贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种微生物菌剂，具体涉及一种以贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)为活性成分的可溶粒剂及其制备方法。

背景技术：

芽孢杆菌类(bacillusspp.)微生物菌剂作为生物农药的重要类别，多年来一直备受关注。据农业部公布的数据，截至2019年3月底，我国正式登记的芽孢杆菌类农药产品的总数为382个(含原药33个)，其中苏云金杆菌(b.thuringiensis)类243个，其它芽孢类139个，约占全部农药登记总数的1.1％，在生物农药领域仅次于阿维菌素类产品，地位非常重要。当前芽孢类产品登记的剂型主要包括3大类：可湿性粉剂、粉剂类，227种，占制剂总量的65.0％；水剂、悬浮剂类，114种，占制剂总量的32.7％；颗粒剂、水分散粒剂等类，8种，占制剂总量的2.3％。可见当前我国芽孢杆菌类产品制剂的剂型以可湿性粉剂(含粉剂)、悬浮剂(含水剂)两类为绝对主角，合计占比为97.7％，其它剂型占比极少。这种状况也很大程度上反映出我国生物农药领域，芽孢杆菌类产品剂型开发的创新性不足，市场上产品同质化严重，供种植业者实际生产选择的余地较小等日趋严峻的问题。

通常，芽孢杆菌悬浮剂(含水剂)类制剂具有一些明显的优点：生产工艺简单、生产成本较低、方便添加其它配料，田间使用方便，发酵次生代谢物可有效利用；但是也具有明显的缺点：有效成分含量低、不便储存、不耐储存、保质期短、运输成本高、容易产生沉淀等。芽孢杆菌可湿性粉剂(含粉剂)、水分散粒剂也具有明显的优点：有效成分含量高、方便储存、耐储存、方便运输、运输成本低等；缺点主要体现在：生产成本较水剂高、容易产生粉尘、田间使用不易分散、容易堵塞滴灌系统细管道、喷头、喷嘴等。因此，当前芽孢杆菌类农药产品的主流剂型难以满足实际生产的真实需求。

随着经济、社会和科技的进步，全球范围内农药产业的发展呈现出新态势：产品有效成分向着生物组分大步迈进，而剂型正向着水溶性、环保型、高效率的方向发展。人们不断增长的健康和安全意识、不断提高的农产品消费方式和水平，对新型微生物制剂的开发提出了新的要求。诸如广受人们尤其是老、幼、妇欢迎的草莓、蓝莓、树莓、葡萄、桃、樱桃、车厘子、圣女果、生菜等多种高附加值的，即采即食、无间断采食的农作物，其产品往往采摘现场就食用，且每天每时每刻都可能采摘；香蕉、芒果、水稻、生菜、中药材等作物的绿色、有机产品更是深受市场欢迎。然而这些作物的病害往往全生育期发生，尤其在成熟期更为严重，病害防治对农药的要求更高：首先产品(包括有效成分和各种辅料成分)要低毒甚至无毒，其次产品要足够有效，再次产品要贴合现代化生产方式。然而当前可用于水果、农作物、中药材等植物上且符合上述要求的农药产品，即便是芽孢杆菌类微生物制剂，亦很鲜见。

贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)是一种新型芽孢杆菌，2005年在国际上首次命名，至2015年的十年间仅有零星报道。但是因其优良的防病和促生特性，近几年尤其是2016年以来被人们热切关注，相关研究猛增。截止2019年初，世界范围内关于贝莱斯芽孢杆菌的文章和专利分别约106篇和131项(含已授权和正在申请中的)，其中2016年以来的分别占80％和50％以上。从申请的国别来看，在中国申请数量最多，占42.86％。从申请领域来看，主要集中在植物促生和病害防控、堆肥腐熟、微生物食品加工应用、动物饲料加工、环境保护、水产养殖等方面。在已经公开和授权的131项专利中，绝大部分内容都是关于贝莱斯芽孢杆菌菌株及其活力和活性以及菌株发酵等方面的，涉及该新型菌株剂型研发的很少，专门针对新剂型研发的更是少之又少。cn109652336a公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其粉剂；cn201810644060公开了一种贝莱斯芽孢杆菌的微生物菌剂(主要包含可湿性粉剂、悬浮剂、水分散粒剂或颗粒剂四种传统剂型)，作用于花生上，防治花生根腐病。当前我国比以往任何时候都更重视科技创新，国内外不少企业正积极推进与高校和科研机构的强强联合，加速推进贝莱斯芽孢杆菌相关产品的开发和应用，初步取得阶段性进展。新型的、安全的、高效的、成熟的适合规模化现代农业生产的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的创制和面市迫在眉睫。

技术实现要素：

发明目的之一是提供一种贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂，为商品市场上贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂的开发提供新剂型，为实际生产中高附加值农作物病害的有效防控提供新产品。

在本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂中，按重量份数计，所述可溶粒剂包含贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)母粉0.1-97份；粘结剂1-5份；崩解剂1-10份；分散剂1-5份；其它填料补足至100份。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌在母粉制备过程中所用的原料均为完全水溶性的食品级原料，并选自酵母粉、蛋白胨、nacl、蔗糖、可溶性淀粉及其组合。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂中，在所述贝莱斯芽孢杆菌母粉中，所述贝莱斯芽孢杆菌含量为1000亿cfu/g以上。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌母粉的重量份数优选为10-30份。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂中，所述粘结剂选自可溶性淀粉、黄原胶、聚乙烯醇、大豆蛋白及其组合中的一种或多种，且其重量份数优选为3-5份。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂中，所述崩解剂选自牛奶粉、葡萄糖、硫酸铵、醋酸钠及其组合中的一种或多种，且其重量份数优选为5-10份。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂中，所述的分散剂选自酵母粉、木质素磺酸钠、聚丙烯酰胺及其组合中的一种或多种，且其重量份数优选为3-5份。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂中，所述其它填料选自麦芽糊精、氯化钠、碳酸氢钠及其组合中的一种或多种，且其重量份数为补足上述至100份。

本发明的另一目的是提供制备贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)母粉、粘结剂、崩解剂、分散剂和其他填料依次置于粉体混合罐中；

(2)将混合均匀的物料在气流粉碎机中超微粉碎；

(3)将超微粉碎后的物料在搅拌器中均匀捏合，并缓慢加水，至物料刚刚团聚成块时停止加水；

(4)将捏合好的物料通过挤压造粒机挤压造粒；

(5)将初步造好的颗粒于30℃-40℃下干燥，至颗粒含水量4％以下；

(6)将上述初步造好的颗粒分别通过20目和40目的振动筛进行筛分，两级筛选后粒径在40目至20目之间的颗粒即为贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂。

本发明的还一目的是贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂在防治水果、农作物和中药材病害中的应用。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂，剂型环保、性质稳定、药效持久、贴合现代农业各种生产方式，有望助力解决上述存在的实际问题，弥补农业生产和消费环节的不足。具体而言，本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂具有以下突出优点：一是产品有效成分为具有广谱、高效抑菌活性和较高抗逆性的贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)，且该新型微生物因子本身对人、畜、作物和环境健康安全；二是产品加工过程中的所有配料均为食品级原料，对人、畜、作物和环境健康安全，产品尤其适用于即采即食类农作物、高附加值高品质类农产品的全程病害防控；三是产品所有配料均为完全水溶性材料，微粒崩解速度快，能快速均匀地溶解在水中，农药活性成分利用率更高，更有利于提高劳动效率和防治效果；四是产品微粒有足够的细度和强度，具有良好的通风通气和流动性，耐得起长期储存且不结块，耐得起长途运输而不破损，具有更好的商品性；五是产品适于各种喷施、滴灌和土壤用药设备，更贴合现代化农业生产。

