利用非整倍玉米异源多倍体培育多年生饲草玉米的方法与流程

本发明属于多年生饲草玉米育种方法领域，具体涉及利用非整倍玉米异源多倍体培育多年生饲草玉米的方法。

背景技术：

饲草是草牧业发展的基础，关系到畜产品的质量与安全。低质量饲草增加饲喂成本，且危害动物健康。近年来我国频繁出现的奶、肉制品质量安全问题都与国内饲草短缺密切相关。藏粮于草，可节粮、保土、兴牧、富民，具有产出高效、产品安全、资源节约、环境友好等优点。目前，饲草已然成为饲料产业中最具发展潜力的产业。

玉米(zeamaysl.)因具有较高的生物量和营养价值，被誉为“饲料之王”。饲用玉米不以收获籽粒为目的，而是以地上部分(茎、叶和果实)作为收获对象。截止到2016年，国家审定饲用玉米品种共22个，其中玉蜀黍属20个，类蜀黍属仅2个种，包括墨西哥类玉米和玉草1号。玉蜀黍属类品种和玉草1号均为杂交种，墨西哥类玉米为常规品种。除玉草1号外，均为一年生。以杂交种为主的饲用玉米需要每年制种，每年种植，不仅栽培管理麻烦，成本高，而且自交系的选育周期长、见效慢，且高度依赖育种者的选育经验，难以培育出真正作为饲料的品质和产量要求的品种。

与一年生饲用玉米相比，多年生饲草具有根系更深，固碳和保水能力更强，且需肥、水较少；种植在边际土地、撂荒地无需耕种，一年种植多年受益等优点。但目前南方农区的高大多年生禾草缺乏，且品种单一，亟需培育出满足特定生态环境和市场发展需要的多年生饲草新品种。

在玉蜀黍族中，摩擦禾属与玉蜀黍属的亲缘关系最近。玉米(n＝10)与摩擦禾染色体基数(n＝18)不同，杂交不亲合，杂交极难成功。鸭茅状摩擦禾(又称指状摩擦禾，tripsacumdactyloidsl.，2n＝72)是一种多年生暖季丛生型禾草。由于其根系发达、多年生、生育周期长、持绿期长、适口性良好，在北美常作为一种优质牧草(eubanks等.maizegeneticscooperation

newsletter.1993.67:41.)。此外，由于再生能力强、适应性广，能在酸性、碱性和潮湿的土壤环境条件下生长，又可作为一种优良的土壤改良及水土保持植物(jackr等.proceedingsofthenationalacademyofsciences.1977.74(8):3494-3497)。然而，由于其存在结实率低、易落粒、种子休眠等问题，使种苗生产不足，极大地限制了摩擦禾的推广应用。二倍体摩擦禾为有性生殖，多倍体为兼性无融合生殖，主要是二倍体孢子生殖，即胚珠内的孢原或大孢子母细胞减数分裂受阻后形成未减数配子体，而后直接发育形成胚，再经假受精形成胚乳，最终发育成种子(kindiger等.cropscience.1996.36(2):250-255.)。这种兼性无融合生殖的特性除产生母性后代外，还有少数的(1％～6％)有性杂交后代，且部分有性后代仍可进行无融合生殖(grimanelli等.apomixisnewsletter.1995.8:35-37.)，这就为摩擦禾牧草品种改良以及将其优良特性转移入栽培玉米的实现提供了可能。其携带的宿根性、无融合生殖和抗逆、抗病虫基因是培育多年生饲草玉米品种的优异种质资源。丰富叶量、少量茎秆有利于其加工成草产品，被称作“禾草之王”和“冰淇淋草”。但其叶片边缘有锋利锯齿，不利于人工收获；前期生长速度慢，产草量低。

