一种防治柑橘黄龙病的方法及试剂套装与流程

本发明属于农业植物种植领域，具体涉及一种防治柑橘黄龙病的方法及试剂套装。

背景技术：

黄龙病是一种广泛蔓延、且危害极大的柑橘病害，广泛发生在40多个国家和地区，主要分布在亚洲、大洋洲、非洲、和美洲。美国、佛罗里达州、柑桔生产的主要基地，黄龙病严重爆发，约50%以上的柑橘树被感染了柑橘黄龙病。黄龙病病原是由柑橘木虱Diaphorina citri传播的，病原菌主要存在于柑橘树的韧皮部，结果如黄脉硬化症状，柑橘树叶片发生斑驳和黄化，有时会被认为是锌或镁缺乏。染病植物的典型症状包括黄脉硬化、斑块和斑点、黄化叶和果实小，根部发黑腐烂果实不能成熟，且果实为苦和酸性，经济价值大大降低，给果农造成巨大经济损失。目前砍除黄龙病病树、化学农药防止柑橘木虱和培养无毒苗是控制柑桔黄龙病发生的主要防治措施，在世界范围内，黄龙病给柑橘果农产生的损失高达上千万，极大地威胁着柑橘产业，这引起了世界各国政府的强烈关注。

在中国，黄龙病发病日趋严重，究其原因，柑橘果园中速效氮肥的大量使用造成土壤酸化是导致黄龙病爆发力度逐年上述的主要原因之一，据数据调查显示，大多数柑橘品种需要在pH5-7条件下才能较好的生长，而近几年柑橘果园氮肥的使用量约每公顷525公斤，且逐年增加，相比30年前使用量增加一倍之多，过度使用氮肥导致柑橘果园土壤酸化，广西、江西和湖南的柑桔园土壤pH为4.5-5.5，这大大影响了柑橘树的生长环境；另一方面，研究表明柑橘树对氮，铁，锌，和B的吸收的最佳pH为6。在酸性条件下（pH5.0以下），B、Zn、Mg元素不能被有效吸收，由于柑橘不能有效吸收所需的元素从而导致柑橘叶片黄化，根系活力下降，导致植物发育较差，并减少从土壤中营养物质的吸收，从而导致柑橘黄龙病常常与缺素症同时发生。上述诸多原因造成柑橘黄龙病日趋严重，其带来的损失也急速加大，在中国江西，果园有30%的柑橘树被黄龙病所感染，并要求砍除。在中国湖南，黄龙病造成了巨大的损失已达30-50%。

目前，防止或控制柑桔黄龙病的主要方法是砍树、杀灭木虱和无毒苗，但这些措施具有诸多弊端，砍树一方面给果农造成巨大经济损失，且并不能有效根除黄龙病及致病菌，还存在二次污染；杀灭木虱场用到许多化学除虫剂，对环境、植株及果实造成恶劣影响，严重时影响食品安全，且对于已染病的果实植株效果甚微，经济损失仍然很大；无毒苗近些年受热捧，是柑橘产业的一大喜讯，但无毒苗并不抗病，只代表苗木在出圃时无毒无病，对栽培环境的要求很高，并不能有效防治黄龙病的感染。随着人们对黄龙病发病原因了解的深入，用生石灰调节土壤pH值是改善土壤酸化的传统方法。CN 104255351 B 的专利文献公开了一种防治柑橘黄龙病的方法，用生石灰进行消毒和调节土壤pH 值为5.5 ～ 7.5，配合采用含有甲壳素和稀土的有机水溶性肥、含有甲壳素、稀土元素的叶面肥与有机硅的混合液和含芽孢杆菌的生物肥来进行治理柑橘黄龙病，其中所涉及的肥料诸多，步骤繁琐，经过一年时间的治理，发病树体只有一半恢复健康，其治理效果较差，投入与挽回的经济损失相差无几，不适于大面积推广。

因此，开发新的、效果良好的防治柑橘黄龙病的方法及产品是挽救柑橘行业亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

为解决目前黄龙病防治方法匮乏、操作复杂、效果低微的技术问题，本发明提供一种防治柑橘黄龙病的方法及试剂套装，通过以生石灰调节土壤酸度，配合使用有机生物菌肥，改良土壤结构和质量，进一步借助其生物菌配合植物免疫诱导剂促进柑橘植株根系活力、提高柑橘抗病性，从而高效、绿色防治柑橘黄龙病，促进柑橘植株健康生长。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案一是：