附图说明

图1为显示了常规贝莱斯芽孢杆菌可湿性粉剂(贝莱斯芽孢杆菌含量为200亿cfu/g)的照片。

图2为显示了常规贝莱斯芽孢杆菌可湿性粉剂(贝莱斯芽孢杆菌含量为200亿cfu/g)以10％溶于水而形成的悬浮液的照片；

图3为显示了本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂(贝莱斯芽孢杆菌含量为200亿cfu/g)的照片。

图4为显示了本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂(贝莱斯芽孢杆菌含量为200亿cfu/g)以10％溶于水而形成的溶液的照片。

具体实施方式

本发明一方面涉及贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂，按重量份数计，所述可溶粒剂包含贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)母粉0.1-97份；粘结剂1-5份；崩解剂1-10份；分散剂1-5份；其它填料补足至100份。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，菌株为贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001，分离自海南省三亚市陵水县，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14384。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，在制备所述的贝莱斯芽孢杆菌母粉的过程中，种子发酵和三级工业发酵的原料包括但不限于完全水溶性的食品级酵母粉、蛋白胨、nacl、蔗糖、可溶性淀粉。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，所述的三级工业发酵，在第三级工业发酵后半段，将温度适当提高5℃-10℃至40℃-45℃，提高芽孢产量和菌体抗逆性，产生高质量的贝莱斯芽孢杆菌母粉。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，所述的贝莱斯芽孢杆菌高质量母粉由上述三级发酵后的发酵产物通过喷雾干燥形成，有效成分即贝莱斯芽孢杆菌的含量为1000亿cfu(colonyformingunit,cfu)/g或以上。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，所述的贝莱斯芽孢杆菌母粉按重量份数计为0.1-97份，例如0.5份、1份、5份、10份、15份、20份、25份、30份，35份、40份、45份、50份、55份、60份、65份、70份、75份、80份，85份，90份，优选为10-30份，例如11-29份，12-28份，13-27份，14-26份，15-25份，16-24份，17-23份，18-22份，19-21份，例如10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份，18份、19份、20份、21份、22份、23份、24份、25份、26份、27份、28份、29份、30份，以及任意上述两个数值之间的任何数值，例如10.5份、11.5份、12.6份、15.份、17.5份、20.5份、25.5份、28.6份、29.5份等。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，在所述贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂中，有效成分即贝莱斯芽孢杆菌的含量为1亿cfu/g或以上，优选100亿-300亿cfu/g，例如110亿-290亿cfu/g，120亿-280亿cfu/g，130亿-270亿cfu/g，140亿-260亿cfu/g，150亿-250亿cfu/g，160亿-240亿cfu/g，170亿-230亿cfu/g，180亿-220亿cfu/g，190亿-210亿cfu/g，例如100亿cfu/g、150亿cfu/g、200亿cfu/g、250亿cfu/g，300亿cfu/g。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，所述粘结剂选自可溶性淀粉、黄原胶、聚乙烯醇、大豆蛋白及其组合中的一种或多种，且其量按重量份数计为1-5份，例如1份、2份、3份、4份5份，以及该数值范围内的任何数值，例如1.2、2.3、3.5、4.5份等，优选3-5份，例如3份、3.5份、4份、4.5份、5份等。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，所述崩解剂选自牛奶粉、葡萄糖、硫酸铵、醋酸钠及其组合中的一种或多种，其量按重量份数计为1-10份，例如1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10分，以及上述任意数值之内的任何数值，例如1.2份、2.5份、3.4份、4.5份、5.6份、6.6份、7.5份、8.4份、9.5份等，优选5-10份，例如5.5份、6份、6.5份、7份、7.5份、8份、8.5份、9份、9.5份、10份。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，所述的分散剂选自酵母粉、木质素磺酸钠、聚丙烯酰胺及其组合中的一种或多种，且其量按重量份数计为1-5份，例如1份、2份、3份、4份5份，以及该数值范围内的任何数值，例如1.2、2.3、3.5、4.5份等，优选3-5份，例如3份、3.5份、4.5份、5份。