大刍草(teosinte)是玉蜀黍属中除栽培玉米种外所有野生种的统称，是与玉米亲缘关系最近的一类植物，与玉米杂交能够获得有育性的后代。一年生大刍草分蘖能力强、枝叶繁茂、再生性强、可多次刈割，是优质的饲用植物。四倍体多年生类玉米(z.perennis，2n＝40)和二倍体多年生类玉米(z.diploperennis，2n＝20)具有多年生、分蘖力强、营养体繁茂等特点。四倍体多年生类玉米是玉蜀黍属唯一的四倍体种(2n＝4x＝40)，具有发达的根茎，耐重度霜冻且耐涝，可作为培育多年生饲草玉米的抗寒基因的优良供体。

玉米生长势强，摩擦禾具有多年生特性，四倍体多年生类玉米具有多年生和抗寒性、再生性强的特点。如何将三个物种的优良特性聚合在一起培育多年生饲草玉米一直是玉米育种关注的热点和难点。四川农业大学唐祈林等于2006年以北京市农林科学院引进的源于美国的四倍体玉米(玉米加倍)和鸭茅状摩擦禾之间的杂种f1(2n＝56)与四倍体多年生类玉米杂交而获得三元杂种，在所得的三元杂种中有一株生长旺盛、分蘖力强、多年生的三元杂种，命名为mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)。mtf-1的染色体数目为76条(其中玉米染色体20条、四倍体多年生类玉米染色体20条，鸭茅状摩擦禾染色体36条)，是一个含有玉米、四倍体多年生类玉米和摩擦禾全套基因组的异源六倍体；mtf-1不仅克服了摩擦禾结实率低、种子发芽率低和四倍体多年生类玉米茎秆纤细易倒伏的缺点，同时还保留了多年生、分蘖多、营养生长期长等野生性，在植株生长势和生物产量上表现出强大的杂种优势(苏月贵.四川农业大学硕士论文，2009)。但是该三元种再生能力相对较弱，在越冬时气温低于-4℃易死亡，影响第二年的再生，不利于将其直接作为多年生饲草利用。专利《利用玉米异源多倍体培育非整倍体多年生饲草品种的方法》(cn103548674a)公开了利用mtf-1培育多年生饲草玉米品种的方法。

mtp94(tripsazeacreammaizet.，2n＝94)是四川农业大学利用mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)产生的不完整2n配子(2n＝74)与四倍体多年生类玉米(z.perennis，2n＝40)9475产生的n配子(n＝20)杂交通过2n+n生殖方式合成的染色体数为94条的非整倍多年生玉米异源多倍体，其染色体构成为玉米染色体20条、摩擦禾染色体34条以及四倍体多年生类玉米染色体40条(董兴春，四川农业大学硕士论文，2015)。mtp94具有多年生和耐寒性强等优点，但是存在生物产量低和再生性能差等缺点，难以直接作为饲草玉米应用。

从上述可知，现有技术中已公开了以整倍性的玉米异源多倍体为桥梁培育多年生饲草玉米品种的方法，但是没有发现利用非整倍性的玉米异源多倍体培育多年生饲草玉米的方法。

技术实现要素：

本发明人在研究过程中意外发现，非整倍玉米异源多倍体mtp94具有雌性部分可育的特性；进一步的研究还发现，用玉米、四倍体多年生类玉米或摩擦禾作为父本给mtp94授粉，皆可获得结实后代，本发明就是在此意外发现的基础上完成的。本发明目的在于提供一种利用非整倍玉米异源多倍体培育多年生饲草玉米的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明利用非整倍玉米异源多倍体培育多年生饲草玉米的方法，包括如下步骤：

(1)、当春季地温升至10℃以上时，对非整倍玉米异源多倍体(tripsazeacreammaizet.)进行分蔸繁殖，或将上一年茎秆扦插、压条、埋条或组织培养等无性繁殖方式获得的种苗，按株行距为2m×2m进行单株种植；同时，在其周围分批种植父本；

