川滇桤木次生代谢物对苯乙基酮为趋避云南松小蠹的缓释剂及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于林业害虫防治，涉及防治云南松小蠹的药物缓释剂。
【背景技术】
[0002] 云南松小蠹是云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)、横坑切梢小蠹(T. minor)、 短毛切梢小蠹(T. brevipiIosus)等以为害云南松为特征的一类駐干小蠹，新羽化成虫喜 食健康松树嫩梢，持续期8~9个月致使树势衰弱；性成熟后则选择衰弱的云南松树干作为 取食、产卵和繁殖，持续3~4个月最终使树木死亡。但该小蠹从搜寻寄主开始，到雌雄个体 相遇、交配、产卵、胚后发育等各个过程均受到非寄主气味的影响，对林区内存在寄主植物 具有高度的选择和辨识能力。
[0003] 川滇梢木(Alnus ferdinandi-coburgii Schneid)隶属于桦木科梢木属植物，是 中国云南、贵州、四川等地的乡土树种，具有较强的适生性和抗逆能力，常用作云南松林中 低产林改造和混交林营造的优良树种之一（陈强等，西部林业科学，2007，36，16-21;陈永 坤，云南林业，2011，32，53-53)。研究显示桦木科属植物含有二芳基庚烷类化合物、绿原 酸、萜烯类等化合物，能有诱集和趋避某些森林害虫（姜文霞等，武汉植物研究，1992，0， 391-392;杨晓珍等，大理学院学报，2013,12,9-11等）。而云南松林套种川滇桤木证实明显 降低云南松小蠹的危害，这可能与川滇桤木所释放的次生代谢物质，特别是与分子量小、沸 点低、易挥发的气味物质存在关系。但目前尚不清楚其次生代谢物质的组成和活性成分，文 献中仅见到尼泊尔桤木、川滇桤木果实、桤木叶片中的化合物，且这些化合物主要是高分子 次生代谢物质，并未报导较为完整的川滇桤木次生代谢物质的成分以及对这些成分的分 析。而川滇梢木成长于海拔高度1500~3000m、土层厚度大于80cm，湿润的黄红或紫色土壤， 且生长期至少5年，限制了套种林木预防危害的效用。相关专利文献，如"抗云南松小蠹混交 林模式快速筛选方法（CN201010249717.1)"是栽培非寄主林木营造混交林以实现持续控 制小蠹虫的方法，但该方法也受限于非寄主林木的自然生长环境和抚育时间。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的首先是从云南松小蠹非寄主植物川滇桤木众多次生代谢物质中筛 选和鉴定活性成分，提供一种以生物学测定和嗅觉受体验证，干扰云南松小蠹寄主依存和 繁殖，趋避持续期不少于8个月的川滇桤木次生代谢物趋避云南松小蠹的缓释剂。
[0005] 本发明的另一目的是:提供一种应用该缓释剂的方法，该方法具有省时省力、使用 方便的优点。
[0006] 本发明的目的按以下方式实现： (一)川滇桤木次生代谢物对苯乙基酮为趋避云南松小蠹的缓释剂 该缓释剂以正己烷或正戊烷或石油醚作为溶剂，以对苯乙基酮为溶质，配置 对苯乙基酮溶液，用于趋避云南松小蠹危害程度不同的林分。
[0007] 所述的缓释剂的对苯乙基酮浓度与云南松小蠹对林分危害程度呈正相关。
[0008] 所述的缓释剂:该缓释剂以正己烷作为溶剂，以对苯乙基酮为溶质，配置浓度50~ 750 ng/uL对苯乙基酮溶液。
[0009] (二)应用上述川滇桤木次生代谢物趋避云南松小蠹的缓释剂的方法 将缓释制剂盛入顶端开孔口的缓释瓶中，以挥发物释放量多寡确定顶端开孔口大小， 树高塔式交叉悬挂于衰弱木枝干和枝梢各个方位上，直至缓释瓶内的缓释液释放完毕，以 显著降低云南松小蠹对云南松松梢和新萌发松梢的危害。
