本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于冻存复苏后的细胞保存液及其用途。
背景技术：
细胞治疗是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。
细胞治疗的治疗范围包括:慢性疾病，如慢性肾衰竭、伴随胃、胆囊、胰腺功能下降的消化障碍、慢性便秘、慢性肝衰竭、椎间盘受损、脊柱疼痛、关节提前损耗等；退行性疾病，如共济失调、小脑萎缩、帕金森、多发性硬化症等；免疫性疾病，如红斑狼疮、类风湿性关节炎、青少年糖尿病、多种皮肤病等。
细胞的种类有很多，如间充质干细胞等，而在临床移植治疗中，不能将新鲜分离的干细胞直接输注于人体内，它需要先存放在可以输注的保存液(如0.9％氯化钠注射液)中一定时间，再输注于体内。有的细胞冻存一段时间后，需要复苏才能进行使用，而冻存复苏后的细胞，细胞膜较为脆弱、细胞的抵抗力较低，此时若使用常规的保存液保存细胞，则细胞的存活率会下降，同时污染率会增加，因此，尚需提供一种用于冻存复苏后的细胞保存液，来保证冻存复苏后的细胞的存活率和活性。
技术实现要素：
为了解决现有技术中细胞冻存复苏后在常规保存液中细胞膜脆弱导致细胞存活率低等问题，本发明提供了一种用于冻存复苏后的细胞保存液，该保存液延长了冻存复苏后的细胞的活性维持时间，降低其污染率，提高其存活率。
本发明具体技术方案如下:
本发明提供了一种用于冻存复苏后的细胞保存液，该保存液主要是由醋酸铵和人参总皂苷用浓度为40-55mg/ml的mem培养基水溶液溶解而成，其中醋酸铵溶解后的浓度为25-32mg/ml，人参总皂苷溶解后的浓度为20-28mg/ml。
进一步的改进，该保存液主要是由醋酸铵和人参总皂苷用浓度为45mg/ml的mem培养基水溶液溶解而成，其中醋酸铵溶解后的浓度为30mg/ml，人参总皂苷溶解后的浓度为25mg/ml。
进一步的改进，mem培养基为l型mem培养基。
其中，l型mem培养基包含:200.00mg/l的无水氯化钙、97.67mg/l的硫酸镁、400.00mg/l的氯化钾、6800.00mg/l的氯化钠、115.00mg/l的无水磷酸二氢钠、126.00mg/l的l-盐酸精氨酸、31.00mg/l的l-盐酸胱氨酸、292.00mg/l的l-谷氨酰胺、42.00mg/l的l-盐酸组氨酸、52.00mg/l的l-异亮氨酸、52.00mg/l的l-亮氨酸、73.00mg/l的l-盐酸赖氨酸、15.00mg/l的l-甲硫氨酸、32.00mg/l的l-苯丙氨酸、48.00mg/l的l-苏氨酸、18.00mg/l的l-色氨酸、36.00mg/l的l-酪氨酸、46.00mg/l的l-缬氨酸、1.00mg/l的d-泛酸钙、1.00mg/l的叶酸、2.00mg/l的肌醇、1.00mg/l的烟酰胺、1.00mg/l的氯化胆碱、1.00mg/l的盐酸吡哆辛、0.10mg/l的核黄素、1.00mg/l的盐酸硫胺、1000.00mg/l的葡萄糖和10.00mg/l的酚红。
本发明通过将醋酸铵、人参总皂苷溶解于mem培养基中，形成保存液，为细胞提供养分，进而提高细胞的存活率，延长细胞的保存时间。
进一步的改进，保存液还包含浓度为20-36mg/ml的金霉素、浓度为15-25mg/ml的头孢吡肟和浓度为10-24mg/ml的柳氮磺吡啶。
本发明通过在保存液中加入金霉素、头孢吡肟和柳氮磺吡啶组成的混合抗生素，可降低细胞的染菌率，进而保证其质量。
进一步的改进，保存液还包含浓度为5-8mg/ml的磷酸氢钙、浓度为20-30mg/ml的白蛋白和浓度为30-45/ml的海藻糖。
其中，白蛋白可以是卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白等任何白蛋白。
本发明通过在保存液中加入磷酸氢钙、白蛋白和海藻糖，可增强保存液的稳定性。
保存液还包含浓度为10-25mg/ml的虾青素、浓度为5-15mg/ml的毛地黄黄酮和浓度为20-30mg/ml的维生素e。
本发明通过在保存液中加入虾青素、毛地黄黄酮和维生素e，可提高冻存复苏后的细胞的扩增倍数。
本发明还提供了一种用于冻存复苏后的细胞保存液的制备方法，该方法包括如下步骤:
s1:配制浓度为40-55mg/ml的mem培养基水溶液；
s2:将醋酸铵和人参总皂苷放置于s1获得的mem培养基水溶液中搅拌至均匀，其中，醋酸铵溶解后的浓度为25-32mg/ml，人参总皂苷溶解后的浓度为20-28mg/ml，得混合液；
s3:将s2获得的混合液用细菌过滤器过滤，于冰水浴中降温至0℃，即得。
进一步的改进，s2的搅拌速度为500r/min。
本发明提供一种用于冻存复苏后的细胞保存液，该保存液可用于保存冻存复苏后的细胞，延长其活性维持时间。
本发明的有益效果如下:本发明提供的用于冻存复苏后的细胞保存液可降低冻存复苏后的细胞的染菌率，使其在9个月内保持稳定，最大程度的延长细胞的活性维持时间。
具体实施方式
实施例1
