一种以幼花为外植体组培繁殖多倍体毛泡桐的方法
【专利摘要】本发明提出了一种以幼花为外植体组培繁殖多倍体毛泡桐的方法，它包括：a.幼花的选择；b.幼花的前处理和消毒；c.幼花愈伤组织诱导；d.愈伤组织分化培养；e.芽苗分化出根；f.组培苗的移栽；g.组培植株的观察鉴定。本发明突出幼花为外植体具有再生能力强、可在冬季至早春进行多倍体组培繁殖的优势，解决了多倍体毛泡桐根段繁殖率低和叶片组培繁殖分化苗频率不高的问题，能够较大规模繁殖多倍体毛泡桐，并利用形态学和细胞学技术确定组培后代的多倍体真实性和一致性。
【专利说明】一种以幼花为外植体组培繁殖多倍体毛泡桐的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以幼花为外植体进行组织培养繁殖多倍体毛泡桐的方法，属于现代林业的林木新品种选育【技术领域】。
【背景技术】
[0002]泡桐是优良速生树种，花大早开，观赏价值高。但长期以来泡桐靠根段繁殖，这种长期根繁容易感染“丛枝病”，影响林材质量，失去观赏价值。特别是 申请人:利用专利技术200810048497.9 (离体培养和秋水仙素处理结合选育多倍体毛泡桐的方法)选育出多倍体毛泡桐新品系，具有叶片变厚，叶形变圆，花变大的优良特性(湖北省科技成果“克隆和多倍体技术结合选育泡桐新品种”，2011年湖北省科技进步二等奖)。但是多倍体毛泡桐原原种植株少，且植株已长到开花年龄，用根段繁殖不仅严重损伤原原种植株，而且繁殖效率低。本发明涉及的是一种以幼花为外植体进行组织培养而扩大繁殖多倍体毛泡桐的技术，可以克服根段繁殖的困难和大量繁殖多倍体毛泡桐。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是建立以幼花为外植体，通过组织培养大量繁殖多倍体毛泡桐的技术。
[0004]本发明的技术方案为:a.幼花的选择；b.幼花的前处理和消毒；c.幼花愈伤组织诱导；d.愈伤组织分化培养；e.芽苗分化出根；f.组培苗的移栽；g.组培植株的观察鉴定。
[0005]本发明的具 体过程:
a.幼花的选择
该发明采用的组织培养材料是新近选育的多倍体毛泡桐品系，它与一般二倍体毛泡桐品系在形态结构和染色体组成上是不同的。它在第一年的11月上旬至次年的4月初进行花芽发育生长。本发明应用的组织培养外植体是毛泡桐的幼花。采摘时间为12月上旬至次年的3月下旬。选择的多倍体毛泡桐的幼花需饱满、呈黄褐色小纺锤形、无病虫害。
[0006]b.幼花的前处理和消毒
将着生幼花的多倍体毛泡桐花枝采回，插入装有35°C~40°C热水的水瓶中，外罩塑料袋，并放在25°C~28°C的组培室内处理3天~4天，以促动幼花的发育；热水处理完后，采摘下幼花放置在超净工作台上，用解剖刀沿着幼花表面切割去除幼花的黄褐色花萼；然后将幼花进行一般消毒处理，无菌水冲洗3次后，将幼花纵横切开，切成0.5 cm长的小块。
[0007]d.幼花愈伤组织诱导
将切开的多倍体毛泡桐幼花小块接种到幼花愈伤组织诱导培养基中，置于黑暗，25 °C~26 °C条件下培养，25天~30天幼花小块切口处产生谈黄色愈伤组织，其后逐渐长大长多。所述愈伤组织诱导 培养基配方为:MS+8.0 mg/L~16.0 mg/L 6BA+0.3 mg/L~0.9mg/L NAA+3% 蔗糖 +0.75% 琼脂，ρΗ5.8 ~6.0。
[0008]d.愈伤组织分化培养挑出直径达I Cm以上生长旺盛的愈伤组织，将它们接种到多倍体毛泡桐愈伤组织分化培养基中置于25°C~26°C，2000 Lx~2500 Lx，光照10-11 h/d。30天~45天后愈伤组织由淡黄变乳黄色，松紧中等，后逐渐显现绿点而分化出小芽，并逐渐长高长粗壮。愈伤组织分化培养基配方为:MS+6_BA 3.0mg/L ~5.0 mg/L + IBA 1.0mg/L ~2.0 mg/L +2% 鹿糖 +0.75% 琼脂，ρΗ5.8 ~6.0。
[0009]e.芽苗分化出根
