本发明涉及鱼类养殖领域，具体涉及一种牙鲆抗爱德华氏菌病优良品种的人工选育方法。
背景技术：
牙鲆，硬骨鱼纲，鲆科。牙鲆在我国俗称牙片、偏口、比目鱼、平目、左口、偏口鱼、比目鱼、鲆等，亦称“左口鱼”。是名贵的海产鱼类，又是重要的海水增养殖鱼类之一，牙鲆为冷温性底栖鱼类，具有潜沙习性，幼鱼多生活在水深10m以上，有机物少，易形成涡流的河口地带。夏季在此肥育。当秋季水温下降时逐步向较深的海域移动，一般9、10月份移向50m以下外海，11月份至12月份向南移至水深90m或者更深的海底越冬，春季游回近岸水深约30~70m的浅水海域进行产卵繁殖，我国北方于2002年首次引进试养．随后实现人工苗种批量生产，为开展牙鲆的人工养殖奠定了基础，牙鲆是中国重要的经济鱼类，主要分布于中国沿海及朝鲜、日本，牙鲆生长快肉质鲜美养殖周期短产量高是中国北南方海水增养殖的优良品种。
爱德华氏菌属的迟钝爱德华氏菌，是多种淡、海水养殖鱼类的一种重要病原菌，在世界不少国家和地区均有由该菌引起的、不同程度的鱼类病害的发生与流行，随着牙鲆工厂化养殖规模、养殖密度的不断加大，迟钝爱德华氏菌常可引发养殖牙鲆的细菌性感染疾病，表现出较高的发病率和死亡率，给养殖业带来了严重的经济损失，尤其在七八月份，水温高于20度时是其发生的高峰期，而且水温越高，发病期越长，危害也越大，发病鱼的腹部明显膨胀，肛门扩张红肿，病情严重的部分肠道从肛门脱出。解剖腹部，腹腔内有大量粘稠状腹水(不透明液体)，患病时间长了以后，随之会出现许多种外观症状，眼球突出，鳍出血，体色变黑等，本发明涉及一种牙鲆抗爱德华氏菌病优良品种的人工选育方法，为牙鲆抗病育种奠定重要基础。
现有技术如授权公告号为cn104304096b的中国发明专利，公开了一种牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系的选育方法，主要包括如下的步骤：迟钝爱德华氏菌感染牙鲆鱼苗及其抗病力测定方法、抗迟钝爱德华氏菌病群体筛选方法、抗迟钝爱德华氏菌病家系筛选方法以及抗迟钝爱德华氏菌病家系特异微卫星标记筛选方法等，筛选到抗病家系特异微卫星标记；建立了抗病家系后代抗病力和养殖成活率测试方法，创制了牙鲆抗迟钝爱德华氏菌病优良品系。采用本发明技术生产的牙鲆苗种具有抗迟钝爱德华氏菌病能力强、养殖成活率高、死亡率低、生长速度较快的特点，基本解决了牙鲆苗种夏季因感染迟钝爱德华氏菌而爆发腹水病引起大量死亡的问题，适合在全国沿海地区牙鲆养殖场推广应用，但是该选育方法比较复杂。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种具有抗迟钝爱德华氏菌病能力强、养殖成活率高、死亡率低、生长速度较快的的牙鲆抗爱德华氏菌病优良品种的人工选育方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种牙鲆抗爱德华氏菌病优良品种的人工选育方法，包括池塘网箱养殖牙鲆、预防疾病、爱德华氏菌培养、爱德华氏菌感染牙鲆、牙鲆抗爱德华氏菌的选育，具体选育方法为：
池塘网箱养殖牙鲆：选择2~3m水深池塘设置网箱养殖，每箱放养300~500尾牙鲆，把网箱成直线排在池塘进、排水口的连线上，有利于水流畅通和池水的交换，设置叶轮式增氧机充分增氧并保持池水流动，为牙鲆的生长提供一个良好的环境；