在本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的实施方案中，所述其它填料选自麦芽糊精、氯化钠、碳酸氢钠及其组合中的一种或多种，且其量按重量份数计为补足上述成分至100份。

本发明的另一方面涉及制备贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)母粉、粘结剂、崩解剂、分散剂、其它填料，分别置于粉体混合罐中，充分混合均匀；

(2)将混匀后的物料在气流粉碎机中充分超微粉碎；

(3)将超微粉碎后的物料在搅拌器中均匀捏合，缓慢加水至物料刚刚团聚成块，停止加水；

(4)将捏合好的物料通过挤压造粒机挤压造粒；

(5)将初步造好的颗粒于30℃-40℃下干燥，至颗粒含水量4％以下；

(6)将上述初步造好的颗粒分别通过20目和40目的振动筛进行筛分，两级筛选后粒径在40目至20目之间的颗粒即为贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂。

本发明的第三方面涉及本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂在防治水果、农作物、中药材病害中的用途。

在本发明的用途的实施方案中，水果包括但不限于草莓、蓝莓、树莓、葡萄、桃、樱桃、车厘子、香蕉、芒果、橘、火龙果、圣女果。

在本发明的用途的实施方案中，农作物可以是但不限于生菜、芹菜、黄瓜、番茄、辣椒、茄子、豇豆、四棱豆、西瓜、哈密瓜、水稻、大豆、谷子、槟榔。

在本发明的用途的实施方案中，中药材包括但不限于百合、胡椒、人参、枸杞、川贝、当归。

在本发明的用途的实施方案中，所述病害包括但不限于水稻稻瘟病、水稻稻曲病、水稻纹枯病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、油菜菌核病、番茄灰霉病、芹菜叶斑病、根结线虫病、槟榔叶斑病、槟榔炭疽病、苹果轮纹病、香蕉叶斑病、香蕉根腐病、草莓根腐病、桃褐腐病。

下面以实施例的方式对本发明的技术方案作详细说明，如无特别说明，在下述实施例中，制备本发明的贝莱斯芽孢杆菌母粉及贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的过程中所用的所有配料均为食品级原料。

实施例1：1000亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌母粉的制备

贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)菌株的活化和种子发酵使用普通lb培养基(液)。

三级工业发酵体系的培养液采用优化配方，按质量百分比配比为：酵母提取物5％、可溶淀粉5％、蔗糖10％，新鲜肉汤溶解并补足至1000ml。其中新鲜肉汤制备过程如下：新鲜牛肉(骨)或(和)鲜鱼(骨)10份，兑水90份熬制，至肉(骨)完全熟烂，获得熬制的肉汤，过滤后补足水分至100份备用。

所述的三级工业发酵：第一级和二级的接种比例为10％，发酵温度均一直控制在35℃。第三级工业发酵分两个阶段，接种比例提高至20％，前半段发酵温度控制在35℃；后半段将温度适当提高5℃-10℃至40℃-45℃，以提高贝莱斯芽孢杆菌芽孢产量和菌体抗逆性。

三级发酵后的发酵液中贝莱斯芽孢杆菌活芽孢含量可达10⁸cfu/g数量级，发酵产物通过喷雾干燥后即可形成贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)含量达1000亿cfu/g以上的高质量贝莱斯芽孢杆菌母粉。

实施例2：100亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂

(1)原料：以生产1000kg为例称量

材料：贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)母粉(有效成分含量1000亿cfu/g以上)100kg；粘结剂可溶淀粉50kg；崩解剂牛奶粉100kg；分散剂酵母粉50kg；其它填料麦芽糊精补足至1000kg。

(2)制备方法：

将上述材料依次按照贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)母粉、粘结剂、崩解剂、分散剂、其它填料，分别置于粉体混合罐中，充分混合均匀；