一种防治柑橘黄龙病的方法，所述方法包括以下步骤；

A、按照50-150kg/亩的使用量将生石灰施加至柑橘果园的土壤；

B、按照100-250kg/亩的使用量向柑橘果园的土壤中施加含有微生物菌的有机肥料；

C、每30-40天向柑橘植株喷雾或灌根植物免疫诱导剂一次，使用量100-150g/亩，连续使用3-5次。

优选的，所述步骤A中将生石灰施加至柑橘果园的土壤，施加一次使土壤pH值提高0.5-1.0，施加两次最终使土壤pH值提高至6.0-6.5。

优选的，所述步骤B向柑橘果园的土壤中施加含有微生物菌的有机肥料时，按微生物菌0.5-1.5×10⁹cfu/亩添加至有机肥料中搅拌均匀而成。

优选的，所述微生物菌包括木霉菌和侧孢芽胞杆菌，所述木霉菌和侧孢芽胞杆菌的数量比为1：1-3。

优选的，所述植物免疫诱导剂为有效成分极细链格孢激活蛋白含量3wt.%的可湿性粉剂。

本发明还提供一种防治柑橘黄龙病的试剂套装，所述试剂盒中包括以下质量份数的试剂，试剂一为生石灰，试剂二为含有芽孢杆菌的有机肥料，试剂三为植物免疫诱导剂，其中，所述试剂一、试剂二及试剂三的质量份数比为5-40:10-25：0.03-0.1。

优选的，所述含有微生物菌的有机肥料中微生物菌含量为0.5-1.5×10⁹cfu/100-250kg。

优选的，所述微生物菌包括木霉菌和侧孢芽胞杆菌。

更有选的，所述微生物菌由数量比为1：1-3的木霉菌和侧孢芽胞杆菌组成。

优选的，所述植物免疫诱导剂为有效成分极细链格孢激活蛋白含量3wt.%的可湿性粉剂。

上述技术方案中，提供了一种防治柑橘黄龙病的方法及配套的试剂套装，所述试剂套装中包括以下质量份数的试剂，试剂一为生石灰，试剂二为含有微生物菌的有机肥料，试剂三为植物免疫诱导剂，所述试剂一、试剂二及试剂三的质量份数比为5-40:10-25：0.03-0.1。应用该试剂套装用于防治黄龙病时，首先，按照50-150kg/亩的使用量将生石灰施加至柑橘果园的土壤，施加生石灰可以改善土壤酸化的状况，将土壤pH由5以下提高至6.0-6.5，可以提升根系活力，促进B、Zn、Mg元素及土壤中营养物质的有效吸收，为植物免疫系统的建立提供基础，促进柑橘叶片由黄转绿，从而改善和缓解黄龙病植株的症状。进一步的，按照100-250kg/亩的使用量向柑橘果园的土壤中施加含有微生物菌的有机肥料，通过施加含有微生物菌的有机肥料可以改善土壤的板结结构、提高土壤有机质和肥力，从而改善植物根系的生长环境，大大提高植物的根系活力，另一方面还能调节土壤微生物菌群平衡，抑制有害菌群生长，使得促进植物生长。每30-40天向柑橘植株喷雾或灌根植物免疫诱导剂一次，使用量100-150g/亩，连续使用3-5次，施加植物免疫诱导剂可以促进植物产生水杨酸、茉莉酸和乙烯等物质，进而促进植保素、抗病相关蛋白和酚类有机物等抗菌、抗病毒物质的合成，大大提高植物免疫系统的防卫能力，获得系统抗性，还能够促进植物的生长、代谢，提高植物叶绿素含量，达到提高植物抗多种病害免疫能力的效果。上述三种措施同步进行，相互配合增效，通过生石灰改善土壤酸化程度，提升植株根系活力，配合施加含微生物菌的有机肥料和施加植物免疫诱导剂，抑制有害菌群的同时形成肥沃的土壤基础，进一步以发达根系吸收微量元素及营养物质促进植物生长，促进植物叶绿素增加，所吸收的微量元素及营养物质在植物免疫诱导剂的作用下，使得植物免疫系统的防御能力大大提高，增强了植株抗病性，三种措施相辅相成，防治结合，标本兼治，从而达到了染病植株快速恢复正常、染病风险高的植株免于感染。

