本发明属于植物组织培养技术领域，尤其是涉及一种赤皮青冈无菌外植体制备及初始芽诱导方法。
背景技术：
赤皮青冈(Cyclobalanopsis gilva (Blume) Oerst),属壳斗科青冈属(Cyclobalanopsis Oerst)植物，为常绿乔木，高达30米，树皮暗褐色，耐贫瘠，在我国广泛分布于浙江、湖南等省。赤皮青冈心材呈深红褐色，边材呈黄褐色，纹理直，质坚重，强韧有弹性，气干密度0.85-0.91克/立方厘米，用途广泛，经济价值很高，是我国珍贵的硬材树种之一。由于大量砍伐，已沦为濒危树种。一方面，赤皮青冈种子属于顽拗性种子，其萌发时间很长，发芽率较低，且容易遭虫害，不易保存，存活率很低，有性繁殖速度慢；另一方面,有性繁殖不能保证林木的优良特性，然而，组织培养能通过无性繁殖，遗传树种的优良特性，能在短时间内快速繁殖获得大量优质的组培苗，为优质种源推广提供可能。
赤皮青冈属组织培养困难的树种，主要是因为外植体消毒困难，还有在初始芽诱导培养过程中，易褐化、初始芽发生率低、芽苗不伸长、活性差等瓶颈问题，严重限制了赤皮青冈优良无性系的推广与应用。
技术实现要素：
本发明针对现有赤皮青冈组织培养中外植体消毒困难、褐化、初始芽发生率低、芽苗活性差等的技术问题，提供一种赤皮青冈无菌外植体制备及初始芽诱导的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下
一种赤皮青冈无菌外植体制备及初始芽诱导方法，包括外植体准备、外植体消毒处理以及初始芽诱导工序，采集赤皮青冈当年生嫩枝作为外植体，进行消毒处理后，获得的无菌外植体接种于初始芽诱导培养基中，在适宜环境中培养20-30天后，获得生长快、活力旺盛的赤皮青冈初始芽，其操作步骤如下：
（1）外植体准备：
在至少连续3天晴朗的气候里，采集赤皮青冈的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体；
（2）外植体消毒处理：
将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1-0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡20-30 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1-2 min，再移入体积浓度为5-8 %的氯化汞溶液中浸泡10-20 min，取出放于体积浓度为10-25 %的双氧水和2-5滴吐温的混合液中搅拌浸泡20-30 min后，最后用无菌水洗3-4次，每次冲洗3-5 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
将步骤（2）得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）0.5-2.0 mg·L-1 + MT 1.0-3.0 mg·L-1 + 6-BA 1.0-3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1 + 0.1-0.3 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：20-30天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的赤皮青冈初始芽。初始芽萌动率在90%以上。
以上所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 230 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.5 mg·L-1；维生素B6 0.6 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
优选的，以上适宜条件为：温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx。
对比于现有技术，本发明的优点及积极效果如下：
1、本发明选取当年赤皮青冈生嫩枝为组培繁殖材料，外植体的萌芽条幼态化程度高，极大地提高了外植体的有效性，从而成功建立一种赤皮青冈茎段组培方法，本方法对加快赤皮青冈优质壮苗的生产，促进国家硬木用材快速发展，调整林业品种结构具有重大意义。
2、本发明依次采用一定的浓度及消毒时间的广谱杀菌剂、酒精、氯化汞、双氧水和吐温相配合的消毒处理的方式，无菌外植体获取率高，达到90%以上。
3、本发明使用优化诱导培养基及培养方式，外植体褐化少，初始芽发生率高，芽苗伸长快、活力旺盛，具有较好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
在至少连续3天晴朗的气候里，采集赤皮青冈的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1 %的广谱杀菌剂中浸泡30 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1 min，再移入体积浓度为5 %的氯化汞溶液中浸泡20 min，取出放于体积浓度为10 %的双氧水和2滴吐温的混合液中搅拌浸泡30 min后，最后用无菌水洗3次，每次冲洗5 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-2.0cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；将消毒处理后得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）0.5 mg·L-1 + MT 1.0 mg·L-1 + 6-BA 1.0mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1 + 0.1 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：20-35天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的赤皮青冈初始芽，初始芽萌动率92%。
所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 230 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.5 mg·L-1；维生素B6 0.6 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
实施例2：
在至少连续3天晴朗的气候里，采集赤皮青冈的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.2 %的广谱杀菌剂中浸泡25 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡2 min，再移入体积浓度为6 %的氯化汞溶液中浸泡15 min，取出放于体积浓度为15 %的双氧水和4滴吐温的混合液中搅拌浸泡25 min后，最后用无菌水洗3次，每次冲洗5 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，2.0-2.5 cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；将消毒处理后得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）1.5 mg·L-1 + MT 2.0 mg·L-1 + 6-BA 2.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1 + 0.1-0.3 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：20-25天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的赤皮青冈初始芽，初始芽萌动率95%。
所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 230 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.5 mg·L-1；维生素B6 0.6 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
实施例3：
在至少连续3天晴朗的气候里，采集赤皮青冈的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡20 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡2 min，再移入体积浓度为8 %的氯化汞溶液中浸泡10 min，取出放于体积浓度为25 %的双氧水和5滴吐温的混合液中搅拌浸泡20 min后，最后用无菌水洗4次，每次冲洗3 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，2.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；将消毒处理后得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）2.0 mg·L-1 + MT 3.0 mg·L-1 + 6-BA 3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1 + 0.3 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：25-30天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的赤皮青冈初始芽，初始芽萌动率94%。
所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1650 mg·L-1；NH4NO3 650 mg·L-1；CaCl2·2H2O 230 mg·L-1；MgSO4·7H2O 380 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.5 mg·L-1；维生素B6 0.6 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。