[00?0] 优选的，所述的应用方法在于：缓释剂浓度分别为50 ng/uL、100 ng/uL、500 ng/ uL，分别对应云南松小蠹危害程度为低、中、高三种林分。
[0011] 进一步，所述的应用方法在于:缓释瓶为20 mL的塑料瓶，缓释瓶的顶端开孔口的 孔径为0.05~0.10 mm。
[0012] 进一步，所述的应用方法，其特征在于:树高塔式交叉悬挂于衰弱木枝干和枝梢各 个方位上，环形等距排列，每株悬挂8~50个。
[0013] 本发明与现有技术相比具有下列优点和效果： (1)本发明趋避剂所采用的对苯乙基酮是首次从非寄主植物次生代谢物质中分离鉴定 出来的，其对云南松小蠹趋避能力未见于任何文献报道。尤其是，该趋避剂对苯乙基酮为纳 克数量级(ng)溶质，具有用量少、高效、益于环境的特征，可为云南松小蠹无公害治理提供 技术和产品支持。
[0014] (2)本发明趋避剂容易配制，所使用的化学试剂，包括溶剂正己烷、正戊烷或石油 醚和溶质对苯乙基酮均可直接从市场购买，价格低廉，推广应用非常方便快捷。
[0015] (3)对苯乙基酮和正己烷、正戊烷或石油醚化学性质稳定，即使长期暴露于林间条 件下也不易分解和氧化。因而本发明所制备的缓释剂可覆盖云南松小蠹取食、产卵和繁殖8 个月以上，长期、稳定的向外释放可显著降低云南松小蠹对云南松松梢和新萌发松梢的危 害，遏制云南松小蠹危害和扩散蔓延。
[0016] (4)相比营造混交林和一般化学农药试剂防治云南松小蠹，本发明节约劳动力和 资金成本。
[0017] 应用本发明所提供的对苯乙基酮缓释剂在云南省曲靖市沾益县九龙山林场、以云 南松小蠹危害程度为中度的云南松林分实施趋避性试验的结果证明：从4~12月连续观察8 个月内，本发明对云南松小蠹具有缓释持续时间长和高效性趋避功能，覆盖了云南松小蠹 的蛀梢期。
[0018] 为了便于理解，下面结合实施例及其附图和附表，进一步对本发明做详细地描述 和说明。
【附图说明】
[0019] 图1为云南松小蠹对川滇桤木次生代谢物质的GC-EAD反应图谱。
[0020] 图2为云南松小蠹对对苯乙基酮的选择性。
[0021]图3为气味分子对苯乙基酮与嗅觉受体Tyun0BP6蛋白的竞争结合曲线。
[0022]图4为缓释瓶顶端开口方式示意图。
[0023]图5为缓释瓶林间缓释效果。
[0024]图6为缓释瓶林间依树高等距塔式十字交叉悬挂示意图。
[0025]图7为对苯乙基酮趋避云南松小蠹的林间测试效果。
[0026]具体实施方法 1材料与方法 1.1次生代谢物质的筛选与确定 1.1.1非寄主植物次生代谢物质的收集与分析 采用顶空动态法收集川滇桤木的次生代谢物质。将采集的叶片和枝条用无味透明的塑 料袋(PTEK)包裹起来，袋的两端分别留有进气口和出气口。进气端空气经活性炭(0RB0TM-32)过滤，流速控制在400 mL/min;出气端流经150 mg Porapak Q吸附剂（50-80 mesh)，流 速为300 mL/min，收集时间为1.5 h。吸附完毕后，用正己烷(HPLC)洗脱，洗脱液300 yL保存 于2 mL容量的棕色试剂瓶内。然后经吣浓缩至100 yL，加入正辛烷(0.702g/cm3)和乙酸癸酯 (0.865g/cm3)两种内标化合物，每种内标化合物300 ng/yL。放入-20 °C冰箱内保存待用。 [0027] 气味分析采用GC-MS (Agilent HP6890A/5975 MS)进行，取1.0 μL浓缩液从进样 口注入，质谱柱型号极性HP-5MS型石英柱(30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)。升温程序为:40 。(:保持2 min;然后2.57°C/min升温至100°C，以后以30 °C/min升至250 °C，保持10 min。载 气为高纯的N2,柱流量1.0 ml/min，进样口温度250 °C，柱前压100 kPa;进样采用10:1的分 流模式。气味物质的鉴定采用NIST 98 MS谱库检索法、保留指数法和参考相关文献法加以 确定。
