一种红叶卫矛多倍体细胞育种技术的制作方法

本发明属于植物倍性育种领域，为红叶卫矛三倍体细胞工程育种方法。涉及野生红叶卫矛种子胚乳细胞诱导形成愈伤组织；游离原生质体，染色及倍性分选三倍体原生质体；原生质体诱导再生小植株；小植株顶芽休眠解除等进程和方法。

背景技术：

红叶卫矛（Euonymus alatus ‘Compactus’）是卫矛科卫矛属落叶灌木，树枝幼时绿色、无毛，老枝上有木栓质的翅。花浅红或浅黄色。春夏季叶片深绿色，秋季变为紫红色或火红色故称‘火焰卫矛’，作为园林花木孤植、列植、群植于景区、校园、庭院、湖旁、草坪中，具有极高观赏价值（刘艳霞，2015），乔灌搭配群体绿化具有万山红遍层林尽染之感。红叶卫矛抗旱，耐瘠薄，抗寒－34.4℃，在美国广为栽培。由于该树种适应性强，繁殖能力、生存能力强，在21个州已列为入侵种。康涅狄克大学新英格兰地区入侵物种研究中心改良E.alatus ‘Compactus’，获得三倍体植株，拟取代野生二倍体或通过种子繁育的群体，已申报美国国家专利保护。

目前，人工培育三倍体的主要方法是通过四倍体与二倍体杂交、胚乳细胞离体培养后筛选、2n配子诱导后杂交等方式（苏静，等，2012）。其中胚乳作为多倍体细胞混合组织，其内含有天然的三倍体细胞，对其进行培养诱导再生植株，可从中筛选出三倍体植株。此方法已用于多种植物的三倍体育种，如柑桔（王大元，张进仁，1978）、猕猴桃（黄贞光，等,1982）、枸杞（米佳丽，等,2011）、巴戟天（姚焱，等,2015）等。康涅狄克大学新英格兰地区入侵物种研究中心即是采用胚乳离体培养的方式，经过愈伤组织及其不定芽的诱导，获得再生植株，最后对其进行倍性筛选，获得三倍体植株（Thammina, et al.,2011）。在该实验中，成熟胚乳诱导产生愈伤组织的诱导率为14.0%；愈伤组织诱导再生不定芽（植株）的诱导率为13.4%；其中，三倍体植株占28.6%，成熟胚乳细胞形成三倍体植株的几率为0.34%；若采用未成熟胚乳进行离体培养，形成三倍体植株的几率为0.42%.该实验流程简单易行，便于操作，但工作量大，愈伤组织及不定芽诱导率低，且胚乳组织中多数为二倍体细胞，再生植株中三倍体植株比率较小。

由于流式细胞仪可高效检测颗粒样品所带荧光强度，因而在植物DNA含量检测与倍性分析中得到广泛应用。虽然未见流式细胞仪用于植物细胞倍性分选的相关报道，但已有人利用流式细胞仪分选有活力的原生质体（郭艳萍，等，2014）。Hoechst 33342为一种活体DNA荧光染料，可与活体DNA特异结合，在紫外光下发射蓝色荧光。鉴于植物细胞壁在紫外光下亦产生蓝色的自发荧光，因而进行倍性分选的植物材料宜选用原生质体。而Hoechst 33342染色并不影响原生质体活力，可培养形成愈伤组织（van der Valk, et al,1988）。因此，可利用流式细胞仪分选三倍体细胞进行培养诱导再生植株，提高三倍体植株所占比率。

我国2012年立项引进美国三倍体红叶卫矛培育技术。通过引进、消化、吸收过程，对原技术进行改良、优化和创新形成在育种工艺、配方和效率等方便获得改进和提升的新的育种技术体系。基于多倍体胚乳愈伤组织直接诱导小植株从中筛选三倍体植株的育种程序，本研究用多倍体胚乳愈伤组织游离原生质体，利用流式细胞仪分选三倍体原生质体进行培养，精准诱导三倍体植株再生，三倍体植株获得效率在0.42%基础上大大提升。小植株顶芽休眠解除在以低温处理基础上研发了植物生长调节剂整合低温处理和容器苗技术，休眠解除效率提高到90%以上，且为容器苗，移栽成活率得到保证。