预防疾病：在牙鲆的养殖过程中，每隔13~15天投药剂，该药剂的成分及其重量份为五倍子8~13份、蛋白多肽1~2份、连翘15~18份、黄芩13~16份、鱼腥草8~11份、板蓝根12~15份、苦参2~4份、金樱子1~3份，蛋白多肽的氨基酸序列为hshacasysryysvcgyyrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该多肽不需要消化，能直接被牙鲆吸收利用，摆脱了消化器官的局限性，吸收后，不会有任何排泄物，而且是全部被牙鲆吸收和利用，满足了牙鲆所需的蛋白质的量，大幅度提升其免疫力，从而达到了预防疾病的目的；该药剂成分均是中草药，对迟钝爱德华氏菌具有抑菌作用，在作用完成后残留少，不易导致病原菌产生耐药性，其作用不仅仅在于对病原微生物的直接抑杀作用，更重要的是通过对机体免疫系统的调节，即调动机体的抗应激能力和提高机体的免疫防御功能，从而达到预防传染性疾病的目的；
爱德华氏菌培养：采用-70~-80℃下保留的菌种，直接无菌条件下接种在液体培养基中，在26～29℃，190~210r/min振荡培养38～42h，将7000~8000r/min离心12～15min后倒掉上清，用pbs缓冲液洗涤后重新离心倒上清，重复3～5次，最后用pbs缓冲液稀释到半致死浓度，备用，用pbs缓冲液洗涤可去除原先的培养基成分以及除菌体外的一些其他杂质，保证爱德华氏菌的纯度；
爱德华氏菌感染牙鲆：挑选质量高的不同家系的10~12cm的幼鱼，按照0.18~0.22ml/10g体重腹腔注射半致死浓度的菌液，在水温为18~21℃下养殖，保持流水和通气，筛选出抗爱德华氏菌病家系，该步骤通过记录每个家系牙鲆的体色变化、活动力大小、摄食强弱、有无发病症状和死亡时间等信息，及时捞出死鱼，测量其全长(从吻端到尾鳍末端)、体重，并剪取鳍条保存，在实验结束时，记录每个家系的存活数目，测量存活鱼的全长和体重，筛选出抗爱德华氏菌病家系；
牙鲆抗爱德华氏菌的选育：采用得到的抗爱德华氏菌感染牙鲆杂交与自交以及雌核发育后代，并对其后代进行养殖即得到抗爱德华氏菌病的牙鲆，该牙鲆是一种抗爱德华氏菌病的优良品种，能够解决牙鲆苗种夏季因感染迟钝爱德华氏菌而爆发腹水病引起大量死亡的问题，适合在全国沿海地区牙鲆养殖场推广应用，具有较大的发展市场空间。
作为优选，液体培养基的成分及其重量份为：蛋白胨0.4~0.6份、酵母膏0.08~0.12份、磷酸高铁0.001~0.002克、琼脂1.5~2克、陈海水97~100份，灭菌，调ph值至7~8，该培养基能为爱德华氏菌提供生长繁殖所需的营养成分，使其能够快速繁殖。
与现有技术相比，本发明的优点为：1）该人工选育方法是通过家系选育结合现代生物技术培育抗病品种，是解决牙鲆病害问题的重要途径；2）养殖过程中加入中草药药剂，对迟钝爱德华氏菌具有抑菌作用，残留少，不易导致病原菌产生耐药性，且能调动机体的抗应激能力和提高机体的免疫防御功能；3）基本解决了牙鲆苗种夏季因感染迟钝爱德华氏菌而爆发腹水病引起大量死亡的问题，适合在全国沿海地区牙鲆养殖场推广应用，具有较大的发展市场空间。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种牙鲆抗爱德华氏菌病优良品种的人工选育方法，包括池塘网箱养殖牙鲆、预防疾病、爱德华氏菌培养、爱德华氏菌感染牙鲆、牙鲆抗爱德华氏菌的选育，具体选育方法为：