[0028] 1.1.2次生代谢物质的GC-EAD测试 首先用刀片将云南松小蠹成虫头部切除，再用拉制的毛细管尖端刺破触角端部，然后 将参比电极插入小蠹虫头部血腔，固定于微动操作台上，调整距离，记录电极端套入受损的 触角顶端。参比电极和记录电极玻璃管内充满生理液，内插一根Ag/AgCl细丝用于导电。湿 润空气流持续吹向固定好的触角，流速400 mL/min。将2.0 yL浓缩液从气相色谱进样口注 入，然后经一个四壁不锈钢分流装置将浓缩液按照1:1方式分别注入GC和吹向触角，吹向触 角的挥发物经一加热罩加热，加热温度260°C，GC升温程序和色谱柱型号均与GC-MS分析一 样，但GC(气相色谱仪)不分流。刺激信号通过接受器感应放大，经IDAC-2信号面板的记录、 储存、处理，通过软件Autospike(Version 3.6，Syntech)在计算机屏幕上展示出来。云南 切梢小蠹、横坑切梢小蠹、短毛切梢小蠹每种各进行6次重复测试，雌雄均3次。
[0029] 1.2活性成分高效性测定 1.2.1生物学测试 采用"Y"型嗅觉仪进行生物学测定。将样品和对照(二氯甲烷)滴在一个长形的滤纸上， 室温放置20 min后，置于一个球形容器内，并与?'型管的两臂相连，然后开始抽气，气流经 活性炭过滤后加湿吹向释放管内的云南松小蠹，气流速度300 mL/min，设置反应时间为5 min，超过反应时间的小蠹虫将其移出，记作不反应，每个浓度重复测试20-30只。
[0030] 1.2.2嗅觉受体竞争性结合验证 采用荧光分光光度计进行测定，首先设定发光波长357 nm，扫描波长范围380~500 nm， 再向荧光比色皿中加入50 mmol/L Tris缓冲液(pH 7.4)，然后向比色皿中加入云南松小蠹 嗅觉受体蛋白Tyun0BP6使其浓度为2 umol/L，待荧光强度稳定后即开始扫描，然后加入含 有苯乙基酮气味溶液（甲醇为溶液，终浓度控制在I mmol/L)加入到比色皿中，使加入的荧 光探针I-NPN溶度从2umol/L增加到16 umol/L。每次记录最大的荧光强度，每次试验重复3 次。
[0031] 1.3缓释液的制备与缓释方法 以正己烧做溶液，将筛选确定活性次生代谢物质配置成50 ng/uL，100 ng/uL，500 ng/ uL的三种浓度液体，盛放于20 ml的塑料瓶内，瓶的顶端采用A、B、C三种方式开口（见图4)， 空口直径0.05~0.10 mm，分别对应云南松小蠹危害程度为低、中、高三种林分。以中等危害 程度的林分为例，悬挂30个缓释瓶，每月观察一次，记录每次剩余体积量，以此判断缓释剂 的释放量，直至缓释瓶内的缓释液释放完毕。
[0032]该缓释剂也可以用正戊烷或石油醚为溶剂。
[0033] 1.4林间测定 趋避实验在云南省曲靖市沾益县九龙山林场云南松林进行，以云南松小蠹危害程度为 中度的林分为例，选择两块，每块随机选择30株云南松，然后将配置好的对苯乙基酮溶液按 方位、塔式十字交叉悬挂于枝干处（图5)，从4~12月连续观察8个月，记录云南松小蠹蛀梢率 (DSI)，蛀梢率=(处理后被害率-处理前被害率)/(处理后被害率+处理前被害率），蛀梢率值 位于-1和1之间，负值意味被害率降低，正值为被害率增加。以正己烷对照，随机选取10棵树 木悬挂。