技术实现要素：

本发明要点一，提供了一种红叶卫矛胚乳愈伤组织诱导方式。其愈伤组织诱导培养基成分包含基本培养基：MS无机盐，维生素B1 0.1-1.0 mg/L、维生素B6 0.1-0.5 mg/L、烟酸0.1-0.5 mg/L、甘氨酸1.0-2.0 mg/L、水解酪蛋白0.3-0.6 g/L、吗啉乙磺酸0.5-1.0 g/L；植物生长调节剂：6-BA 1.0-3.0 mg/L、NAA0.5-2.0 mg/L；蔗糖20-30 g/L；琼脂6-8 g/L。胚与胚乳黑暗条件下室内共同培养4周后，将胚剥离，胚乳转接至愈伤组织诱导培养基上继续黑暗培养。胚伴随的胚乳愈伤组织诱导率远高于无胚伴随的胚乳愈伤组织诱导率，可达80%。

本发明要点二，提供了红叶卫矛愈伤组织游离原生质体的酶解方法。其酶解液成分包含原生质体洗涤液：KH₂P0₄ 20-27.2 mg/L、KNO₃ 90-101 mg/L、MgSO₄ ▪7H₂O 180-246 mg/L、KI 0.10-0.16 mg/L、CuSO₄ 0.010-0.025 mg/L、CaCl₂▪2H₂O 1000-1480 mg/L、甘露醇 0.5-0.7 M/L、吗啉乙磺酸5-25 mM/L；细胞壁水解酶：纤维素酶 1.0-2.0%、离析酶 0.5-1.0%、果胶酶 0.5-1.0%；HCl 1 M/L和NaOH 1 M/L水溶液用于调节pH值为5.2-5.8。其酶解条件为黑暗条件下25-29℃酶解4-8小时，期间每小时轻柔颠倒混匀一次。

本发明要点三，提供了一种红叶卫矛原生质体DNA染色及倍性分选的方法。胚乳愈伤组织与叶片愈伤组织分别游离原生质体后进行DNA染色，染色液为浓度5-10 μg/ml 的Hoechst 33342，染色时间为3-5 min。原生质倍性分选，原生质体用原生质体洗涤液清洗后，以叶片愈伤组织的原生质体为二倍体对照，在无菌条件下利用流式细胞仪分选胚乳愈伤组织原生质体内的三倍体细胞，使其得到富集，从而提高其后不定芽诱导过程中三倍体植株的再生机率。注：Hoechst 33342为活体DNA染色剂，可特异性结合在DNA双链上，染色后不影响原生质体活力。

本发明要点四，提供了一种红叶卫矛原生质体再生植株的方法，包括三个连续阶段。

阶段1，原生质体培养形成愈伤组织。在无菌条件下将分选的原生质体与含低熔点琼脂糖（凝固点为26~30℃）的原生质体培养基混匀后，倾倒于5cm培养皿内，四等分后，转入含原生质体培养基的9cm培养瓶内。原生质体培养基成分包括上述发明要点一所述的基本培养基、甘露醇 0.5 M、6-BA 0.5-2.0 mg/L、NAA 0.5-1.0 mg/L。黑暗条件下24℃震荡培养；形成愈伤组织块后，将其转接至愈伤组织诱导培养基上。

阶段2，愈伤组织诱导再生不定芽。将愈伤组织接种在不定芽诱导培养基上，在24℃，光照强度36 μmol·m^-2·s^-1，光照时间16 h/d条件下培养8周，诱导形成不定芽。不定芽诱导培养基成分包括上述发明要点一所述的基本培养基；植物生长调节剂6-BA 2.0-6.0 mg/L、IBA 0.1-0.2 mg/L；琼脂0.6-0.8 g/L。

阶段3，不定芽诱导生根形成小植株。不定芽以两步法诱导生根。第一步，不定芽在生根培养基Ⅰ上培养2周。生根培养基Ⅰ为½WPM+硝酸铵0.4-1.0 g/L+蔗糖 20-30 g/L+IBA 1.0-3.0 mg/L ，pH为5.8。第二步，经过第一步培养的不定芽转接至生根培养基Ⅱ上培养4周形成根系。生根培养基Ⅱ成分为½WPM+硝酸铵0.4-1.0 g/L+蔗糖 20-30 g/L+活性炭 2.0-4.0 g/L ，pH为5.8）。

本发明要点五，提供了一种红叶卫矛多倍体细胞获得的小植株顶芽休眠的解除方法。上述红叶卫矛多倍体细胞诱导培养的小植株种植接种在含GA₃ 2.0-4.0 mg/L及6-BA 1.0-2.0 mg/L的上述生根培养基Ⅱ上，置于3-8℃下暗处理30-45d；移至25℃，光照36 μmol·m^-2·s^-1，16 h/d条件下培养15-30 d，顶芽休眠解除率90%以上。