(2)、在吐丝前，将非整倍玉米异源多倍体雌穗套袋，并在授粉前将其花丝剪短至1～3cm，用父本花粉给非整倍玉米异源多倍体授粉；或者在隔离条件下，让父本给非整倍玉米异源多倍体自由授粉；待种子成熟后收获、晾干，保存于-20℃冰箱；

(3)、将步骤(2)所得的种子在太阳下翻晒3～4个小时，然后种植于人工气候室的营养钵中，在温度为25℃～30℃、湿度为60％～80％条件下进行催芽；待幼苗长至3叶1心时，取根尖，然后按照株行距为2m×2m在大田进行单株定植；在成株期，选择株高≥200cm、草长≥250cm、基部周长≥35cm、分蘖数≥20个、糖锤度≥10％、叶片表面无明显病斑、茎秆直立无倒伏、刈割单株鲜草产量≥20kg的植株；将中选的单株采用茎秆扦插方法扩繁成无性系；

(4)、对步骤(3)所选无性系的根尖进行染色体数鉴定，并利用原位杂交(gish)和荧光原位杂交(fish)对无性系的染色体构成进行鉴定，每个无性系鉴定30～50个细胞；选择染色体总数为60～72条，其中玉米染色体数为8～12条，摩擦禾染色体数为14～18条，四倍体多年生类玉米染色体数为38～42条的无性系；

(5)、将步骤(4)所选的无性系中越冬率≥100％的无性系进入品比试验；种苗为茎秆扦插苗或分蔸苗，以审定的多年生饲草玉米品种或其亲本为对照进行至少2年的品比试验；分别于抽雄始期刈割，选择鲜草产量高于对照品种15％，并且粗蛋白含量≥9.0％dm、相对饲用价值(rfv)≥80的品系，即为新的多年生饲草玉米品种。

上述方法步骤(1)或(2)中所述的非整倍玉米异源多倍体是指含有玉米、摩擦禾和四倍体多年生类玉米染色体的非整倍体三元杂种。

所述的非整倍玉米异源多倍体是指mtp94(tripsazeacreammaizet.2n＝94)或者mtp94的衍生系。

所述mtp94的染色体总数为94，其染色体构成为：玉米染色体20条、摩擦禾染色体34条和四倍体多年生类玉米染色体40条。

所述的mtp94的衍生系是指以mtp94为亲本育成的含有的玉米染色体20条、摩擦禾染色体34条和四倍体多年生类玉米染色体40条的非整倍体三元杂种。

mtp94的来源：四川农业大学以mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)产生的不完整2n配子(2n＝74)与四倍体多年生类玉米(2n＝40)产生的n配子通过2n+n的生殖方式合成。与mtf-1相比，mtp94的染色体组成为玉米染色体20条、摩擦禾染色体34条和四倍体多年生类玉米染色体40条；其中减少了2条摩擦禾染色体，增加了20条四倍体多年生类玉米染色体。

公众可从四川农业大学获得mtp94。

上述方法步骤(1)或(2)中所述的父本是指玉米(zeamaysl.)、摩擦禾(tripsacuml.)或大刍草(teosinte)等材料之一种。

所述的玉米(zeamaysl.)是指玉米自交系、杂交种、综合种或农家品种等之一种。

所述的大刍草是指二倍体多年生大刍草(z.diploperennis,2n＝20)、四倍体多年生类玉米(z.perennis,2n＝40)、繁茂玉米种(z.luxurians,2n＝20)、尼加拉瓜玉米种(z.nicaraguensis,2n＝20)、墨西哥玉米亚种(ssp.mexicana,2n＝20)、韦韦特南戈亚种(ssp.huehuetenangensis,2n＝20)或小颖玉米亚种(ssp.parviglumis,2n＝20)等之一种。

