本发明涉及一种金花茶无菌外植体的获得方法。
背景技术：
金花茶(Camellia nitidissima)属山茶科山茶属的植物，为常绿灌木或小乔木，为世界珍稀观赏植物。山茶科植物的花色丰富，有红、白、复色等，但过去一直缺少黄花颜色。最早记载的黄色花山茶是1916年Pitard根据特产于越南北部的标本命名为Thea flava Pitard(黄花茶)，1933年首次在广西防城采到金花茶标本，1948年戚经文先生发表定名为Camellia nitid issima Chi，以后较长时期内未引起广泛的重视。直到1965年分类学家胡先骕以南宁药物研究所的标本发表了金花茶(命名为Theopsis chrysantha Hu)后才逐渐受到重视。金花茶的发现引起了国内外植物学界和园艺学界的关注，尤其引起国际山茶学会的高度重视。1981年被列入国家一级保护植物，被誉为“植物界大熊猫”、“茶族皇后”。
金花茶具有较高的观赏价值、营养价值和药用价值，其叶、花可入药；此外，金花茶含有特殊的色泽遗传基因，具有重要的科研价值。近年来，金花茶逐渐受到市场的关注，尤其是其自身具备的药用价值使其在市场的开发利用逐渐活跃起来，前景十分广阔。但因金花茶苗木资源紧缺，极大影响了开发应用。
金花茶自然分布狭窄，资源稀缺，同时种子结实率低，自繁能力差，生长速度慢。为加强金花茶的种质资源保存加快种苗繁育，通过人工繁育及栽培，可大力发展金花茶种植业，充分发挥金花茶种质资源的应有价值。金花茶的人工繁育以枝条扦插为主，枝条需求大且成活率低，繁殖速度很慢，远远满足不了市场的需要。而组培快繁是有效获得大量优质种苗的途径之一，也是种植资源保存的重要手段。当前有关金花茶的组培快繁研究很多，其外植体以茎尖、茎段、叶片为主，这对于珍贵的金花茶资源来说，在一定程度上对母株有所损害，违背了种质资源保存的初衷。以种子为外植体，常规的方法是：将种子进行消毒灭菌后接种于不同的萌发培养基中，这种方法获得的外植体时间较长，成本较高。
技术实现要素：
基于以上现有技术的不足，本发明所解决的技术问题在于提供一种萌发时间短、萌发率高、成本低、获得外植体时间短的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种金花茶无菌外植体的获得方法，包含如下步骤：
步骤一、河沙的高温灭菌，取河沙在压力为0.05～0.2Mpa、温度为90～140℃的条件下灭菌30～40min，自然冷却；
步骤二、蒸馏水的高温灭菌，取蒸馏水在压力为0.05～0.2Mpa、温度为90～140℃℃的条件下灭菌30～40min，自然冷却；
步骤三、种子的消毒灭菌，选取饱满的种子，先用中性洗涤剂浸泡20～30min后，在流水下冲洗40～60min，然后转入超净工作台上，用75％酒精浸泡种子40～60s，无菌水冲洗2～5次；再用0.1％升汞浸泡16～20min，同时轻轻震荡种子，使升汞与种子充分接触，最后用无菌水冲洗2～5次；
步骤四、无菌播种，将经过消毒灭菌的金花茶种子装入盛有无菌水的组培瓶中浸泡18～36h，使其充分吸胀，然后在超净工作台上，取出金花茶种子的胚乳，将胚乳播入灭菌后的沙子中，向沙子中倒入无菌水使沙子湿润，确保沙子将胚乳完全埋入；
步骤五、外植体的获得，将步骤四播种后的胚乳在温度为21～25℃、沙子湿润的条件下培养，出芽的小苗直接转入金花茶的继代培养基中培养。
作为上述技术方案的优选实施方式，本发明实施例提供的金花茶无菌外植体的获得方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述步骤一中，将河沙装入组培瓶中，沙子体积为组培瓶容积的1/2，然后在压力为0.05～0.2Mpa、温度为90～140℃的条件下灭菌30～40min，自然冷却。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述步骤一中，在组培瓶中装入蒸馏水，蒸馏水体积为组培瓶容积的1/2，在压力为0.05～0.2Mpa、温度为90～140℃℃的条件下灭菌30～40min，自然冷却。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述一种金花茶无菌外植体的获得方法，其特征在于,包含如下步骤：
步骤一、河沙的高温灭菌，取河沙在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌30～40min，自然冷却；
步骤二、蒸馏水的高温灭菌，取蒸馏水在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌30～40min，自然冷却；
步骤三、种子的消毒灭菌，选取饱满的种子，先用中性洗涤剂浸泡20～30min后，在流水下冲洗40～60min，然后转入超净工作台上，用75％酒精浸泡种子40～60s，无菌水冲洗3次；再用0.1％升汞浸泡16～20min，同时轻轻震荡种子，使升汞与种子充分接触，最后用无菌水冲洗3次；
步骤四、无菌播种，将经过消毒灭菌的金花茶种子装入盛有无菌水的组培瓶中浸泡24h，使其充分吸胀，然后在超净工作台上，取出金花茶种子的胚乳，将胚乳播入灭菌后的沙子中，向沙子中倒入无菌水使沙子湿润，确保沙子将胚乳完全埋入；
步骤五、外植体的获得，将步骤四播种后的胚乳在温度为21～25℃、沙子湿润的条件下培养，出芽的小苗直接转入金花茶的继代培养基中培养。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述步骤一中，将河沙装入组培瓶中，沙子体积为组培瓶容积的1/2，然后在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌30～40min，自然冷却。
