一种大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法与流程

本发明涉及一种利用大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法，属淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存的技术领域。

背景技术：

大理裂腹鱼(Schizothorax taliensis)隶属于鲤科裂腹鱼亚科裂腹鱼属，原是洱海特产的经济鱼类，历史上占洱海渔获物30％。上世纪70年代由于洱海水位下降，数十条河沟、鱼洞干涸，大理裂腹鱼失去产卵场，且外来种的引入，大量吞食大理裂腹鱼的鱼卵，加之，酷鱼滥捕使大理裂腹鱼数量锐减。从中国科学院昆明动物研究所鱼类标本库采集记录看，自从1973年最后一次被采集后，已经43年没有发现大理裂腹鱼，在学术界上一致认为大理裂腹鱼从大理洱海流域灭绝。大理裂腹鱼1989年被列为国家II级保护动物，在《中国濒危动物红皮书(鱼类)》中被列为濒危等级，为保护这一珍稀物种地方政府制定了《洱海管理条例》。大理裂腹鱼生活在静水环境的中上层，食物以浮游生物为主，产卵时要求流水环境，每年4-5月繁殖季节，亲鱼溯水上游到沙砾底河床的河流或湖底地下水出口处产卵。卵需在流水中孵化。

为保护和了解大理裂腹鱼的生存状况，自上世纪九十年代以来，中国科学院昆明动物研究所多次组队至大理洱海、西洱河、弥苴河等地开展调查，直至2016年5月才发现大理裂腹鱼的踪迹。但因大理裂腹鱼种群数量较少，且不易获得，因此，如何保护和保存这一珍稀鱼类的种质资源成为现今亟待解决的问题。塘养环境下，因培育时间太短，大理裂腹鱼还不能实现人工繁殖，因此，通过保存其精子、卵子、胚胎、个体等来保存其种质资源的方法已不可行，所以发明人将目光投向了大理裂腹鱼的体细胞培养。

已知的脊椎动物中48％是鱼类，鱼类细胞作为组织细胞模型，应用于多门生物医学学科，是巨大的资源宝库。鱼类细胞培养起于1962年，发展至今已建立了280余株细胞系，中国的鱼类细胞培养历经30多年共建立鱼类细胞系70余株，来源于40多种鱼类，建立细胞系的物种不足中国鱼类总数的1.5％(中国鱼类超过3500种)。由此可见，细胞系的构建速度是非常缓慢的，关注度不够、参与的工作者较少可能是其原因之一；其次，相较于哺乳动物细胞培养，鱼类细胞培养中更易发生污染，导致失败率上升，而现有的专利或文章中大多将这一现象归结为技术不过关，而嫌少注重鱼体本身的质量问题，在大理裂腹鱼细胞培养实践中，鱼体的生活状态也直接影响了细胞系构建的成败；另外，因大理裂腹鱼野外生境的局限性，对其生活习性的了解较少，这也在一定程度上加大了大理裂腹鱼细胞培养的难度。经文献检索，未见与本发明的相同报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种操作简便易行的大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法，以满足对大理裂腹鱼种质资源保存和高原适应性研究的需要。

具体地，本发明提供一种大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

1)大理裂腹鱼肾脏的获取：先用10-20mg/L的高锰酸钾浸泡消毒大理裂腹鱼鱼体10-20分钟，再用80-100ppm的MS-222麻醉大理裂腹鱼鱼体；再以75％酒精擦拭鱼体后，取其肾脏，加入PBS消毒液清洗大理裂腹鱼鱼体的肾脏组织；

2)原代培养：将通过步骤1)获得的肾脏组织剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，在18-20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在18-20℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第10-12天细胞开始从组织块中迁移，30-40天长成细胞单层，则原代肾脏细胞；

