本发明涉及一种细胞冻存试剂，具体涉及一种新型的细胞冻存试剂，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：细胞冻存使用的冻存试剂有含血清和无血清两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，所以无血清冻存技术成为发展的趋势。本发明主要是针对无血清冻存技术进行的研究。现有的细胞冻存试剂，其主要存在以下两方面的问题：一、含有动物成分，使用不安全；二、使用时，需要现用现配，操作不方便，并且容易污染。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型的细胞冻存试剂，其不仅不含动物成分，而且是即用型，细胞计数后，即可直接使用本试剂进行细胞重悬。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一种新型的细胞冻存试剂，其特征在于，各组成成分及用量分别为：本发明的有益之处在于：(1)不含动物成分，使用安全可靠；(2)成分完全明确，便于质量控制；(3)即用型，细胞计数后，即可直接使用本试剂进行细胞重悬，操作更加方便，无需额外配制；(4)适用的细胞类型不限；(5)可以维持细胞在-196℃液氮环境下长期安全保存。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。一、准备各相关试剂表1各组的组成成分及用量现有的细胞冻存试剂，其配方一般为胎牛血清搭配DMEM培养基，同时添加一定量的DMSO，这种配方的冻存试剂含有动物成分，而且需要现用现配，给实际使用带来了很多问题。而在本发明中，我们选用重组人血白蛋白来代替胎牛血清，并将重组人血白蛋白与DMEM培养基按照2:8的体积比混合，此外，为了更好的保持冻存细胞的活性，我们经反复验证，最后选定了重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子和人肝细胞生长因子作为补充成分，为验证最合适的因子浓度，我们进行了上述组分的不同组合，以便验证具体的冻存效果。二、制备方法准备DMEM培养基(购自美国Life公司)、重组人血白蛋白(购自武汉禾元生物)、DMSO(购自美国Sigma公司)、重组人表皮生长因子(购自美国Peprotech公司)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(购自美国Peprotech公司)、重组人肝细胞生长因子(购自美国Peprotech公司)。在百级的无菌操作台里进行相关试剂的配制。重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人肝细胞生长因子的配制按照厂家的说明书进行操作。三、使用方法细胞计数后，直接使用本试剂进行细胞重悬，密度为2×106-5×106/ml，即1.8ml的冻存管中装入1ml细胞悬液。四、冻存效果选用人Hela细胞进行试验。收集足量的人Hela细胞，用前述不同组分组合配制的冻存试剂进行细胞重悬，将符合密度要求(3×106/ml)的细胞装入冻存管。使用程序梯度降温仪给冻存管进行降温，之后转入-196℃液氮环境。冻存一段时间后，进行细胞复苏，观察各组细胞的复苏情况，并计算各组细胞的复苏成活率(简称复苏率)。1、人Hela细胞的形态学观察冻存一周，然后复苏，应用相差显微镜来观察复苏后各组细胞的存活及分化情况，培养3天后计算克隆形成率。经观察，各组细胞的存活及分化情况见表2。表2各组细胞的存活及分化情况存活情况分化情况第1组差出现分化第2组良好未出现分化第3组良好未出现分化第4组良好未出现分化第5组良好未出现分化第6组良好未出现分化第7组良好未出现分化第8组良好未出现分化第9组良好未出现分化经计算，各组细胞的克隆形成率见表3。表3各组细胞的克隆形成率2、人Hela细胞的特性测定冻存一周，然后复苏，测定人Hela细胞的特性。测定结果显示：(1)人Hela细胞保持了很高的增殖活力。(2)人Hela细胞形态稳定，没有发生重大变化。3、人Hela细胞的安全冻存时间测定冻存一周、一个月、两年，然后复苏，计算各组细胞的复苏率。计算结果见表4。表4各组细胞的复苏率由表4可知：(1)冻存一周，第3组冻存试剂的冻存效果最好，细胞复苏率高达95％，而第1组冻存试剂的细胞复苏率仅为50％；(2)冻存一个月，还是第3组冻存试剂的冻存效果最好，细胞复苏率高达95％，而第1组冻存试剂的细胞复苏率仅为40％；(3)冻存两年，还是第3组冻存试剂的冻存效果最好，细胞复苏率高达93％，而第1组冻存试剂的细胞复苏率仅为30％。以上试验结果说明：本发明的细胞冻存试剂可以维持细胞在-196℃液氮环境下长期安全保存。本发明的细胞冻存试剂，通过添加三种重组生长因子(重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人肝细胞生长因子)以及重组人血白蛋白，可以摆脱使用牛血清来进行细胞冻存，添加的三种重组生长因子很好的弥补了单纯用重组人血白蛋白取代牛血清带来的相关问题。五、适用的细胞类型选用PBMC细胞、MSC细胞、CIK细胞、NK细胞、293细胞、HUVEC细胞、成纤维细胞、人ES细胞、人iPS细胞共计9种不同类型的细胞进行试验。选用冻存效果最好的第3组冻存试剂。采用与第四步相同的试验方法进行试验。试验结果见表5。表5针对不同类型的细胞冻存试剂的冻存效果细胞名称一周后细胞复苏率PBMC细胞90％MSC细胞98％CIK细胞96％NK细胞90％293细胞97％HUVEC细胞89％成纤维细胞96％人ES细胞85％人iPS细胞87％由表5可知：对于不同类型的细胞，使用本发明的细胞冻存试剂冻存一周，细胞复苏率最小的也能达到85％。以上试验结果说明：本发明的细胞冻存试剂适用的细胞类型不限。需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页1 2 3