[0034] 2结果与分析 从表1可知，共鉴定44种川滇桤木次生代谢物质，主要成分包括对苯乙基酮、Ct-薇烯、香 桧烯、β-蒎烯、月桂烯和α-石竹烯等烷烃类和萜烯类化合物，但昆虫触角电位记录系统显示 仅有对苯乙基酮能引起云南松小蠹反应（图1 )，〇. 5 ng即具有79.3%趋避效果，选择性表现 显著。且随释放量的增加，云南松小蠹趋避能力也会随之增加（图2)，与嗅觉受体竞争性实 验证明对苯乙基酮与受体结合能力强，且解离速度慢（图3)。在中度危害的林分内，悬挂对 苯乙基酮可持续衡量释放9个多月（图6)，覆盖云南松小蠹的全部蛀梢期，悬挂趋避剂的云 南松松梢的被害率DSI=-0.0547,与对照相比（DSI=O. 2952)能够显著降低云南松小蠹的危 害(Ρ〈0·001，图7)。
[0035]表1川滇桤木次生代谢物质成分及其相对含量
$标准品验证，活性化学物质 本发明所提供的一种云南松小蠹高效趋避剂的制备及缓释方法，按照本方法筛选和中 度危害林分所实施趋避性试验，结果表明对苯乙基酮对云南松小蠹具有高效的趋避功能， 且所制备工艺简单，缓释持续时间长，能够完全覆盖云南松小蠹的蛀梢期。
【主权项】
1. 川滇桤木次生代谢物对苯乙基酮为趋避云南松小蠹的缓释剂，其特征在于：该缓释 剂以正己烷或正戊烷或石油醚作为溶剂，以对苯乙基酮为溶质，配置对苯乙基酮溶液，用于 趋避云南松小蠹危害程度不同的林分。2. 根据权利要求1所述的缓释剂，其特征在于:该缓释剂的对苯乙基酮浓度与云南松小 蠹对林分危害程度呈正相关。3. 根据权利要求1或2所述的缓释剂，，其特征在于：该缓释剂以正己烷作为溶剂，以对 苯乙基酮为溶质，配置浓度50~750 ng/uL对苯乙基酮溶液。4. 一种应用如权利要求1所述缓释剂的方法，其特征在于:将缓释制剂盛入顶端开孔口 的缓释瓶中，以挥发物释放量多寡确定顶端开孔口大小，树高塔式交叉悬挂于衰弱木枝干 和枝梢各个方位上，直至缓释瓶内的缓释液释放完毕，以显著降低云南松小蠹对云南松松 梢和新萌发松梢的危害。5. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于:缓释剂浓度分别为50 ng/uL、100 ng/ uL、500 ng/uL，分别对应云南松小蠹危害程度为低、中、高三种林分。6. 根据权利要求4或5所述的应用方法，其特征在于:缓释瓶为20 mL的塑料瓶，缓释瓶 的顶端开孔口的孔径为0.05~0.10 mm。7. 根据权利要求4或5所述的应用方法，其特征在于:树高塔式交叉悬挂于衰弱木枝干 和枝梢各个方位上，环形等距排列，每株悬挂8~50个。8. 根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于:树高塔式交叉悬挂于衰弱木枝干和枝 梢各个方位上，环形等距排列，每株悬挂8~50个。
【专利摘要】川滇桤木次生代谢物对苯乙基酮为趋避云南松小蠹的缓释剂及方法。本发明以正己烷或正戊烷或石油醚为溶剂、以对苯乙基酮为溶质配置对苯乙基酮溶液，用于趋避云南松小蠹危害程度不同的林分；对苯乙基酮浓度与云南松小蠹对林分危害程度正相关。应用是将缓释剂浓度设置为50~500 ng/uL置于一顶端开口的缓释瓶内，按方位、树高塔式交叉悬挂于衰弱木枝干枝梢上。本发明取材于云南松小蠹的非寄主林木次生代谢物，趋避力强、持续周期长、价格低廉、环境友好，可持续用于控制云南松小蠹的种群数量，推广潜力大。
【IPC分类】A01N25/02, A01N35/04, A01M1/20, A01N25/18, A01P17/00
【公开号】CN105707060
【申请号】CN201610029911
【发明人】李宗波, 赵宁, 朱家颖, 杨斌, 王大伟, 泽桑梓
【申请人】西南林业大学, 云南省林业有害生物防治检疫局