所述的四倍体多年生类玉米可以是四倍体多年生类玉米(z.perennis,

2n＝40)9475。

所述的摩擦禾(tripsacuml.)是指鸭茅状摩擦禾(tripsacumdactyloides,2n＝4x＝72)或其他摩擦禾属物种。

所述的大刍草和摩擦禾材料可从墨西哥小麦玉米改良中心(cimmyt)公开获得。

上述方法步骤(1)或(5)中所述的分蔸繁殖是指以植株基部的返青幼苗为定植苗进行无性繁殖的方法。

上述方法步骤(1)、(3)或(5)中所述的扦插繁殖是指以切断的茎节作为扦条进行无性繁殖的方法。

上述方法步骤(1)中所述的压条是指把成熟的分蘖(茎节带有腋芽)叶片剔除后将整条茎埋入土中或仅将茎节埋入土中，待茎节处新苗进入三叶一心期便与母株割断，以此进行无性繁殖的方法。

上述方法步骤(1)中所述的埋条是指把成熟的分蘖(茎节带有腋芽)从母株根部割断，将整个分蘖枝埋入土中，待茎节处新苗出土进入三叶一心期与母枝割断，以此进行无性繁殖的方法。

上述方法步骤(1)中所述的组织培养是指以根尖、茎端、茎节、叶、胚等具有细胞全能性的组织分生进行组织培养繁殖的方法。

上述方法步骤(3)中的草长是指将植株分蘖枝叶片垂直于地面拉直，测量地面到叶尖的垂直高度。

上述方法步骤(3)中的基部周长是用皮尺紧贴地面绕所有分蘖外围一圈测得的长度。

上述方法步骤(3)中的糖锤度是用糖锤度仪测量茎秆中部折断后渗出汁液中所含的可溶性固形物的百分率。

上述方法步骤(5)中所述的越冬率(％)的计算公式为：春季返青幼苗数/头年刈割时分蘖数×100。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果为：(1)本发明方法利用非整倍玉米异源多倍体雌性部分可育的特性，首次将非整倍玉米异源多倍体用于培育多年生饲草玉米，不仅为多年生饲草玉米的培育开辟了一种新的途径，而且在遗传学研究上也有重大意义。(2)本发明方法中所用的非整倍玉米异源多倍体mtp94，聚合了玉米、鸭茅状摩擦禾和多年生四倍体类玉米的染色体组，其不仅具有摩擦禾和四倍体多年生类玉米的多年生性状，并且遗传了摩擦禾的无融合生殖特性，以及抗寒、分蘖等特性，具有广泛的遗传基础，不仅可作为桥梁材料克服玉米及其近缘种属间远缘杂交的困难，而且大大拓宽了培育饲草玉米的遗传基础，可根据不同生态环境和品种类型的需要设计不同的物种之间的遗传组合，从而培育出适应不同生态条件、满足不同需要的多年生饲草玉米；另外，还可作为桥梁材料向普通栽培玉米中转移近缘野生种中具有的优良抗逆、抗病虫害或品质基因资源。(3)本发明方法育种周期非常短，只需对杂交一代直接进行选择，即可育成多年生饲草玉米品种；而目前常用的以杂交种为主的饲用玉米，其自交系的育种周期长、费时费力、育种成本高，且高度依赖育种者的育种经验。(4)本发明方法有别于传统的饲草玉米育种方法，将远缘杂交、多倍体育种和无性系育种融为一体选育多年生饲草玉米。饲草玉米的品种类型也从综合品种、常规品种、杂交种拓展到无性系品种，品种类型更加多样化。(5)本发明方法通过营养体固定杂种优势，并通过分蔸、扦插等无性方式进行繁殖，不仅可以保持品种的优良特性，防止杂种优势的退化，而且无需像现有的饲用玉米那样年年制种，也不用年年种植，一次种植，可多年使用，极大地节约劳力，以及耕作成本，生产成本大大降低。(6)利用本发明方法育成的多年生饲草玉米品种产量高，所选品系第一年鲜草产量可达80t/hm²，比对照玉草1号高16.08％，第二年鲜草可达60t/hm²以上，比对照高47.10％，两年鲜草总量达149t/hm²以上，比对照高32.24％；高抗病害，整个生育期未见明显病斑，耐寒性好，能够忍耐霜冻，在四川盆地和盆周地区能够自然越冬。茎秆富含可溶性糖，适口性好，家畜喜食；饲用品质好，在抽雄期刈割cp可达9.0％dm、rfv在90％以上。

