本发明涉及生物领域，特别涉及一种木霉菌剂及其制备方法。二、
背景技术：
：玉米苗期根腐病是一种分布广、危害严重、病原菌种类繁多和防治较困难的世界性病害。该病是由多种病原菌复合侵染引起，主要危害玉米的根及茎基部，引起根系及茎基部受害部位变褐坏死，影响作物对水分和养分的吸收，地上部叶片边缘出现黄褐色云纹状斑。玉米苗期根腐病的症状表现为：在玉米3～6叶期，地上部生长受到抑制，株型矮小，下部叶片从叶缘开始出现黄化症状，进而叶片或整株变黄，或出现褐色斑；胚根和须根上有褐色病斑，或腐烂，或缢缩。轻者可逐渐恢复，但是生长趋势明显减弱，影响产量，重者死亡，造成缺苗断垄。国外报导引起玉米根腐病的病原菌有：禾生腐霉菌、禾谷镰刀菌、蠕孢菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌等，主要病原菌为腐霉菌和镰刀菌。国内报导的病原菌有：串珠镰刀菌、串珠镰刀菌胶孢变种、禾谷镰刀菌、蠕孢菌、腐霉菌、丝核菌等。玉米根腐病的主要病原菌为串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌，不同地区病原菌组成因生态环境的不同而略有差异。玉米苗期根腐病的初侵染源为种子和土壤中的病原菌，在适宜的条件下侵入植株地下部，引起发病。传统的防治方法主要是化学药剂拌种。但该防治方法存在较多缺点：一是化学药剂只能杀死种子及周围的病原菌，而对稍远一些的病原菌却无能为力，而且在杀死病原菌的同时，也将有益微生物无选择地杀死；二是药剂防治，药量大，毒性大，污染重，长期使用会导致病原菌产生抗药性，使化学药剂失去了原有的防治作用。木霉菌作为一种生防菌，可以防治很多经济作物的主要病害，对发生在根部和叶部病害都有很好的防治效果，近年来对储藏期病害也有研究。木霉菌对一些土传植物病原菌的防治具有很好的效果，这些病原菌包括：丝核菌属、小核菌属、镰刀菌属(r/sarium)、腐霉属(pythium)、疫霉属(iphytophthora)等，并且木霉菌的不同种、同种不同菌株甚至同一菌株的不同后代个体都存在着拮抗性的差异及拮抗对象种类上的差别。作为普遍存在并具有丰富资源的拮抗微生物，在土传病害的生物防治中具有重要的地位。木霉菌的作用机制几乎包括了所有可能机制，并因此而受到广泛的关注，也是其用途广泛、效果突出的重要原因。据报导，木霉菌至少有如下几种作用机制：竞争作用、抗生作用、溶菌作用、寄生作用、诱导抗性、协同拮抗作用。三、技术实现要素：本发明的目的之一是提供一种木霉菌剂及其制备方法。本发明的目的之二是提供一种木霉菌的制备方法。本发明的这些以及其它目的将通过下列详细说明和描述来进一步体现。本发明的木霉菌剂，由木霉菌分生孢子粉、紫外保护剂和载体组成，其质量比为木霉菌分生孢子粉：紫外保护剂：载体为10：0.5～2：3～8。进一步的，本发明的木霉菌剂，由木霉菌分生孢子粉、紫外保护剂和载体组成，其质量比为木霉菌分生孢子粉：紫外保护剂：载体为10：0.8～1.5：4～6。较好的是，本发明的木霉菌剂，由木霉菌分生孢子粉、紫外保护剂和载体组成，其质量比为木霉菌分生孢子粉：紫外保护剂：载体为10：1：5。在本发明的木霉菌剂中，其中的木霉菌按以下方法制备：(1)将长枝木霉菌株接种到pda培养基上培养3～8天；(2)将麸皮0.3～1.0g、硫酸铵0.1～0.6g、磷酸二氢钾0.05～0.5g、碳酸钙0.05～0.5g、葡萄糖0.5～3g用无菌水配制成液体发酵培养基50～150ml,调整ph值为5.5～6，高压灭菌30～40min，冷却后，接入步骤(1)所得的长枝木霉菌种，于26～30℃振荡培养50～80小时后停止，得木霉菌孢子悬浮液；(3)取重量配比为1:3～6的菌糠和玉米秸秆粉混合作为培养基质，培养基质含水量为40％～70％，110～130℃灭菌20～40min；将步骤(2)的木霉菌孢子悬浮液稀释至浓度为1x107cfu/ml，每100g培养基质接种10ml浓度为ixio7cfuail的木霉菌孢子悬浮液，木