。
【文档编号】C05F11/08GK104446694SQ201410683015
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】张吉科, 张婉晖, 张小民, 张林超, 林美珍 申请人:张吉科