3)传代培养：原代肾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养液，以含0.1-0.2％的胰蛋白酶-EDTA的胰酶消化法传代悬起细胞，加入传代培养液1-2mL以中和胰酶反应，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于18-20℃培养箱中继续培养；每5-7天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，所述大理裂腹鱼肾脏细胞系建立成功。

进一步地，所述PBS消毒液为含有浓度为含有浓度为100-300IU/mL的青霉素、浓度为100-300μg/mL的链霉素以及浓度为20-40μg/mL的两性霉素B的混合溶液。

进一步地，所述的基础培养液为含有浓度为6-10ng/mL的bFGF和占总体积的10-15％的胎牛血清的L-15或DMEM/F12培养液的混合溶液。

进一步地，所述的原代培养液为含有浓度为6-10ng/mL的bFGF、占总体积的15-20％的胎牛血清、浓度为200-300IU/mL的青霉素、浓度为200-300μg/mL的链霉素以及浓度为20-40μg/mL的两性霉素B的L-15或DMEM/F12培养液的混合溶液。

进一步地，所述的传代培养液为含有浓度为6-10ng/mL的bFGF、占总体积的15-20％的胎牛血清、浓度为100-200IU/mL的青霉素、浓度为100-200μg/mL的链霉素以及浓度为15-20μg/mL的两性霉素B的L-15或DMEM/F12培养液。

进一步地，所述原代培养液、传代培养液和基础培养液的pH值均为7.0-7.2。

进一步地，所述原代培养液、传代培养液和基础培养液的渗透压均为280-300mOsm/L。

进一步地，所述构建方法还包括如下细胞冻存与复苏的步骤：1)配制细胞冻存液：冻存液包括L-15或DMEM/F12培养液、胎牛血清和DMSO，按3：6：1的体积比混合，现用现配；2)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液800-1200rpm离心6-10分钟，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/mL，将1mL细胞悬液转移至1.8mL冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃放置24-48小时，然后放入液氮中长期保存；3)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入30℃水浴锅中快速摇晃至融化；然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15mL离心管中，并加入等量基础培养液，800-1000rpm离心6-8分钟，除上清液；用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，18-20℃培养箱中培养，8-10天细胞即长成单层。

本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。

本发明的显著效果在于：

1.本发明的构建方法操作简便易行，并且构建方法具有重复性，构建的细胞系稳定性好。

2.相对于用于核型分析的血液短期培养，采用本发明的构建方法获得的肾脏组织块中刚迁移出来的细胞具有活性，且细胞量大，可用于染色体分析。

3.与其它细胞系相比，用本发明的构建方法获得的肾脏细胞系原代培养中组织块污染率较低，从而提高了成功率。

4.本发明构建的大理裂腹鱼肾脏细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对大理裂腹鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要。

5.用本发明的构建方法获得的大理裂腹鱼肾脏细胞是大理裂腹鱼的首个细胞系，为研究高原鱼类对高原环境的适应性提供了很好的素材，奠定了高原适应性研究的基础。

附图说明

图1是显示大理裂腹鱼原代培养中肾脏组织迁移出细胞的过程的图。

图2是显示大理裂腹鱼原代培养中肾脏细胞单层的图。

图3是示出不同消毒方式对大理裂腹鱼肾脏组织块细胞迁移的影响的图。

图4是示出不同培养液对大理裂腹鱼肾脏细胞生长的影响的图。

具体实施方式

从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。

实施例1

1.制备PBS消毒液和细胞培养液

PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素的浓度为300IU/mL，链霉素浓度为300μg/mL，两性霉素B浓度为20μg/mL。

基础培养液：向L-15培养液中加入bFGF和胎牛血清，使bFGF的浓度为10ng/mL，胎牛血清占总体积的20％。

原代培养液：向L-15培养液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的浓度为10ng/mL，胎牛血清占总体积的20％，青霉素的浓度为250IU/mL，链霉素浓度为250μg/mL，两性霉素B浓度为40μg/mL。