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，该保存液主要是由醋酸铵和人参总皂苷用浓度为40mg/ml的mem培养基水溶液溶解而成，其中醋酸铵溶解后的浓度为25mg/ml，人参总皂苷溶解后的浓度为20mg/ml。
实施例2
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，该保存液主要是由醋酸铵和人参总皂苷用浓度为45mg/ml的mem培养基水溶液溶解而成，其中醋酸铵溶解后的浓度为30mg/ml，人参总皂苷溶解后的浓度为25mg/ml。
实施例3
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，该保存液主要是由醋酸铵和人参总皂苷用浓度为55mg/ml的mem培养基水溶液溶解而成，其中醋酸铵溶解后的浓度为32mg/ml，人参总皂苷溶解后的浓度为28mg/ml。
实施例4
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，该保存液主要是由醋酸铵和人参总皂苷用浓度为45mg/ml的mem培养基水溶液溶解而成，其中醋酸铵溶解后的浓度为30mg/ml，人参总皂苷溶解后的浓度为25mg/ml；
该冻存复苏后的细胞保存液的制备方法包括如下步骤:
s1:配制浓度为45mg/ml的mem培养基水溶液；
s2:将醋酸铵和人参总皂苷放置于s1获得的mem培养基水溶液中搅拌至均匀，其中醋酸铵溶解后的浓度为30mg/ml，人参总皂苷溶解后的浓度为25mg/ml，得混合液；
s3:将s2获得的混合液用细菌过滤器过滤，于冰水浴中降温至0℃，即得。
实施例5
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的不同之处在于，保存液还包含浓度为20mg/ml的金霉素、浓度为15mg/ml的头孢吡肟和浓度为10mg/ml的柳氮磺吡啶。
实施例6
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的不同之处在于，保存液还包含浓度为28mg/ml的金霉素、浓度为20mg/ml的头孢吡肟和浓度为18mg/ml的柳氮磺吡啶。
实施例7
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的不同之处在于，保存液还包含浓度为36mg/ml的金霉素、浓度为25mg/ml的头孢吡肟和浓度为24mg/ml的柳氮磺吡啶。
实施例8
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的不同之处在于，保存液还包含浓度为5mg/ml的磷酸氢钙、浓度为20mg/ml的白蛋白和浓度为30mg/ml的海藻糖。
实施例9
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的不同之处在于，保存液还包含浓度为6mg/ml的磷酸氢钙、浓度为25mg/ml的白蛋白和浓度为38mg/ml的海藻糖。
实施例10
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的不同之处在于，保存液还包含浓度为8mg/ml的磷酸氢钙、浓度为30mg/ml的白蛋白和浓度为45mg/ml的海藻糖。
实施例11
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的不同之处在于，保存液还包含浓度为10mg/ml的虾青素、浓度为5mg/ml的毛地黄黄酮和浓度为20mg/ml的维生素e。
实施例12
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的不同之处在于，保存液还包含浓度为15mg/ml的虾青素、浓度为10mg/ml的毛地黄黄酮和浓度为25mg/ml的维生素e。
实施例13
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的不同之处在于，保存液还包含浓度为25mg/ml的虾青素、浓度为15mg/ml的毛地黄黄酮和浓度为30mg/ml的维生素e。
对照例1
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的区别之处在于，增加了浓度为10mg/ml的枸橼酸钠。
对照例2
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的区别之处在于，用维生素c代替了人参总皂苷。
对照例3
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例2的区别之处在于，删除了人参总皂苷。
对照例4
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例7的不同之处在于，增加了浓度为10mg/ml的头孢喹肟。