附图说明

图1.mtp94植株照片。

图2.mtp94杂交后代结实籽粒照片。

图3.编号9910材料染色体gish+fish鉴定显微照片。

图4.编号9919材料染色体gish+fish鉴定显微照片。

图5.编号9919材料植株照片。

具体实施方式

下面以实施例对本发明做进一步的说明，但是不对本发明的范围构成限制。如无特别说明，下面实施例中所用方法皆为常规方法。

实施例1利用非整倍玉米异源多倍体培育多年生饲草玉米的方法

按照如下方法进行：

(1)、2013年春，在四川农业大学崇州基地地温10℃以上时，将mtp94(tripsazeacreammaizet.2n＝94，公众可从四川农业大学获得mtp94生物材料)进行分蔸繁殖获得种苗(见图1)，并按照株行距2m×2m进行单株种植，同时，在周围2～4m内分批种植四倍体多年生类玉米(zeaperennis，2n＝40)9475(引自墨西哥国际玉米小麦改良中心(cimmyt)，公众可从cimmyt获得“9475”生物材料)。

(2)、2013年秋，在mtp94吐丝前套袋，并在授粉前将mtp94花丝剪至1～3cm，以提高结实率。在散粉期用9475做父本给mtp94授粉。待种子成熟后收获(见图2)、晾干，保存于-20℃冰箱。

(3)、2014年春，将(2)中所得种子在太阳下翻晒3～4h，以提高种子酶活，促进种子萌发。然后播种在人工气候室的营养钵内，在温度28℃±2℃，湿度70％±5％条件下催芽，成功催芽30粒，随机编号为991～9930。待幼苗长至3叶1心时，按株行距2m×2m定植于四川农业大学崇州基地，精心培护。

(4)、2014年秋，在抽雄期进行单株初选，选择株高≥200cm、草长≥250cm、基部周长≥35cm、分蘖数≥20个、糖锤度≥10％、叶片表面无明显病斑、茎秆无倒伏、刈割单株鲜草产量≥20kg的单株，共有12个单株入选。并将中选单株采用茎秆扦插方式扩繁成无性系。

(5)、通过根尖压片鉴定(4)中所选无性系的染色体总数；并采用基因组原位杂交(gish)和荧光原位杂交(fish)对所选无性系的染色体构成进行鉴定。选择染色体总数为60～72条，其中玉米染色体数8～12条，摩擦禾染色体数14～18条、四倍体多年生类玉米染色体数为38～42条的株系。结果(见表1)从中选出编号为993、995、9910(见图3)、9911、9919(见图4)、9921、9923共7个染色体数和构成上符合目标要求的品系。

表1.本发明所选多年生饲草玉米品系的染色体鉴定结果

(6)、品种比较试验。2015年春，以国审品种玉草1号和亲本9475为对照，进行品种比较试验。试验设计为小区面积4m×4.5m，株行距1.5m×2m，3个重复，四周设保护行，于2015～2016年进行连续两年的品比试验。在第2016年春季3月底调查越冬率，并于抽雄始期对各无性系进行刈割，并对粗蛋白含量进行检测，选择越冬率≥100％、粗蛋白含量≥9.0％dm、相对饲用价值(rfv)≥80，以及鲜草产量高于对照品种15％以上的品系。结果(见表2和表3)选出编号为9910、9911、9919(见图5)共3个符合目标要求的多年生饲草玉米品种。

表2.本发明多年生饲草玉米品系相关性状对比试验结果

表3本发明多年生饲草玉米品系鲜草产量对比试验结果