当芽苗生长粗壮，达到2.5cm~5.0cm高时，将它们连带小块愈伤组织一起或从基部切断转接到生根培养基中，大约15~25天，芽苗基部分化出根。生根培养基配方:1/2MS+IBA 2.5mg/L ~3.0mg/L + 0.01% 活性炭 +2% 蔗糖 +0.75% 琼脂，ρΗ5.8 ~6.0。
[0010]f.组培苗的移栽
当组培苗生长旺盛、健壮，苗高达到8.0 cm~15.0 cm时，将它们连同培养瓶一起转入18°C~20°C室内，光照2000 Lx，炼苗3天，然后打开瓶盖，加入无菌水5 mL，再放置2天，将组培苗移出瓶，用自来水彻底洗涤，最后在加有1.0%~1.5%高锰酸钾液中浸5 min，最后移栽到由细砂土、蛭石和泥炭土 (按3:4:3)比例组成，并灭菌的基质中，用1/10MS培养基浇足定根水后，上罩塑料膜，保持相对湿度80%~90%，温23°C~25°C，光照1000 Lx~1500Lx, 24 h,此后按一般试管苗方法管理。
[0011]g.组培植株的观察鉴定
随着组培苗在移植基质中生长，多倍体毛泡桐将不断变粗壮并长高。此时，观察组培苗是否表现一致，是否表现出多倍体毛泡桐的叶片形状(多倍体毛泡桐叶片厚实，为近圆形)和边缘缺刻(比二倍体变小)；并观察叶片的下表皮气孔密度和气孔大小，以确定组培苗为多倍体毛泡桐的真实克隆品系。
[0012]本发明通过采用幼花为外植体进行多倍体毛泡桐新品系的组织培养繁殖。建立起成熟的组织培养克隆技术和多倍体形态、细胞观察的鉴定技术，为大量繁殖多倍体毛泡桐提供了技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1多倍体毛泡桐愈伤组织分化出组培苗。
[0014]图2多倍体毛泡桐植株。
【具体实施方式】
[0015]下面以实施例多倍体大花毛泡桐I号的组培繁殖对本发明进一步说明。
[0016]a.幼花的选择
采用新近选育的多倍体大花毛泡桐I号品系为材料，在2012年12月上旬采摘花枝，花枝上着生饱满黄褐色纺锤形的幼花。
[0017]b.幼花的前处理和消毒
将采回的花枝插入装有35°C~40°C热水的花瓶中，外罩塑料袋，放在26°C~27°C的组培室内处理4天。采摘下幼花，在超净工作台上用解剖刀切割去除幼花的黄褐色花萼；然后将幼花放入0.1%升汞处理18 min,无菌水冲洗3次后，将幼花纵横切开，切成0.5 cm见方的小块。[0018]c.幼花愈伤组织诱导
将处理好的幼花小块接种到MS+6-BA 12.0 mg/L + NAA0.6mg/L +3%蔗糖+0.75%琼脂，PH6.0的幼花愈伤组织诱导培养基中，置于黑暗，25°C~26°C条件下培养；25天~30天幼花小块切口处产生黄色愈伤组织，随后逐渐长大长多。
[0019]d.愈伤组织分化培养
当愈伤组织旺盛生长达直径I Cm以上时，挑出愈伤组织转接到MS+6-BA3.0mg/L +IBA2.0mg/L +2%蔗糖+0.75%琼脂，pH6.0的愈伤组织分化培养基中，在25°C~26°C，2000Lx光照10 h/d，黑暗14 h/d条件下培养；30天~45天后愈伤组织由淡黄变成乳黄色，松紧中等，随后呈现绿点而分化出芽。
[0020]e.芽苗分化出根
当芽苗生长粗壮，达到3.5cm左右高时，将它们连同小块愈伤组织转接到生根培养基中，20天左右，芽苗基部分化出根。生根培养基配方为:1/2MS+ IBA 2.5mg/L +0.01%活性炭 +2% 蔗糖 +0.75% 琼脂，pH6.0。
[0021]f.组培苗的移栽
当组培苗旺盛生长，苗高到达10 Cm左右时，将它们连同培养瓶转入18°C~20°C室内，光照2000 LX，炼苗3天，然后打开瓶盖加入无菌水5 mL，再放置2天后，将组培苗移出瓶，用自来水彻底洗涤，最后再加有1.0%~1.5%高锰酸钾溶液中浸5 min，最后移栽到由细砂土、蛭石和泥炭土(3:4:3)组成并灭菌的基质中，用1/10MS培养基浇足定根水后，上罩塑料膜，保持相对湿度80%~90%，温度23 °C~25 °C，光照1000 LX~1500 LX，24h，此后按一般试管苗方法管理，直至长成一年生种苗。