霉菌进入产生孢子温度通常低温约10度以下、相对湿度为90％，发酵6～10天停止，风干后储存即得较好的是，在本发明的木霉菌剂中，其中的木霉菌按以下方法制备：(1)将长枝木霉菌株接种到pda培养基上培养5天；(2)将麸皮0.5～0.8g、硫酸铵0.2～0.4g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、碳酸钙0.1～0.3g、葡萄糖1～2g用无菌水配制成液体发酵培养基100ml,调整ph值为5.5～6，高压灭菌30～40min，冷却后，接入步骤(1)所得的长枝木霉菌种，于26～30℃振荡培养50～60小时后停止，得木霉菌孢子悬浮液；(3)取重量配比为1:4的菌糠和玉米秸秆粉混合作为培养基质，培养基质含水量为55％～65％，120℃灭菌30min；将步骤(2)的木霉菌孢子悬浮液稀释至浓度为1x107cfu/ml，每ioog培养基质接种ioml浓度为ixio7cfuail的木霉菌孢子悬浮液，木霉菌进入产生孢子温度通常低温约10度以下、相对湿度为90％，发酵8天停止，风干后储存即得。在本发明的木霉菌剂中，所述的紫外保护剂为腐植酸、黄原胶或抗坏血酸，较好的是腐植酸；所述的载体为红土、高岭土、碳酸钙、滑石粉、硅藻土、硅胶、膨润土或蛭石，较好的是蛭石。本发明的木霉菌剂的制备方法，是将载体进行粉碎，控制其细度为30～80目，调节湿度为6～15质量％，向载体中加入紫外保护剂，调配均匀后备用；将满载木霉菌分生孢子的固体培养料(通常属于纤维质或木质素等既可)常温干燥后，用粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子粉，将木霉菌分生孢子粉溶于木霉菌分生孢子粉重量5～10倍的水中混匀后，均匀喷洒到载体和紫外保护剂的混合物上，混匀，在鼓风干燥箱中进行烘干，使菌剂的相对湿度控制在8～20质量％，密封包装保存即得木霉菌剂。较好的是，本发明的木霉菌剂的制备方法，是将载体进行粉碎，控制其细度为40～60目，调节湿度为8～12质量％，向载体中加入紫外保护剂，调配均匀后备用；将满载木霉菌分生孢子的固体培养料(通常属于纤维质或木质素等既可)常温干燥后，用粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子粉，将木霉菌分生孢子粉溶于木霉菌分生孢子粉重量8倍的水中混匀后，均匀喷洒到载体和紫外保护剂的混合物上，混匀，在鼓风干燥箱中进行烘干，使菌剂的相对湿度控制在10～15质量％，密封包装保存即得木霉菌剂，其中木霉菌分生孢子粉：紫外保护剂：载体为10：0.8～1.5：4～6。本发明的木霉菌剂，由木霉菌分生孢子粉、紫外保护剂和载体组成，其质量比为木霉菌分生孢子粉：腐植酸：蛭石为10：1：5；其中：所述的木霉菌按以下方法制备：(1)将长枝木霉菌株接种到pda培养基上培养5天；(2)将麸皮0.5～0.8g、硫酸铵0.2～0.4g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、碳酸钙0.1～0.3g、葡萄糖1～2g用无菌水配制成液体发酵培养基100ml,调整ph值为5.5～6，高压灭菌30～40min，冷却后，接入步骤(1)所得的长枝木霉菌种，于26～30℃振荡培养50～60小时后停止，得木霉菌孢子悬浮液；(3)取重量配比为1:4的菌糠和玉米秸秆粉混合作为培养基质，培养基质含水量为55％～65％，120℃灭菌30min；将步骤(2)的木霉菌孢子悬浮液稀释至浓度为1x107cfu/ml，每100g培养基质接种10ml浓度为ixio7cfuail的木霉菌孢子悬浮液，木霉菌进入产生孢子温度通常低温约10度以下、相对湿度为90％，发酵8天停止，风干后储存即得。