一种脐带组织冻存液及冻存方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种脐带组织冻存液及冻存方法。

背景技术：

脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，其外被羊膜，内含2条脐动脉和1条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织-华尔通氏胶(Whartonps Jelly)，从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)。脐带间充质干细胞是一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。

脐带组织在4℃条件下最多能保存6天，保存超过48h再对脐带组织进行原代分离培养得到脐带间充质干细胞的概率会大大减低。现有的脐带组织冻存液不能提供丰富的营养物质及保护剂，不利于长时间冻存脐带组织。因此，研发一种能长时间冻存脐带组织的冻存液是本领域技术人员需要解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明公开了一种脐带组织冻存液，所述脐带组织冻存液能对脐带组织进行长期保存。

本发明公开了一种脐带组织冻存液，包括以下组分：

优选地，所述脐带组织冻存液，包括以下组分：

非必需氨基酸(MEM NEAA)，包括丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸等。“非必需”并非人体不需要这些氨基酸，而是人体可以通过自身合成或从其它氨基酸转化来得到，不一定非从食物中摄取。有些非必需氨基酸的摄入量，还可影响必需氨基酸的需要量。例如，当膳食中半胱氨酸和酪氨酸充裕时，可分别节省对蛋氨酸和苯丙氨酸的需要。因此，半胱氨酸和酪氨酸又被称为半必需氨基酸或条件必需氨基酸。非必需氨基酸可在动物体内合成，作为营养源不需要从外部补充的氨基酸。一般在植物、微生物必需的氨基酸均由自身合成，这些都称为非必需氨基酸。对人来说非必需氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。这些氨基酸由碳水化合物的代谢物或由必需氨基酸合成碳链，进一步由氨基转移反应引入氨基生成氨基酸。已知即使摄取非必需氨基酸，也是对生长有利的。

优选的，本发明所述非必需氨基酸是GIBCO公司的NEAA，货号是11140-050。

右旋糖酐系蔗糖经肠膜状明串珠菌-1226(Leuconostoc mesenteroides)发酵合成的一种高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血浆代用品之一。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品，用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。低、小分子右旋糖酐，能改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓形成等，亦有扩充血容量作用，但作用较中分子右旋糖酐短暂；用于各种休克所致的微循环障碍、弥漫性血管内凝血、心绞痛、急性心肌梗塞及其他周围血管疾病等。

作为优选，所述右旋糖酐为中分子右旋糖酐、低分子右旋糖酐或小分子右旋糖酐。

乙酰胺为无色晶体，溶于水和乙醇。熔点82.3℃，沸点221.2℃，相对密度0.9986(85/4℃)。极纯的乙酰胺没有气味，商品乙酰胺有臭味，这是含有少量杂质的缘故。工业上乙酰胺是由乙酸铵150～200℃加热失水制备。乙酰胺具有酰胺的一般性质，广泛用作有机物和无机物的溶剂，具有微弱碱性，可做清漆、炸药和化妆品的抗酸剂。还可作染色的润湿剂、塑料的增塑剂，也是制造药物和杀菌剂的原料。乙酰胺氯化或溴化生成的N-卤代乙酰胺，是有机合成的卤化试剂。

聚乙烯吡咯烷酮简称PVP，是一种非离子型高分子化合物，是N-乙烯基酰胺类聚合物中最具特色且被研究得最深、最广泛的精细化学品品种。已发展成为非离子、阳离子、阴离子3大类，工业级、医药级、食品级3种规格，相对分子质量从数千至一百万以上的均聚物、共聚物和交联聚合物系列产品。

对本发明公开的脐带组织冻存液进行脐带组织冻存试验，结果显示经所述脐带组织冻存液长时间冻存复苏后的脐带组织分离出的脐带间充质干细胞与未冻存前进行原代分离得到的脐带间充质干细胞的形态未发生变化，且流式分析显示细胞表型也未发生变化，体外诱导分化检测显示经冻存复苏后分离得到的脐带间充质干细胞仍具有良好的分化能力。

综上所述，本发明公开的脐带组织冻存液能对脐带组织进行长期冻存。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示从脐带组织正常分离的脐带间充质干细胞P0代的倒置显微镜观察图，其中图A为40倍，图B为100倍；