1）池塘网箱养殖牙鲆：选择2.5m水深池塘设置网箱养殖，每箱放养500尾牙鲆，把网箱成直线排在池塘进、排水口的连线上，有利于水流畅通和池水的交换，设置叶轮式增氧机充分增氧并保持池水流动，为牙鲆的生长提供一个良好的环境；
2）预防疾病：在牙鲆的养殖过程中，每隔15天投药剂，该药剂的成分及其重量份为五倍子12份、蛋白多肽1.2份、连翘16份、黄芩15份、鱼腥草9份、板蓝根13份、苦参2份、金樱子3份，蛋白多肽的氨基酸序列为hshacasysryysvcgyyrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该多肽不需要消化，能直接被牙鲆吸收利用，摆脱了消化器官的局限性，吸收后，不会有任何排泄物，而且是全部被牙鲆吸收和利用，满足了牙鲆所需的蛋白质的量，大幅度提升其免疫力，从而达到了预防疾病的目的；该药剂成分均是中草药，对迟钝爱德华氏菌具有抑菌作用，在作用完成后残留少，不易导致病原菌产生耐药性，其作用不仅仅在于对病原微生物的直接抑杀作用，更重要的是通过对机体免疫系统的调节，即调动机体的抗应激能力和提高机体的免疫防御功能，从而达到预防传染性疾病的目的；
3）爱德华氏菌培养：采用-80℃下保留的菌种，直接无菌条件下接种在液体培养基中，在27℃，190r/min振荡培养38h，将细菌7000r/min离心15min后倒掉上清，用pbs缓冲液洗涤后重新离心倒上清，重复3次，最后用pbs缓冲液稀释到半致死浓度，备用，用pbs缓冲液洗涤可去除原先的培养基成分以及除菌体外的一些其他杂质，保证爱德华氏菌的纯度；
4）爱德华氏菌感染牙鲆：挑选质量高的不同家系的10~12cm的幼鱼，按照0.18ml/10g体重腹腔注射半致死浓度的菌液，在水温为18℃下养殖，保持流水和通气，筛选出抗爱德华氏菌病家系，该步骤通过记录每个家系牙鲆的体色变化、活动力大小、摄食强弱、有无发病症状和死亡时间等信息，及时捞出死鱼，测量其全长(从吻端到尾鳍末端)、体重，并剪取鳍条保存，在实验结束时，记录每个家系的存活数目，测量存活鱼的全长和体重，筛选出抗爱德华氏菌病家系；
5）牙鲆抗爱德华氏菌的选育：采用得到的抗爱德华氏菌感染牙鲆杂交与自交以及雌核发育后代，并对其后代进行养殖即得到抗爱德华氏菌病的牙鲆，该牙鲆是一种抗爱德华氏菌病的优良品种，能够解决牙鲆苗种夏季因感染迟钝爱德华氏菌而爆发腹水病引起大量死亡的问题，适合在全国沿海地区牙鲆养殖场推广应用，具有较大的发展市场空间。
上述液体培养基的成分及其重量份为：蛋白胨0.4份、酵母膏0.09份、磷酸高铁0.001克、琼脂1.8克、陈海水97份，灭菌，调ph值至7.5，该培养基能为爱德华氏菌提供生长繁殖所需的营养成分，使其能够快速繁殖。
实施例2
一种牙鲆抗爱德华氏菌病优良品种的人工选育方法，具体选育方法为：
1）选择2.2m水深池塘设置网箱养殖，每箱放养400尾牙鲆，把网箱成直线排在池塘进、排水口的连线上，有利于水流畅通和池水的交换，设置叶轮式增氧机充分增氧并保持池水流动，为牙鲆的生长提供一个良好的环境；
2）在牙鲆的养殖过程中，每隔13天投药剂，该药剂的成分及其重量份为五倍子11份、蛋白多肽1.5份、连翘18份、黄芩15份、鱼腥草8份、板蓝根15份、苦参2份、金樱子2份，蛋白多肽的氨基酸序列为hshacasysryysvcgyyrgrcycrclrcrvlhpgklcvcvncsr，该多肽不需要消化，能直接被牙鲆吸收利用，摆脱了消化器官的局限性，吸收后，不会有任何排泄物，而且是全部被牙鲆吸收和利用，满足了牙鲆所需的蛋白质的量，大幅度提升其免疫力，从而达到了预防疾病的目的；该药剂成分均是中草药，对迟钝爱德华氏菌具有抑菌作用，在作用完成后残留少，不易导致病原菌产生耐药性，其作用不仅仅在于对病原微生物的直接抑杀作用，更重要的是通过对机体免疫系统的调节，即调动机体的抗应激能力和提高机体的免疫防御功能，从而达到预防传染性疾病的目的；