本发明的有益效果是：（1）本发明提供的方法和试剂套装，大大改善了土壤酸化程度，调节了土壤菌群，提高了植株根系活力和免疫能力，标本兼治的使得染病植株高效、快速恢复正常、染病风险高的植株免于感染，提高了染病植株的治愈率，降低了黄龙病的发病率；（2）本发明方法易于操作，步骤简单，且对环境、对植物及果实无污染性，是绿色的、有机的，有效保证了产品质量、品质和食品安全及环境安全，适于大范围推广使用。

附图说明

图1 为实施例2中在第一次喷施植物免疫诱导剂十五天后空白对照组和各实验组测定根系活力数据图；

图2A为感染黄龙病的柑橘植株生长状况图（2016年4月10日照）；

图2B为图2A中感染黄龙病的柑橘植株以本发明提供的方法处理，在其第二次喷施植物免疫诱导剂后15天的生长状况图；

图2C为图2A中感染黄龙病的柑橘植株以本发明提供的方法处理，第三次喷施植物免疫诱导剂后15天的生长状况图。

具体实施方式

本发明提供一种防治柑橘黄龙病的方法及试剂套装，以下以具体实施例详细说明，以便更好的理解本发明，所涉及试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得，所涉及操作步骤，如无特殊说明，均为常规操作。

实施例1

本发明提供一种防治柑橘黄龙病的方法及试剂套装，所述试剂套装中包括以下质量份数的试剂，试剂一为生石灰，试剂二为含有微生物菌的有机肥料，试剂三为植物免疫诱导剂，通过以生石灰调节土壤酸度和提高植株根系活力，配合使用含有微生物菌的有机肥料，一方面改良土壤结构和质量，还调节菌群平衡，抑制有害菌群，进一步借助其生物菌配合植物免疫诱导剂促进柑橘植株根系活力、提高柑橘果树免疫系统的抗病性，从而高效、绿色防治柑橘黄龙病，促进柑橘植株健康生长。

具体的，所述试剂一生石灰、试剂二含有微生物菌的有机肥料及试剂三植物免疫诱导剂的质量份数比为5-40:10-25：0.03-0.1。其中，有机肥料可为鸡粪、牛羊马粪或豆粕、棉粕等，一般控制其组成中有机质占35-45wt.%、水分30-40 wt.%、氮磷钾等无机微量微素20-30 wt.%。

含有微生物菌的有机肥料中微生物菌含量为0.5-1.5×10⁹cfu/100-250kg，适量的微生物菌可以改善土壤结构和调节土壤菌群平衡，抑制有害菌群，促进植物根系对微量元素和营养物质的吸收利用率。

所述微生物菌包括木霉菌和侧孢芽胞杆菌，木霉菌和侧孢芽胞杆菌的数量比为1：1-3。木霉菌可产生多种对植物病原真菌、细菌及昆虫具有拮抗作用的生物活性物质，抑制、削弱和排除同一生长环境中的灰霉病病原物，提高农作物的抗逆性，还能诱导寄主植物产生自我防御系统获得抗病性，增加根和苗的活力，促进植物生长和提高农产品产量；侧孢芽胞杆菌分泌大量几丁质酶，抑制真菌类病害，同时分解有机质，促进肥料的吸收利用率，两者科学合理配比，同时保证了对土壤的改良效果、抑制有害菌群的效果，还促进了肥料吸收利用率，对植物自身免疫系统的建立有促进作用。

所述植物免疫诱导剂为有效成分极细链格孢激活蛋白含量3wt.%的可湿性粉剂。极细链格孢激活蛋白是一种从微生物发酵后提炼的一种具有生物活性的、单一、稳定的蛋白质，能刺激植物体自身酶活性的增加，从而刺激植物体自身代谢的调控，刺激植物体根茎叶的生长，提高叶绿素含量，具体有以下作用：（1）促进植物根系生长，增强根系吸收能力，从而提高作物产量；（2）仰制植物体内外病原菌繁殖，减轻病虫害；（3）增强植物新陈代谢，促进光合作用和强化叶片保护膜，抵抗病原菌；（4）增强光合作用，提高化肥利用率；另一方面，该蛋白稳定性好，易溶于水，在pH4~10稳定，耐高温，100℃沸水中煮30min仍然稳定，自然光照下2d对效果不产生影响，常温贮存2年稳定，更保证了其效果的稳定性和便于储存，制剂形式可湿性粉剂，其中有效成分极细链格孢激活蛋白的含量为3wt.%，具体应用中，我单位将该可湿性粉剂制成包装的商品使用，商品名为阿泰灵，以1000-1500倍质量的水分散后可以形成稳定悬浮液用于喷雾或灌根。