传代培养液：向L-15培养液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的浓度为10ng/mL，胎牛血清占总体积的20％，两性霉素B浓度为20μg/mL。

调节上述培养液的pH值为7.0，渗透压为300mOsm/L，放置于4℃冰箱中保存备用。

2.原代培养

先用20mg/l的高锰酸钾浸泡消毒大理裂腹鱼鱼体10分钟，再用80ppm的MS-222麻醉大理裂腹鱼。再以75％酒精擦拭鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其肾脏，置于12孔板中，用PBS消毒液清洗肾脏组织5次，剪成组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中，在18℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液3mL，在18℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第11天细胞开始从组织块中迁移(图1)，40天长成细胞单层(图2)。

3.传代培养

原代肾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代。传代培养具体方法如下：先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.15％的胰蛋白酶-EDTA溶液2mL，消化3分钟，细胞变圆后，加入传代培养液2mL以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于18℃培养箱中继续培养；每6天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。

4.细胞冻存与复苏

(a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括L-15培养液、胎牛血清和DMSO，按3：6：1的体积比混合，现用现配。

(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液800rpm离心10分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/mL，将1mL细胞悬液转移至1.8mL冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃放置24小时，然后放入液氮中长期保存。

(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入30℃水浴锅中快速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15mL离心管中，并加入等量基础培养液，800rpm离心8分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，18℃培养箱中培养，9天细胞即长成单层。

实施例2

1.制备PBS消毒液和细胞培养液

PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素的浓度为250IU/mL，链霉素浓度为250μg/mL，两性霉素B浓度为30μg/mL。

基础培养液：向DMEM/F12培养液中加入bFGF和胎牛血清，使bFGF的浓度为10ng/mL，胎牛血清占总体积的15％。

原代培养液：向DMEM/F12培养液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的浓度为10ng/mL，胎牛血清占总体积的15％，青霉素的浓度为200IU/mL，链霉素浓度为200μg/mL，两性霉素B浓度为30μg/mL。

传代培养液：向DMEM/F12培养液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的浓度为10ng/mL，胎牛血清占总体积的15％，两性霉素B浓度为20μg/mL。

调节上述培养液的pH值为7.0，渗透压为300mOsm/L，放置于4℃冰箱中保存备用。

2.原代培养

先用10mg/l的高锰酸钾浸泡消毒大理裂腹鱼鱼体20分钟，再用100ppm的MS-222麻醉大理裂腹鱼。再以75％酒精擦拭鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其肾脏，置于12孔板中，将肾脏组织用PBS消毒液清洗3次，剪成组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中，在20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液5mL，在20℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第10天细胞开始从组织块中迁移，35天长成细胞单层。

3.传代培养

原代肾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代。传代培养具体方法如下：先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.2％的胰蛋白酶-EDTA溶液1mL，消化2分钟，细胞变圆后，加入传代培养液1.5mL以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于20℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。

4.细胞冻存与复苏

(a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括DMEM/F12培养液、胎牛血清和DMSO，按3：6：1的体积比混合，现用现配。

(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心6分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/mL，将1mL细胞悬液转移至1.8mL冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃放置48小时，然后放入液氮中长期保存。

(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入30℃水浴锅中快速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15mL离心管中，并加入等量基础培养液，1000rpm离心6分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20℃培养箱中培养，6天细胞即长成单层。

实施例3

1.制备PBS消毒液和细胞培养液

PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素的浓度为200IU/mL，链霉素浓度为200μg/mL，两性霉素B浓度为40μg/mL。

基础培养液：向L-15培养液中加入bFGF和胎牛血清，使bFGF的浓度为400μg/mL，胎牛血清占总体积的10％。

原代培养液：向L-15培养液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的浓度为8ng/mL，胎牛血清占总体积的15％，青霉素的浓度为200IU/mL，链霉素浓度为200μg/mL，两性霉素B浓度为20μg/mL。