所述的木霉菌剂按以下方法制备：将蛭石进行粉碎，控制其细度为40～60目，调节湿度为8～12质量％，向载体中加入腐植酸，调配均匀后备用；将满载木霉菌分生孢子的固体培养料(通常属于纤维质或木质素等既可)常温干燥后，用粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子粉，将木霉菌分生孢子粉溶于木霉菌分生孢子粉重量8倍的水中混匀后，均匀喷洒到载体和紫外保护剂的混合物上，混匀，在鼓风干燥箱中进行烘干，使菌剂的相对湿度控制在10～15质量％，密封包装保存即得木霉菌剂。本发明木霉菌发酵工艺的有益效果是：生产周期短，工序简便，产孢量大，在固体发酵阶段木霉分生孢子的产孢量高，每克发酵物含孢子量为1.37xio10-l51x101°个；发酵后制备的木霉菌剂贮存期长，能有效贮存1年以上，防病效果佳，出苗率提高约45％，存活率比对照高50％，保苗效果好，感病指数降低60％，对人畜和生态环境无害，无残留，不产生抗药性，原料来源广，生产成本低于化学农药多菌灵等，还可以变废为宝，具有很好的经济效益和社会效益。以堆肥为例:所谓堆肥化作用即利用广泛分布于自然界之微生物，在控制的条件下，将废弃物中不稳定的有机组成分加以分解，转换为安定的腐植质成份，即腐熟的堆肥。微生物在堆肥化过程中，担任有机物分解与堆肥稳定化之重要角色。不同的堆积材料如能接种适当的微生物菌种，可以加速堆肥发酵。为达到最有效率之堆肥化作用，除了添加适当的微生物菌种外，在堆积材料环境中，维持微生物最适宜之生长条件，使微生物充分的活动与繁殖，亦能加强堆肥材料的发酵与分解。为了增进堆肥材料发酵分解效率，针对不同有机物材料特性，施予适当的微生物菌种，将是堆肥制作过程之重要步骤之一。其中有关于利用微生物菌种的关键机制，应包括筛选出适当的微生物菌种、建立有效率的菌种培养繁殖方法与应用于堆肥材料中的接种方法等。产品特性：本发明的木霉菌分离菌株是台中改良场从农田土壤筛选出的新型本土有益微生物菌种之一。如在牛粪堆肥制作时，先调配适当的有机材料种类及用量，再配合接种适量的木霉菌及调整水份含量于堆积后第2-3日，堆肥温度可以快速提高至60℃以上，且堆肥化过程中的臭味也明显降低，腐熟时程估计可提早4～6日，堆肥成品外观颜色较深黑褐且松软。腐熟牛粪堆肥的氮含量约2.51％、磷含量约1.27％、钾含量约2.70％、钙含量约1.59％、镁含量约1.67％、锌含量约85ppm、铜含量约32ppm、ph值约7.27、ec值约6.87ds/m2、有机质含量约60.7％，木霉菌数7.1×106spore/g。由田间试验结果显示，应用于非洲菊、洋桔梗、茭白笋、西红柿等花卉及蔬果类栽培上，都具有增产与提升质量之效益。以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但实施例仅用于说明，并不能限制本发明的范围。在本发明中，如非特指，所有的量、份、百分比均为质量单位，所有的原料均可以从市场购得。实施例1：木霉菌的发酵工艺一、材料与方法：①木霉菌株：长枝木霉菌株；②营养条件：(a)斜面培养基：将长枝木霉菌株接种到pda培养基上培养5天；(b)液体培养基：成分为麸皮0.5～0.8g、硫酸铵0.2～0.4g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、碳酸钙0.1～0.3g、葡萄糖l～2g，将上述物质用无菌水配制液体发酵培养基100ml,调整ph值为5.5～6，高压灭菌30～40min，冷却后，接入长枝木霉菌种，于振荡培养60小时后停止，备用；(c)固体发酵培养基质的选择：以木霉菌t-c7为发酵菌株并进行菌剂加工工艺研究，根据已有的报导，选择菌糠和玉米秸秆粉作为木霉菌株发酵培养基质，菌糠是利用秸秆、木屑等原料进行食用菌代料栽培，收货后的培养基剩余物，俗称食用菌栽培废料、菌渣或余料；是食用菌菌丝残体及经食用菌酶解，结构发生质变的粗纤维等成分的复合物。不同配比的培养基质和含水量对产孢量的影响：选择菌糠：玉米秸秆粉的重量比＝1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5，二者混合总量为50g，含水量分别为50％、55％、60％、65％、70％(w/w)，装入500ml三角瓶中，重复3次，灭菌备用。