附图说明

图 1为胚乳诱导的愈伤组织；

图 2为愈伤组织游离出的原生质体；

图 3为愈伤组织再生形成的不定芽；

图4为流式细胞术倍性检测峰图，其中200处为二倍体荧光强度，300处为三倍体荧光强度。

图5为芽休眠解除后的生根组培苗。

具体实施方式

实施例一

红叶卫矛胚乳诱导愈伤组织

红叶卫矛（Euonymus alatus ‘Compactus’），在11月下旬采集成熟种子，去除假种皮，清水冲洗30 min，并用70%乙醇浸泡60s，置于含1% 吐温-80及二氯异氰尿酸钠的消毒液（有效氯浓度为1.0%）中震荡处理20 min。无菌水冲洗种子5次，每次3 min。将已消毒的种子接种在含琼脂的半凝固培养基的试管内。7天后筛选无菌种子，在无菌条件下以灭菌（121℃，0.11 MPa，20 min，下同）的解剖刀和镊子去除种皮，将胚及胚乳一同接种在愈伤组织诱导培养基上，24℃下黑暗培养，每两周继代一次。第4周去除胚，胚乳继续黑暗培养，第8周统计愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率可达80%。

实施例二

愈伤组织游离原生质体

红叶卫矛（Euonymus alatus ‘Compactus’）胚乳愈伤组织，选取淡黄色的胚乳愈伤组织，在4℃下暗处理24h，在无菌条件下用灭菌镊子及解剖刀将愈伤组织切片，在电子天平上称取愈伤组织0.5g。将愈伤组织置于含10 ml酶解液的50 ml离心管内，以封口膜封口，27 ℃下黑暗处理4 h，每小时轻柔地颠倒混匀一次。酶处理后，以300目细胞筛过滤，滤液置入新的离心管内并以封口膜封口，用低温离心机离心，离心力为100 g，离心时间为3min。吸弃上清，加入原生质体洗涤液重悬，吸弃-重悬重复三次。将悬浮液定容至500μl，取少许悬浮液，用台盼蓝染色。染色液浓度为0.04%，染色时间为5 min。染色后的悬浮液滴加至细胞计数板上，在显微镜下观察和统计原生质体游离个数及存活率。1 g愈伤组织可游离出2×10⁶ 个原生质体，存活率为91%。

实施例三

原生质体倍性分选与植株再生

红叶卫矛（Euonymus alatus‘Compactus’）原生质体以Hoechst 33342染色液进行染色。染色液浓度为5 μg/ml，染色时间为5 min。100 g离心3 min，吸弃染色液，并用原生质体培养基重悬，重复三次。收集原生质体，在无菌条件下进行流式细胞分选，根据仪器使用说明书分选三倍体原生质体。

将分选所得三倍体原生质体与含低熔点琼脂糖（凝固点为26~30℃），温度为30-40℃的原生质体培养基混匀，倒入直径5 cm的培养皿内。待凝固后，用已灭菌的解剖刀切成四等分，转入含原生质体培养液的直径9 cm的培养瓶内，轻柔震荡培养。待形成愈伤组织块后，将其接种至愈伤组织诱导培养基上，在光照强度36 μmol·m^-2·s^-1，光周期16 h/ 8 h（光/暗）下培养4周，将绿色致密的愈伤组织接种在不定芽诱导培养基上培养，诱导不定芽发生和生长。

取二倍体组培苗叶片与再生不定芽叶片各50mg，置于预冷的5ml塑料培养皿内，并分别加入解离染色液 500 μl。解离染色液包含PI 50 μg/ml、柠檬酸钠 0.1%及Triton-X 100 0.3 μl/ml。于1min内以双面刀片快速切割叶片成碎块，并用200目滤网过滤，滤液置于流式细胞仪上样管内。冰上孵化5min后，上机检测，以二倍体细胞核为对照，检测再生不定芽倍性。对7个再生不定芽进行倍性检测，其中6个样品倍性为三倍体，三倍体所占比率为85.7%。

实施例四

红叶卫矛不定芽生根及芽休眠解除

选取粗壮的株高2-3cm的红叶卫矛三倍体原生质体再生的不定芽，接种于生根培养基Ⅰ上，诱导根原基。2周后转接至生根培养基Ⅱ上，进行根系生长。红叶卫矛的生根组培苗普遍出现芽休眠现象，移栽炼苗成活率低。将生根苗接种于含3.0 mg/L GA3及1.0 mg/L 6-BA的生根培养基Ⅱ上，置于5℃下暗处理30d后，移至25℃下光照培养。芽休眠破除率可达90%以上。