本试剂套装中科学合理的配制三种试剂的量和比例，以生石灰调节土壤酸度和提高植株根系活力，配合使用含有微生物菌的有机肥料，一方面改良土壤结构和质量，还调节菌群平衡，抑制有害菌群，进一步借助其生物菌配合植物免疫诱导剂促进柑橘植株根系活力、提高柑橘果树免疫系统的抗病性，从而高效、绿色防治柑橘黄龙病，促进柑橘植株健康生长。

实施例2 本实施例通过详细的实地实验证明本方法防治柑橘黄龙病的效果

本发明方法和试剂套装防治柑橘黄龙病的田间对比试验

选定黄龙病发病程度相近、生长状况相似的果园，分别作为4个实验组(标号分别为A、B、C和D)和1个空白对照组（标号CK），每组处理30株果树，上述五组同时进行如下处理：

CK组：常规管理，不作特别处理；

A组：按照50-150kg/亩的使用量将生石灰施加至柑橘果园的土壤，要求生石灰撒均匀，覆盖整个处理区的地表；

B组：按照100-250kg/亩的使用量向柑橘果园的土壤中施加含有微生物菌的有机肥料。操作方法是沿果树行间树冠位置（滴水线）深挖直线沟或环状沟，要求开沟深30cm，宽20-30cm，在沟内均匀施加含有微生物菌的有机肥料，要求肥料施用保证均匀；

C组：按照100-150g/亩的使用量向柑橘植株喷雾或灌根植物免疫诱导剂，以后每隔30-40天连续再喷雾或灌根一次，连续使用3次，要求每次喷施以叶面均匀喷雾至有水珠滴落为准；

D组：按照生石灰50-150kg/亩、含有微生物菌的有机肥料100-250kg/亩的使用量的使用量施加至柑橘果园的土壤，同时按照100-150g/亩的使用量向柑橘植株喷雾或灌根植物免疫诱导剂，以后每隔30-40天再喷雾或灌根一次植物免疫诱导剂，连续使用3次，要求与上述组分别相同。

进行处理后，以植物免疫诱导剂喷施时间为准，分别在第1次喷施后15天、第2次喷施后15天和第3次喷施后15天调查各个处理组果树黄龙病的发病情况，并按照2.1各组病情指数和防治效果统计，结果见表1；在第3次喷施后15天各组随机抽取6棵植株按照下述2.2TTC法测定根系活力。

2.1各组病情指数和防治效果

（1）柑橘黄龙病病情分级标准为：

0级：全树无病；

1级：果树上有1~2个梢有斑驳黄化叶出现；

3级：部分侧枝或主枝有斑驳黄化症状，症状枝占全树的1/3以下；

5级：症状侧枝或主枝占全树的1/3以上和2/3以下；

7级：症状枝在2/3以上；

9级：全树死亡。

（2）计算方法

1)病情指数病情指数= [∑(各级病株数×相对级别值)/(调查总株数×9)]×100

2)防治效果（%）=（CK1—PT1）/ CK1×100

注：CK1代表空白对照组病情指数；PT1代表各处理组病情指数。

根据上述分级标准及计算方法统计调查数据和防治效果数据，在喷施前对初始症状进行病情分级及病情指数计算，5组的初始状态均为0级12棵、1级9棵、3级6棵、5级2棵、7级1棵和9级0棵，病情指数16.3，结果如下表1.