接入木霉菌株t-c7的孢子悬浮液5.oml(1.0x107cfu/ml),纱布封口，保证良好的透气性，26℃培养(光照：黑暗＝12:12)，培养环境相对湿度为90％。从第4天开始，每隔i天搅拌一次，培养至第10天，自然风干得产品。然后取部分发酵产物60℃干燥箱内烘干8小时，测定孢子量，以50g玉米秸秆粉为对照,如表1所示。表1实施例2：不同接种量对发酵时间和产孢量的影响：将菌糠和玉米秸秆粉的混合物(二者重量比为1:4)混合总量为50g，加蒸馏水100ml装入500ml三角瓶中，灭菌备用。分别接入木霉菌株t-c7孢子悬浮液5.0ml，孢子悬浮液浓度分别为1.0x105cfu/ml、l.0x106cfu/ml、l.0x107cfu/ml、l.0x108cfu/ml、1.0x109cfu/ml，用6层纱布封口，保证良好的透气性，26℃分别培养(光照:黑暗＝12:12)5d、7d、10d和12d。培养环境相对湿度为90％。从第4d开始，每隔id搅拌一次。发酵结束后，取部分发酵产物60℃干燥箱内烘干8h，检查孢子量。每一处理重复4次，如表2所示。表2实施例3：木霉菌剂的制备方法：材料与方法：一、试菌株：木霉菌(实施例1制备)二、载体的筛选：供试载体包括红土、高岭土、碳酸钙、滑石粉、硅藻土、硅胶、膨润土或蛭石等a、载体对木霉菌生长速度的影响：以5％的比例将各种供试载体加入pda培养基中制成平板，接入培养4d的木霉菌饼(d＝5mm)，25℃下培养4d，测量菌落直径大小并计算菌落直径日增长量。b、菌落直径日增长量(cm/d)＝(菌落直径-0.5cm)/4(b)载体对木霉菌产孢量的影响：在上述培养4d的木霉菌菌落边缘用打孔器(d＝5mm)打取1块菌饼置于含两滴吐温-80的10ml无菌水中，充分摇匀，使孢子全部脱落，用血球计数板计数并计算单位面积产孢量。产孢量(个/cm2)＝(平均每格孢子数x4x106x稀释倍数)/0.19625。c、外保护剂的筛选：供试紫外保护剂包括腐植酸、黄原胶、抗坏血酸。a、紫外保护剂对木霉菌生长速度的影响：将腐植酸、黄原胶、抗坏血酸各0.5g分别加入到100mlpda培养基中，制成培养基平板，将木霉菌块接入培养基平板中，每个处理重复4次，以pda平板中不加紫外保护剂的处理为对照，紫外光照射30min，25℃黑暗培养箱中培养，4d测量菌落直径大小，并计算菌落直径日增长量。b、紫外保护剂对木霉菌产孢量的影响：在上述步骤a培养4d的木霉菌菌落边缘用打孔器(d＝5mm)打取1块菌饼置于含两滴吐温-80的10ml无菌水中，充分摇匀，使孢子全部脱落，用血球计数板计数并计算单位面积产孢量。c、蛭石ph值的测定：取i0g蛭石放入具有磨口塞的锥形瓶中，加入ph7.0的蒸馏水40ml，塞紧瓶塞剧烈摇动1min，再加蒸馏水50ml，摇动1min，静置后取上层清液，然后测定ph值。三、结果与分析：a、载体的筛选：试验结果，供试载体对木霉菌落生长、产孢量都有影响，以蛭石对孢子活力保护最好，甚至还有促进菌落生长的作用，其他载体的菌落生长量与产孢量与对照相比有显著的差异。b、紫外保护剂的筛选：供试的紫外保护剂中腐殖酸对木霉菌落生长有促进作用、对产孢量影响不大；黄原胶对木霉菌落生长也有促进作用，但产孢量降低；抗坏血酸对木霉菌的菌落生长和产孢量有抑制作用，如表3所示。表3菌落直径(cm/d)产孢量(107个/cm2)腐殖酸3.41±0.223.11±0.18黄原胶3.21±0.131.74±0.09抗坏血酸1.32±0.111.46±0.14ck2.45±0.253.17±0.21c、通过重复测定得出，蛭石的ph值为5-6，偏酸性，适合木霉菌生长。实验表明，蛭石处理与对照在菌落直径日增长量与单位产孢量没有显著性的差异，对木霉活力影响不明显，腐殖酸对木霉菌落生长有促进作用、对产孢量影响不大。上述对木霉菌株具良好生物学兼容性紫外保护剂的确定，为木霉生防制剂配方研究奠定了基石出。