[0022]g.组培植株的的观察鉴定 组培苗经过在移植基质中的生长，多倍体大花毛泡桐I号将不断变粗壮并长高，按I个月、2个月、4个月、6个月、8个月，每隔2个月观察一次，看组培苗是否表现一致，看它们的叶片形状是否为近圆形厚叶的多倍体特征，并采叶片下表皮进行显微观察，看气孔是否变大、气孔密度是否变小，确定这些组培苗确实为多倍体大花毛泡桐I号的真实克隆品系。
【权利要求】
1.一种以幼花为外植体组培繁殖多倍体毛泡桐的方法，其特征在于培育过程为: a.幼花的选择 组织培养的材料是新近选育的多倍体毛泡桐品系，其与一般二倍体毛泡桐品系在形态结构和染色体组成上是不同的，它在11月到次年4月初进行花朵发育，应用的外植体是多倍体毛泡桐的幼花，选择的多倍体毛泡桐的幼花需饱满、呈黄褐色小纺锤形，无病虫害； b.幼花的前处理和消毒 将着生幼花的多倍体无毛泡桐花枝采回，插入装有35 °C到40 °C热水的水瓶中，外罩塑料袋并放在25 °C到28 1:的组培室内处理3到4天，以促动幼花发育，热水处理后，采摘下幼花放置在超净工作台上，用解剖刀沿着幼花表面切割去除幼花的黄褐色花萼，然后将幼花进行一般消毒处理，无菌水冲洗3次后，将幼花纵横切开，切成0.5 cm的小块； c.幼花愈伤组织诱导 将多倍体毛泡桐幼花小块接种到幼花愈伤组织诱导培养基中，置于黑暗、25 V~28V条件下培养，25天~30天幼花小块切口处产生淡黄色愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基配方为:MS+8.0 mg/L~16.0 mg/L 6BA+0.3 mg/L~0.9 mg/L NAA+3%蔗糖+0.75%琼月旨，pH5.8 ~6.0 ; d.愈伤组织分化培养 挑出直径达I cm以上生长旺盛的愈伤组织，将它们接种到多倍体毛泡桐愈伤细胞分化培养基中，置于25 °C~26 °C, 2000 Lx~2500 Lx，光照10 hr-11 hr，黑暗14 h~13h ；30天~45天后愈伤细胞由淡黄变 为乳黄色，松紧中等，后逐渐显现绿色小点而分化出小芽，并逐渐长高长粗壮，愈伤组织分化培养基配方为:MS+6-BA 3.0mg/L~5.0 mg/L + IBA1.0mg/L ~2.0 mg/L +2% 蔗糖 +0.75% 琼脂，ρΗ5.8 ~6.0 ; e.芽苗分化出根 当芽苗生长粗壮，达2.5 cm~5.0 cm高时，将它们连带小块愈伤组织一起或从基部切断转接到生根培养基中，约15天~25天，芽苗基部分化出根，生根培养基的配方为:1/2MS+IBA 2.5mg/L ~3.0mg/L + 0.01% 活性炭 +2% 蔗糖 +0.75% 琼脂，ρΗ5.8 ~6.0 ; f.组织苗的移栽 当组培苗生长旺盛健壮，苗高达到8.0 cm~15.0 cm时，将它们连同培养瓶转入18°C~20 °C室内，光照2000 Lx，炼苗3天，然后打开瓶盖加入无菌水5 mL，再放置2天后，将组培苗移出瓶，用自 来水彻底洗涤，最后在加有1.0%~1.5%高锰酸钾液中浸5 min，最后移栽到由细砂土、蛭石和泥炭土组成并灭菌的基质中，用1/10MS培养基浇足定根水后，上罩塑料膜，保持相对湿度80%~90%，温度23 °C~25 °C，光照1000 Lx~1500 Lx, 24 h，此后按一般试管苗方法管理； g.组培植株的观察鉴定 随着组织苗在移植基质中生长，多倍体毛泡桐将不断变粗壮长高，此时，观察组培苗是否表现一致，是否表现出多倍体毛泡桐的叶片形状(多倍体毛泡桐叶片厚实，为近圆形)和边缘缺刻(比二倍体变小)，并观察叶片的下表皮气孔密度和气孔大小，以确是组培苗为多倍体毛泡桐的真实克隆品系。
【文档编号】A01H4/00GK103704140SQ201310747508
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】蔡得田, 宋兆建, 王维, 张献华, 何玉池, 刘育华 申请人:湖北大学, 武汉多倍体生物科技有限公司