作为上述技术方案的改进，在本发明的一个实施例中，所述步骤一中，在组培瓶中装入蒸馏水，蒸馏水体积为组培瓶容积的1/2，在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌30～40min，自然冷却。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：操作简单，设计合理，该金花茶无菌外植体的获得方法萌发时间短、萌发率高、成本低、获得外植体时间短、在金花茶种子萌发阶段以沙子替代培养基来进行种子的萌发，具有成本低，萌发时间短的优点。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，详细说明如下。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。
萌发率(％)＝种子萌发数/播种数×100％。
实施例1
2015年1月15日，选择成熟、饱满、规格一致的种子作为实验材料。将河沙装入组培瓶中(体积为组培瓶容积的1/2)，在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌30min。自然条件下冷却。在组培瓶中装入蒸馏水(体积为组培瓶容积的1/2)。在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌30min。自然条件下冷却。将50粒种子先用中性洗涤剂浸泡20min后，在流水下冲洗40min。然后转入超净工作台上，用75％酒精浸泡种子40s，无菌水冲洗3次；再用0.1％升汞浸泡16min，此操作过程中轻轻震荡种子，使升汞很好地接触种子，最后用无菌水冲洗3次。将经过消毒灭菌的金花茶种子装入盛有无菌水的组培瓶中浸泡24h，使其充分吸胀。然后在超净工作台上，用解剖刀切开果实，取出种子，剥去种皮，取出胚乳，将胚乳播入沙子中，并倒入少量无菌水使沙子湿润，确保沙子将胚乳完全埋入。播种完毕，即可将培养材料移入培养室进行培养，培养温度为21～25℃。培养期间应不定期检查沙子的湿润程度，若过于干燥，应及时向组培瓶中添加无菌水至沙子湿润为止。第25d检查种子萌发，其中有45粒种子发芽，萌发率为90.00％。出芽后的小苗可直接转入金花茶的继代培养基中。
实施例2
2015年1月19日，选择成熟、饱满、规格一致的种子作为实验材料。将河沙装入组培瓶中(体积为组培瓶容积的1/2)，在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌35min。自然条件下冷却。在组培瓶中装入蒸馏水(体积为组培瓶容积的1/2)。在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌35min。自然条件下冷却。将50粒种子先用中性洗涤剂浸泡25min后，在流水下冲洗50min。然后转入超净工作台上，用75％酒精浸泡种子50s，无菌水冲洗3次；再用0.1％升汞浸泡18min，此操作过程中轻轻震荡种子，使升汞很好地接触种子，最后用无菌水冲洗3次。将经过消毒灭菌的金花茶种子装入盛有无菌水的组培瓶中浸泡24h，使其充分吸胀。然后在超净工作台上，用解剖刀切开果实，取出种子，剥去种皮，取出胚乳，将胚乳播入沙子中，并倒入少量无菌水使沙子湿润，确保沙子将胚乳完全埋入。播种完毕，即可将培养材料移入培养室进行培养，培养温度为21～25℃。培养期间应不定期检查沙子的湿润程度，若过于干燥，应及时向组培瓶中添加无菌水至沙子湿润为止。第22d检查种子萌发，其中有42粒种子发芽，萌发率为84.00％。出芽后的小苗可直接转入金花茶的继代培养基中。
实施例3
2015年1月22日，选择成熟、饱满、规格一致的种子作为实验材料。将河沙装入组培瓶中(体积为组培瓶容积的1/2)，在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌40min。自然条件下冷却。在组培瓶中装入蒸馏水(体积为组培瓶容积的1/2)。在压力为0.1013Mpa、温度为121℃的条件下灭菌40min。自然条件下冷却。将50粒种子先用中性洗涤剂浸泡30min后，在流水下冲洗60min。然后转入超净工作台上，用75％酒精浸泡种子60s，无菌水冲洗3次；再用0.1％升汞浸泡20min，此操作过程中轻轻震荡种子，使升汞很好地接触种子，最后用无菌水冲洗3次。将经过消毒灭菌的金花茶种子装入盛有无菌水的组培瓶中浸泡24h，使其充分吸胀。然后在超净工作台上，用解剖刀切开果实，取出种子，剥去种皮，取出胚乳，将胚乳播入沙子中，并倒入少量无菌水使沙子湿润，确保沙子将胚乳完全埋入。播种完毕，即可将培养材料移入培养室进行培养，培养温度为21～25℃。培养期间应不定期检查沙子的湿润程度，若过于干燥，应及时向组培瓶中添加无菌水至沙子湿润为止。第19d检查种子萌发，其中有40粒种子发芽，萌发率为80.00％。出芽后的小苗可直接转入金花茶的继代培养基中。
结果：萌发率可达80.00～90.00％，萌发时间为19～25d。
本发明的金花茶无菌外植体的获得方法操作简单，设计合理，该金花茶无菌外植体的获得方法萌发时间短、萌发率高、成本低、获得外植体时间短、在金花茶种子萌发阶段以沙子替代培养基来进行种子的萌发，具有成本低，萌发时间短的优点。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。