四、木霉菌剂贮藏实验：木霉菌剂装包后，放在常温下贮存，在第9、13个月时取出测定其孢子萌发率分别为：100％、94.6％；分别对菌剂进行高低温贮存试验，测定孢子萌发率，0℃贮存一周，孢子萌发率达99.60％，55℃贮存两周，孢子萌发率达90.2％，达到农药注册对贮藏期的要求。实施例4：木霉菌剂药效结果：一、材料与方法：a、菌剂：木霉菌剂：固体发酵的菌剂作为防病试剂，约含孢子量2xi09个/g。b、病原菌的选择：利用蘸根接种法，对进行感病力的测定，选出致病力最强的菌株，在培养皿中培养7天，菌丝长满培养皿，放入组织捣碎器加水20倍捣碎，备用。c、生物制剂对自然土盆栽玉米根腐病防效试验：每盆5kg重茬土壤，充分混匀。每盆播5粒玉米种子，保苗3株。设计三种不同处理：1、每穴施入木霉菌剂0.2g，同时种植玉米时接种串珠镰孢菌；2、清水对照：每穴不施入菌剂，种植玉米时不接种串珠镰孢菌；3、空白对照：每穴不施入菌剂，种植玉米时接种串珠镰孢菌。每处理设3个重复。在苗期调查发病情况，计算死亡率、病情指数和防效。d、田间试验：试验设在玉米苗期根腐病重发的博兴县的试验田。试验田土质一致，地力均匀，土壤肥力中上。本试验以玉米为研究物件，设计三种不同处理：1、每穴施入木霉菌剂0.2g，同时种植玉米时接种串珠镰孢菌；3、清水对照：每穴不施入菌剂，种植玉米时不接种串珠镰孢菌；e、空白对照：每穴不施入菌剂，种植玉米时接种串珠镰孢菌。设置两个区组三次重复。每个区组包含三个社区，每个社区为一个处理，其社区面积4米x2.4米，区组内三个处理采用随机排列，区组面积为4米x7米。二、取样及调查：苗期对植株取样，调查各处理玉米的发病情况，计算死亡率、病情指数和防效。统计：将记录资料进行统计与分析病情指数＝i00xσ(级数x该级株数)/(发病最高级数x总株数)防效＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数x100％死亡减少率＝(接病对照死亡率-其它处理死亡率)/接病对照死亡率x100％。结果与分析：1、盆栽试验木霉菌剂对盆栽玉米根腐病的防治效果：盆栽试验证实，清水对照病情指数为63.51％，防效为11.09％。木霉菌剂处理的玉米，其死亡率比接病对照减少71.66％，病情指数为19.11％，防治效果高达73.24％.可见木霉菌防治效果明显高于清水对照和接病处理。2、田间试验木霉菌剂对玉米苗期根腐病的防治效果，如表4所示。表43、试验木霉菌剂对玉米苗期根腐病的防治效果。田间试验结果，用木霉菌剂防治玉米苗期根腐病，其出苗率大幅提高，死亡减少率为72.13％，保苗效果显著。病情指数为显著降低，防效为74.24％,防治效果显著。4、本发明所制木霉菌剂对人畜和生态环境无害，无残留，不产生抗药性，生产成本低于化学农药多菌灵等，还可以变废为宝，具有很好的经济效益和社会效益。具体比较如下表5所示(木霉菌剂和化学农药特性综合对比表)表5化学农药术霉菌剂环境中持久性较高较低活性谱宽较专一对哺乳动物毒性中等或高无使用成本中等或高低和开发产品成本、时间高、长低、稍短产生抗性的可能性中等或高低本发明所制木霉菌剂与其它同类产品相比具有以下优势：(1)、生产周期短、产孢量大，使用方便。在固体发酵阶段木霉分生孢子的产孢量高，每克固体培养料含孢子量为1.37xio10-l51x101°个；采用穴施法施入木霉菌粉剂，简便易行，降低劳动成本；(2)、原料来源广，成本低，产品可以消耗大量玉米秸秆，不仅避免因焚烧玉米秸秆造成的大气污染，还可以变废为宝，具有很好的经济效益和社会效益，是发展高效，绿色，生态农业理想的生物农药；(3)、木霉分生孢子收集的工序简便，将满载木霉菌分生孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子粉，利于生产；(4)、贮存期长，有利于产品流通。木霉菌剂装包后，放在常温下贮存，在第9、13个月时取出测定其孢子萌发率分别为：100％、94.6％。当前第1页12