本发明涉及中药材组培技术领域，尤其涉及一种青牛胆组培快繁方法。
背景技术
青牛胆(tinosporasagittata(oliv.)gagnep.)为防己科青牛胆属植物，以块根入药，药材名金果榄，有清热解毒，利咽，止痛的功效，主要用于咽喉肿痛，痈疽疗毒，泄泻，痢疾，脘腹疼痛。主要分布于湖北、四川、西藏、贵州、云南、湖南、江西、福建、广西。
以青牛胆为植物基源的药材金果榄属于冷背药材，但近年来，随着用途的研究开发与应用，金果榄药材需求突飞猛增，而有限的野生资源不能满足市场需求，其价格亦随之迅猛上涨，各企事业单位纷纷开展青牛胆的种植技术研究，但由于青牛胆种子量少、种子发芽率低、发芽周期长，使得传统的种子繁殖繁殖率低，不能满足规模化种植需求，部分企事业单位在扦插、压条繁殖上虽然取得突破，但均存在繁殖率极低、生长缓慢的困境。近年来有单位开始金果榄的组培技术研究并获得成功，但在青牛胆的组培快繁技术研究方面，未见报道。
技术实现要素：
本发明针对以上所述现有技术的不足，发明了一种成本低、操作简便、生产周期短的青牛胆组培快繁技术，可为规模化种植短期内快速提供优质种苗的繁育方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种青牛胆组培快繁方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)外植体选择、(2)外植体消毒、(3)丛生芽诱导、(4)丛生芽增殖、(5)丛生芽生根；
优选地，所述的外植体选择包含以下步骤：选择健壮植株栽植于室内，每隔7天用75％多菌灵500倍液喷施3-5次，选取幼嫩茎段；更加优选地，所述的幼嫩茎段为端部20～30cm的茎段；
优选地，所述的外植体消毒包含以下步骤：将选取的外植体用饱和肥皂水溶液涮洗后冲淋，在超净工作台上依次用酒精、漂白粉溶液及升汞溶液消毒；更加优选地，所述的外植体消毒包含以下步骤：使用75％酒精消毒30～40s，饱和漂白粉溶液消毒30～40min，0.1％升汞溶液+吐温-80消毒10～15min；
优选地，所述的丛生芽诱导包含以下步骤：将消毒好的外植体，剪去两端伤口，切成带单芽茎段，接种在诱导培养基上，在一定温度、光照强度和光周期环境下培养；更加优选地，所述的诱导培养基为wpm+iaa0.01～0.1mg/l+kt2.0～3.0mg/l+tdz0.05～0.2mg/l+性炭0.5g/l，培养温度为23～27℃，以光照强度1000～2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养；
优选地，所述的丛生芽增殖包含以下步骤：将诱导出的丛生芽切成单芽，接种在增殖培养基上，在一定温度、光照强度和光周期环境下培养；更加优选地，所述的增殖培养基为ms+naa0.01～0.1mg/l+kt2.0～3.0mg/l+tiba1.0～2.0mg/l+硝酸银1.0μg/l+椰汁50～100ml/l，培养温度为23～27℃，以光照强度1000～2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养；
优选地，所述的丛生芽生根包含以下步骤：将增殖获得的丛生芽分成单芽，接种在生根培养基上，在一定温度、光照强度和光周期环境下培养；更加优选地，所述的生根培养基为1/2ms+iba1.0～2.0mg/l+椰汁50～100ml/l+活性炭0.5g/l，培养温度为23～27℃，以光照强度3000～4000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养；
本发明还提供用于青牛胆组培快繁方法的培养基，所述培养基用于丛生芽诱导，所述培养基包含以下成分：wpm+iaa0.01～0.1mg/l+kt2.0～3.0mg/l+tdz0.05～0.2mg/l+性炭0.5g/l；
本发明还提供用于青牛胆组培快繁方法的培养基，所述培养基用于丛生芽增殖，所述培养基包含以下成分：ms+naa0.01～0.1mg/l+kt2.0～3.0mg/l+tiba1.0～2.0mg/l+硝酸银1.0μg/l+椰汁50～100ml/l；
本发明还提供用于青牛胆组培快繁方法的培养基，所述培养基用于丛生芽生根，所述培养基包含以下成分：1/2ms+iba1.0～2.0mg/l+椰汁50～100ml/l+活性炭0.5g/l。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的青牛胆组培快繁方法，外植体的采集时间为3月至10月，可采集周期长，经采集后可继续生长，到收获季节亦可同其他未采集的植株同时收获且不影响产量及品质。
(2)本发明的青牛胆组培快繁方法，繁殖速度快、繁殖率高，一株植株一年可采集30～40个带芽茎段，经初代诱导，增殖与生根培养，约7～8个月，即可获得生根苗约20万株。
(3)本发明的青牛胆组培快繁方法，污染率低、丛生芽诱导率、增殖系数、生根率高，组培效率高，成本低廉，具有极高的产业推广价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步的说明，但本发明并不局限于此。
实施例1
(1)将健壮植株栽植于室内，每隔7天用75％多菌灵500倍液喷施3次，选取端部20～30cm的幼嫩茎段，作为外植体；