表1 不同处理时期黄龙病防治效果数据

从试验数据可以看出，经过上述方法处理后的A、B、C、D组果树，与空白对照组的黄龙病病情相比，都有不同程度的减轻。第1次喷施后15天，A、B、C、D组的防治效果分别为：4.26%，4.26%，4.26%和23.40%，只有联合处理的D组防治效果较明显，其防治效果大大高于单独使用三种措施的和，原因在于A组只改善土壤pH值，根系活力尚未回复，加之土壤贫瘠、营养匮乏，其防治效果不明显，B组施加含微生物均的有机肥料后，土壤肥力增强，但土壤酸性仍很大，不利于吸收，植株抗病能力不强，C组喷雾植物免疫诱导剂，免疫能力提升，健康植株无继续感染，但由于土壤酸性大，肥力弱，染病植株恢复力很弱，防治效果不明显，只有联合处理的D组，增加了土壤肥力，抑制有害菌群情况下，改善土壤酸度和菌群平衡，大大提高根系活力，有利于吸收营养物质和提升免疫力以促进植株生长，同时植物免疫诱导剂也大大提高了植株的抗病能力，从而使得染病植株转好，健康植株免于染病，三种措施相互协调，大大增强了防治效果。第2次喷施后15天，A、B、C、D组的防治效果分别为：10.61%，18.18%，25.76%和59.09%，随着治理时间的延长，措施单独使用的A、B和C组防治效果也拉开差距，以施加植物免疫诱导剂提高植物自身免疫系统的抗病能力，防治效果较好些，施加肥料，改善土壤菌群平衡的B组次之，至改善土壤pH，不增加肥力，不增加植物免疫能力的A组防治效果最差，三种措施联合使用的D组，防治效果大大高于分别单独使用三种措施的A、B和C组效果，比三组防治效果之和还要高15%左右；第3次喷施后15天，A、B、C、D组的防治效果分别为：9.09%，23.86%，30.86%和78.41%，经过一个周期的治理，其中，经过三种处理方式综合处理后，最终的黄龙病防治效果最高达到78.41%，比A、B和C组防治效果之和还要高25%左右。

法测定根系活力

（1）TTC（氯化三苯基四氮唑）标准曲线的制作

（1.1）配制溶液

0.4%TTC溶液的配制：称取0.4g TTC（氯化三苯基四氮唑）溶解于100mL蒸馏水中并搅拌均匀；

（1.2）制作标准曲线

量取0.25ml 0.4%TTC溶液转移至10ml的容量瓶，加入少许硫代硫酸钠粉末，摇匀后立即产生红色的TTF（三苯基甲），再用乙酸乙酯（分析纯）定容至刻度线，摇匀，得0.1%TTF溶液。分别量取0.1%TTF溶液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml加入至5个10ml容量瓶中，并分别以乙酸乙酯定容至刻度线，摇匀即得到分别含TTF 25μg、50μg、100μg、150μg、200μg（浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL）的标准比色系列，以TTF溶液作为空白对照，在485nm波长下测定吸光度，绘制TTF吸光度标准曲线。

（2）植株根活力测定

（2.1） 设置植株根的实验组和空白对照组

实验组：称取根样品0.5g放入至培养皿中，加入由0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液（1/15μmol/L，pH值为7）等量混合的溶液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下黑暗处保温1-3h，然后加入1mol/L 的硫酸2ml以停止反应；

空白对照组：与实验组不同的是加入根样品前先加入2ml、1mol/L 的硫酸，其他操作相同；

（2.2）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出红色TTF。把红色提取液收集至试管中，用少量乙酸乙酯把根的残渣洗涤二至三次，一并移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm处测定提取液的吸光，以空白作参比读出吸光度，借助标准曲线求得四氮唑还原量，再将所得数据带入下式a，求出四氮唑还强度。

式a四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）＝四氮唑还原量（mg）/[根重（g）×时间(h)]。

最后上述各组以平均值做结果数据，制成数据表，见图1，可见，采用本发明方法综合处理的D组其根系活力大大增强，一方面得益与生石灰对土壤酸度的改善，两一方面，植物免疫诱导剂使植物自身建立了强大的免疫系统，加之微生物菌及有机肥料的促进作用，三种措施相互配合，良性循环相互增效，促进了植株根系的大大增强，使植株健康生长。

综上可见，本发明提供的防治柑橘黄龙病的方法三种措施协调作用，使黄龙病果园的植株中染病植株病况大大改善，未染病植株免于染病，大大提高了果园黄龙病的防治效果。