对照例5
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例7的不同之处在于，用氯霉素代替了金霉素。
对照例6
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例7的不同之处在于，删除了柳氮磺吡啶。
对照例7
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例10的不同之处在于，增加了浓度为20mg/ml的月桂酸。
对照例8
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例10的不同之处在于，用海藻酸钠代替了海藻糖。
对照例9
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例10的不同之处在于，删除了白蛋白。
对照例10
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例12的不同之处在于，增加了浓度为5mg/ml的超氧化物歧化酶。
对照例11
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例12的不同之处在于，用谷胱甘肽替代了维生素e。
对照例12
一种用于冻存复苏后的细胞保存液，与实施例12的不同之处在于，删除了毛地黄黄酮。
试验例1存活率试验
将间充质干细胞冻存20天后复苏，分为6组，然后再分别浸没在实施例1-3和对照例1-3的保存液中，置于液氮中冻存3天，检测不同保存液中的间充质干细胞在第一次冻存后及第二次冻存后的数量和生长情况，结果如表1所示；
其中，存活率(％)＝保存后细胞数量/细胞的原始数量×100％。
表1不同的保存液保存的间充质干细胞的存活率试验结果
由表1可知，保存于实施例1-3的保存液中的间充质干细胞的存活率均高于对照例1-3，而实施例2的保存效果好于实施例1和实施例3，证明当保存液是由醋酸铵和人参总皂苷用浓度为45mg/ml的mem培养基水溶液溶解而成，其中醋酸铵溶解后的浓度为30mg/ml，人参总皂苷溶解后的浓度为25mg/ml时，对间充质干细胞的保存效果最好。
试验例2污染率试验
分别将冻存48h后复苏的肝细胞，放置于实施例5-7和对照例4-6的保存液中，在液氮中保存12天，将冻存的细胞消化处理后用菌落计数法检测细胞污染的数量，并计算污染率，结果如表2所示。
表2不同的保存液保存的肝细胞的污染率试验结果
由表2可知，实施例5-7的保存液保存的间充质干细胞的污染率显著低于对照例4-6组的保存液，而实施例6的保存液中的肝细胞的污染率最低，证明实施例6的保存液的抗污染效果最好；当保存液中的金霉素、头孢吡肟和柳氮磺吡啶中的成分缺少其一或被别的成分代替后，肝细胞的污染率大大提升，证明当保存液中含有浓度为28mg/ml的金霉素、浓度为20mg/ml的头孢吡肟和浓度为18mg/ml的柳氮磺吡啶时，保存液的抗污染能力最强。
试验例3稳定性试验
取实施例8-10和对照例7-9的用于冻存复苏后的细胞保存液，在温度为40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置12个月，分别在保存后的1个月、3个月、6个月、9个月、12个月后取样一次，检测保存液的性状和色泽，试验结果见表3。
表3用于冻存复苏后的细胞保存液的稳定性试验结果
其中:“-”表示没有，“√”表示有。
由表3可知，实施例8-10的保存液在9个月以内稳定性良好，而对照例7-9在第6个月已经开始出现分层等现象，而实施例9的稳定性好于实施例8和实施例10，证明当保存液中含有浓度为6mg/ml的磷酸氢钙、浓度为25mg/ml的白蛋白和浓度为38mg/ml的海藻糖时，保存液的稳定性最好，减少或改变其中任何一个组分，保存液的稳定性都会下降。
试验例4细胞扩增试验
分别用实施例11-13和对照例10-12的保存液保存肝细胞，进行体外扩增培养，两天后取样，采用dipa法进行细胞计数，计算扩增倍数，结果见表4。
表4不同保存液保存的肝细胞的扩增倍数结果
由表4可知，实施例11-13的保存液保存的肝细胞的扩增倍数高于对照例10-12的保存液，实施例12的保存液中肝细胞的扩增倍数最高，证明当保存液中含有浓度为15mg/ml的虾青素、浓度为10mg/ml的毛地黄黄酮和浓度为25mg/ml的维生素e时，能够提高细胞的扩增倍数。
最后应说明的是，以上实施例只用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳试验例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中，本发明的试验例虽然只使用间充质干细胞和肝细胞作为试验细胞来考察用于冻存复苏后的细胞保存液的存活率和污染率，但并不局限于这两种细胞，其他细胞均能达到以上效果。