(2)将选取的外植体去叶，剪成2～3cm的带芽茎段，用饱和肥皂水溶液涮洗后，用软牙刷刷去表皮及凹陷处脏物，后用自来水漂洗3～4次至无肥皂液残留，加2～3滴吐温-80及适量水，振摇15min，自来水冲淋60min。转移至超净工作台上，用75％酒精消毒40s，无菌水冲洗2～3次，饱和漂白粉溶液消毒40min，无菌水冲洗2～3次，0.1％升汞溶液+2～3滴吐温-80消毒15min，无菌水冲洗6次；
(3)将消毒好的外植体，用无菌纸吸取表面水分，剪去两端伤口至茎段1.0～1.5cm，斜插于wpm+iaa0.1mg/l+kt3.0mg/l+tdz0.2mg/l+性炭0.5g/l的诱导培养基上，在温度为26℃，以光照强度2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养50天；记录污染率、丛生芽诱导率。
(4)将诱导出的丛生芽剪成单芽，斜插于ms+naa0.1mg/l+kt3.0mg/l+tiba2.0mg/l+硝酸银1.0μg/l+椰汁100ml/l的增殖培养基内，在温度为26℃，以光照强度2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养33天；记录丛生芽增殖情况。
(5)将诱导或增殖的丛生芽切成具2～3个芽的茎段，直立于1/2ms+iba2.0mg/l+椰汁100ml/l+活性炭0.5g/l的生根培养基中，在温度为26℃，以光照强度4000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养35天；记录生根情况。
(6)将具2～3条根，高度5～10cm的青牛胆组培苗瓶苗，洗净培养基，栽植于泥炭土与珍珠岩以5:1比例复配的炼苗基质中，保持空气湿度在80％，进行炼苗；记录炼苗情况。
实施例2
(1)将健壮植株栽植于室内，每隔7天用75％多菌灵500倍液喷施4次，选取端部20～30cm的幼嫩茎段，作为外植体；
(2)将选取的外植体去叶，剪成2～3cm的带芽茎段，用饱和肥皂水溶液涮洗后，用软牙刷刷去表皮及凹陷处脏物，后用自来水漂洗3～4次至无肥皂液残留，加2～3滴吐温-80及适量水，振摇10min，自来水冲淋50min。转移至超净工作台上，用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗2～3次，饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水冲洗2～3次，0.1％升汞溶液+2～3滴吐温-80消毒10min，无菌水冲洗7次；
(3)将消毒好的外植体，用无菌纸吸取表面水分，剪去两端伤口至茎段1.0～1.5cm，斜插于wpm+iaa0.01mg/l+kt2.0mg/l+tdz0.05mg/l+性炭0.5g/l的诱导培养基上，在温度为23℃，以光照强度1000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养58天；记录污染率、丛生芽诱导率。
(4)将诱导出的丛生芽剪成单芽，斜插于ms+naa0.01mg/l+kt2.0mg/l+tiba1.0mg/l+硝酸银1.0μg/l+椰汁50ml/l的增殖培养基内，在温度为23℃，以光照强度1000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养40天；记录丛生芽增殖情况。
(5)将诱导或增殖的丛生芽切成具2～3个芽的茎段，直立于1/2ms+iba1.0mg/l+椰汁50ml/l+活性炭0.5g/l的生根培养就中，在温度为23℃，以光照强度3000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养，培养42天；记录生根情况。
(6)将具2～3条根，高度5～10cm的青牛胆组培苗瓶苗，洗净培养基，栽植于泥炭土与珍珠岩以5:1比例复配的炼苗基质中，保持空气湿度在80％，进行炼苗；记录炼苗情况。
对比例1-2按实施例1的步骤进行，不同点在于步骤(3)中的诱导培养基、步骤(4)中的增殖培养基、步骤(5)中的生根培养基不同，对比例1-2步骤(3)、(4)、(5)中培养基分别为：
对比例1：
步骤(3)中的诱导培养基为：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.18mg/l+ga31mg/l+kt0.15mg/l，ph4.5；
步骤(4)中的增殖培养基为：ms+6-ba0.1mg/l+naa2.0mg/l+2，4-d0.1mg/l+蔗糖30g/l，ph4.5；
步骤(5)中的生根培养基为：1/2ms+6-ba0.5mg/l+naa1.5mg/l+香蕉泥20g/l+蔗糖30g/l，ph5.8。
对比例2：
步骤(3)中的诱导培养基为：ms+6-ba1.0mg/l+kt0.5mg/l+2,4-d0.1mg/l；
步骤(4)中的增殖培养基为：ms+6-ba0.5mg/l+ga0.2mg/l+naa0.2mg/l；
步骤(5)中的生根培养基为：1/2ms+iba0.2mg/l+naa0.4mg/l。
对实施例1-2、对比例1-2各项数据进行统计分析，结果见表1。
表1
由表1可知，本发明的消毒方法具有很好的灭菌效果，丛生芽导率、增值系数、生根率、炼苗存活率均优于现有技术，可见本发明的组培快繁方法具有大规模应用的价值。