3）采用-70℃下保留的菌种，直接无菌条件下接种在液体培养基中，在29℃，200r/min振荡培养40h，将细菌8000r/min离心15min后倒掉上清，用pbs缓冲液洗涤后重新离心倒上清，重复4次，最后用pbs缓冲液稀释到半致死浓度，备用，用pbs缓冲液洗涤可去除原先的培养基成分以及除菌体外的一些其他杂质，保证爱德华氏菌的纯度；
4）挑选质量高的不同家系的10~12cm的幼鱼，按照0.22ml/10g体重腹腔注射半致死浓度的菌液，在水温为20℃下养殖，保持流水和通气，筛选出抗爱德华氏菌病家系，该步骤通过记录每个家系牙鲆的体色变化、活动力大小、摄食强弱、有无发病症状和死亡时间等信息，及时捞出死鱼，测量其全长(从吻端到尾鳍末端)、体重，并剪取鳍条保存，在实验结束时，记录每个家系的存活数目，测量存活鱼的全长和体重，筛选出抗爱德华氏菌病家系；
5）采用得到的抗爱德华氏菌感染牙鲆杂交与自交以及雌核发育后代，并对其后代进行养殖即得到抗爱德华氏菌病的牙鲆，该牙鲆是一种抗爱德华氏菌病的优良品种，能够解决牙鲆苗种夏季因感染迟钝爱德华氏菌而爆发腹水病引起大量死亡的问题，适合在全国沿海地区牙鲆养殖场推广应用，具有较大的发展市场空间。
上述液体培养基的成分及其重量份为：蛋白胨0.5份、酵母膏0.1份、磷酸高铁0.002克、琼脂2克、陈海水100份，灭菌，调ph值至7.6，该培养基能为爱德华氏菌提供生长繁殖所需的营养成分，使其能够快速繁殖。
实施例3
一种牙鲆抗爱德华氏菌病优良品种的人工选育方法，具体选育方法为：
选择2~3m水深池塘设置网箱养殖，每箱放养300～500尾牙鲆，每隔13~15天投药剂，该药剂的成分及其重量份为五倍子9份、蛋白多肽1.3份、连翘16份、黄芩15份、鱼腥草9份、板蓝根14份、苦参3份、金樱子2份；采用-75℃下保留的菌种，直接无菌条件下接种在液体培养基中，在29℃，200r/min振荡培养42h，将细菌8000r/min离心15min后倒掉上清，用pbs缓冲液洗涤后重新离心倒上清，重复3次，最后用pbs缓冲液稀释到半致死浓度；挑选质量高的不同家系的10~12cm的幼鱼，按照0.2ml/10g体重腹腔注射半致死浓度的菌液，在20℃下养殖，记录每个家系的存活数目，测量存活鱼的全长和体重，筛选出抗爱德华氏菌病家系；采用得到的抗爱德华氏菌感染牙鲆杂交与自交以及雌核发育后代，并对其后代进行养殖即得到抗爱德华氏菌病的牙鲆。
上述液体培养基的成分及其重量份为：蛋白胨0.6份、酵母膏0.12份、磷酸高铁0.0015克、琼脂1.8克、陈海水98份，灭菌，调ph值至7~8即可。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<110>舟山市普陀兴海养殖优质种苗选育研究所
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<213>人工合成
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