图2示经实施例1制备的脐带组织冻存液冻存复苏后分离的脐带间充质干细胞P0代的倒置显微镜观察图，其中图A为40倍，图B为100倍；

图3示实施例1制备的脐带组织冻存液冻存复苏后分离得到的脐带间充质干细胞流式结果图；

图4示未经冻存的脐带组织直接分离得到的脐带间充质干细胞流式结果图；

图5示经实施例1制备的脐带组织冻存液冻存后分离得到的脐带间充质干细胞成脂效果图，其中图A为100倍放大，图B为200倍放大，图C为400倍放大；

图6示新鲜脐带组织块原代分离得到的脐带间充质干细胞成脂效果图，其中图A为100倍放大，图B为200倍放大，图C为400倍放大；

图7示新鲜脐带组织块原代分离得到的脐带间充质干细胞正常培养其中图A为100倍放大，图B为200倍放大，图C为400倍放大。

具体实施方式

本发明公开了一种脐带组织冻存液，所述脐带组织冻存液能对脐带组织进行长期冻存。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

如无特殊说明，本发明所述的成分和制剂均为市售或自制来源。如实施例中非必需氨基酸为GIBCO公司的NEAA，货号是11140-050。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1制备脐带组织冻存液

在无菌条件下按如下体积百分比配制脐带组织冻存液：

实施例2制备脐带组织冻存液

在无菌条件下按如下体积百分比配制脐带组织冻存液：

实施例3制备脐带组织冻存液

在无菌条件下按如下体积百分比配制脐带组织冻存液：

对比例1

在无菌条件下配制传统细胞用冻存液，配方为：80mlFBS+20mlDMSO。

实施例4脐带组织冻存试验

采集脐带20条(均经过产妇授权同意，胎儿均足月生产且产妇无传染性疾病)，将脐带平均截断，一段进行原代分离，得到的脐带间充质干细胞传代后冻存P2代细胞；另一段剥离出纯华通式胶后剪碎成1～2mm³的组织块，并分成两部分，一部分用实施例1制备的脐带组织冻存液进行冻存，另一部分用对比例1制备的传统冻存液进行冻存。

对从脐带组织正常分离的脐带间充质干细胞在倒置显微镜下观察，如图1所示，人脐带间充质干细胞呈贴壁生长，为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长。

将脐带组织冻存6个月后进行复苏，采用同样的原代分离方法对复苏的脐带组织进行脐带间充质干细胞原代分离，脐带间充质干细胞原代分离情况统计如下：

表1脐带间充质干细胞原代分离情况统计结果

对脐带组织复苏后分离得到的脐带间充质干细胞进行倒置显微镜观察，如图2所示，复苏后分离得到的P0代细胞与未经冻存直接进行原代分离的脐带干细胞形态一致。说明实施例1制备的脐带组织冻存液对脐带组织的冻存效果要优于对比例1。用实施例2和实施例3制备的脐带组织冻存液重复上述试验，得到同样的结论。

将经实施例1制备的脐带组织冻存液冻存复苏后进行原代分离得到的脐带间充质干细胞培养至第3代细胞，消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，用流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表达情况，并与未经冻存的脐带组织直接分离得到的脐带间充质干细胞进行比较，流式结果如图3-4、表2-3所示。

表2实施例1制备的脐带组织冻存液冻存复苏后分离得到的脐带间充质干细胞流式结果

表3未经冻存的脐带组织直接分离得到的脐带间充质干细胞流式结果

流式细胞学检测显示，人脐带间充质干细胞不表达造血细胞标记CD34，CD45，CD11，HLA-DR和CD19，而整合素和黏附分子CD90以及常用的人间充质干细胞标记CD73、CD105则均呈高表达，两组无异。

用实施例2和实施例3制备的脐带组织冻存液重复该试验，得到同样的结论。

将经实施例1制备的脐带组织冻存液冻存复苏后进行原代分离得到的脐带间充质干细胞培养至第3代细胞，按2.5×10⁴细胞浓度接种于含有DMEM/F12+20％FBS培养基的24孔板中，至细胞80％融合时，更换为含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培养液，每周换液2次，3周后用多聚甲醛固定，油红O染色。同样新鲜脐带组织块原代分离得到的脐带间充质干细胞，进行成脂诱导分化试验，多聚甲醛固定，油红O染色，同时以新鲜脐带组织块原代分离得到的脐带间充质干细胞正常培养不进行成脂诱导培养作为对照。结果见图5-7。

结果显示，经实施例1制备的脐带组织冻存液冻存后分离得到的脐带间充质干细胞和新鲜脐带组织块原代分离得到的脐带间充质干细胞均可以形成脂肪细胞，油红O染色发现新鲜脐带组织块原代分离得到的脐带间充质干细胞细胞浆充满了油滴空泡，说明经实施例1制备的脐带组织冻存液冻存后的脐带组织块得到的细胞具有正常的分化能力。

用实施例2和实施例3制备的脐带组织冻存液重复该试验，得到同样的结论。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。