传代培养液：向L-15培养液中加入bFGF、胎牛血清和抗生素，使bFGF的浓度为8ng/mL，胎牛血清占总体积的10％，两性霉素B浓度为30μg/mL。

调节上述培养液的pH值为7.0，渗透压为300mOsm/l，放置于4℃冰箱中保存备用。

2.原代培养

先用15mg/l的青霉素浸泡消毒大理裂腹鱼鱼体15分钟，再用100ppm的MS-222麻醉大理裂腹鱼。再以75％酒精擦拭鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其肾脏，置于12孔板中，将肾脏组织用PBS消毒液清洗4次，剪成组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中，在18℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液4mL，在18℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第11天细胞开始从组织块中迁移，35天长成细胞单层。

3.传代培养

原代肾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.15％的胰蛋白酶-EDTA溶液1.5mL，消化2分钟，细胞变圆后，加入传代培养液1.5mL以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于18℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。

4.细胞冻存与复苏

(a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括L-15培养液、胎牛血清和DMSO，按3：6：1的体积比混合，现用现配。

(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1000rpm离心8分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/mL，将1mL细胞悬液转移至1.8mL冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃放置36小时，然后放入液氮中长期保存。

(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15mL离心管中，并加入等量基础培养液，800rpm离心8分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，18℃培养箱中培养，8天细胞即长成单层。

实施例4

对实施例3的大理裂腹鱼的鱼体采用不同消毒方法进行比较。

将实施例3中的大理裂腹鱼分别采用最常见的高锰酸钾浸泡消毒、亚甲基蓝浸泡消毒、酒精直接消毒、亚甲基蓝+酒精联合消毒和高锰酸钾+酒精联合消毒的方式，其他步骤与实施例3中的步骤相同。结果显示(参见图1)，在整个原代培养过程中，亚甲基蓝浸泡消毒和亚甲基蓝+酒精联合消毒都表现出较低的组织块细胞迁移率，且随着培养天数的增加，某些迁移出细胞的组织块会脱落而不会再重新贴壁迁移出细胞；在原代培养的初期，高锰酸钾浸泡消毒和酒精直接消毒表现出较高的组织细胞迁移率，但随着培养时间的延长，出现了组织块污染的情况，导致组织块脱落，无法挽救；高锰酸钾+酒精联合作用下，组织块表现出较高的细胞迁移率，且随着培养时间的增加，迁移出细胞的组织块越来越多，脱落的组织块较少。

因此，对于大理裂腹鱼而言，亚甲基蓝的毒性较大，无论亚甲基蓝浸泡消毒还是亚甲基蓝+酒精联合消毒，虽能保证组织块不发生污染，但对组织块的损伤较大，细胞不易迁出，而酒精直接消毒和高锰酸钾浸泡消毒往往发生污染，培养无法继续，高猛酸钾+酒精联合消毒的方式是更为适合的。

实施例5

对实施例3的细胞培养液的基液采用不同的培养液进行比较。

将实施例3中的培养液替换成鱼类细胞培养常用的几种培养液DMEM、DMEM(高糖)、DMEM/F12、L-15、M199、M1640，对比这些不同培养液对大理裂腹鱼肾脏细胞生长的影响(参见图2)，结果显示，不同培养液条件下，细胞的生长速率不同，贴壁率也不同。细胞培养1天后，L-15和DMEM/F12的贴壁细胞较多，而DMEM、DMEM(高糖)、M199和M1640培养液贴壁的细胞较少；随着培养时间的增加，L-15和DMEM/F12的细胞数量逐渐增加，L-15的细胞数量高于DMEM/F12；L-15的细胞数量约为DMEM、DMEM(高糖)和M199细胞数量的两倍；M1640为培养液时，细胞数量虽略有增加，但一直维持在较低水平。

因此，对于大理裂腹鱼肾脏细胞而言，L-15的效果最好，其次是DMEM/F12，其他四种培养液并不适合细胞生长。

本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。