将混匀后的物料在气流粉碎机中充分超微粉碎；

将超微粉碎后的物料在搅拌器中均匀捏合，缓慢加水至物料刚刚团聚成块，停止加水；

将捏合好的物料通过挤压造粒机挤压造粒；

将初步造好的颗粒于30℃-40℃下干燥，至颗粒含水量4％以下；

将上述初步造好的颗粒分别通过20目和40目的振动筛进行筛分。两级筛选后粒径在40目至20目之间的颗粒即为产品。

在由此得到的可溶粒剂中，贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)的含量为100亿cfu/g。

实施例3：200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂

(1)原料：以生产1000kg为例称量

材料：贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)母粉(有效成分含量1000亿cfu/g以上)200kg；粘结剂可溶淀粉50kg；崩解剂牛奶粉100kg；分散剂酵母粉50kg；其它填料麦芽糊精补足至1000kg。

(2)制备方法：

制备方法与实施例2相同。

在由此得到的可溶粒剂中，贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)的含量为200亿cfu/g。

实施例4：300亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂

(1)原料：以生产1000kg为例称量

材料：贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)母粉(有效成分含量1000亿cfu/g以上)300kg；粘结剂可溶淀粉50kg；崩解剂牛奶粉100kg；分散剂酵母粉50kg；其它填料麦芽糊精补足至1000kg。

(2)制备方法：

制备方法与实施例2相同。

在由此得到的可溶粒剂中，贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj0001(cgmccno.14384)的含量为300亿cfu/g。

实施例5：200亿cfu/g的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂和可湿性粉剂常温储存下的活力和稳定性比较

将实施例3制备的200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂和200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可湿性粉剂两种制剂分别分成5份，用铝箔袋包装，封口，置于20℃-25℃条件下，避免阳光直射，保存一年。

并分别于储存初始、第1个月、第3个月、第6个月、第12个月的5个时间点对样品进行抽样。

依据这两种微生物菌剂的产品质量标准，分别检测两种产品的有效成分含量、杂菌率、ph值、持久起泡性等指标(具体指标见下表1-表2)。

检测数据结果如下表1和表2所示。

表1.200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂常温贮存活力和稳定性检验结果

表2.200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可湿性粉剂常温贮存的活力和稳定性检验结果

通过表1、表2可以看出，虽然两种制剂在储存一年期内有关指标均符合标准要求，但是贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂相比于可湿性粉剂：菌体存活率大于95％，优于后者的89％，活力更好；同时有效成分分解率和杂菌率更低。

由此可见，本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂的性质更稳定，活力更强更持久，便于长期储存。

实施例6：200亿cfu/g的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂和可湿性粉剂常温储存后的溶液性状比较

将实施例3制备的200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂和200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可湿性粉剂两种制剂分别分成5份，用铝箔袋包装，封口，置于20℃-25℃条件下，避免阳光直射，保存一年。

并分别于储存初始、第1个月、第3个月、第6个月、第12个月的5个时间点对样品进行抽样。

依据相关检测标准，将样品兑水稀释至1亿cfu/ml，测定菌液的稳定性、起泡性和表面张力。

检测数据结果如下表3和表4所示。

表3.200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂常温贮存下溶液(1亿cfu/ml)性状

表4.200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可湿性粉剂常温贮存下溶液(1亿cfu/ml)性状

结果表明：贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂相比于可湿性粉剂，菌悬液的溶解性优异，起泡量少时间短，液体更稳定，表面张力更低。更方便施药，更容易在植物叶面润湿、展布，有利于提高农药的利用率和防治效果。

由此可见，本发明贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂在实际使用时更有贴合于现代农业生产，更有利于提高劳动生产率和防治效果。

实施例7：200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂田间防治草莓白粉病

1、材料与方法

1.1材料

实施例3制备的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂，贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj001(cgmccno.14384)的含量为200亿cfu/g。

1.2方法

1.2.1试验设置

试验在北京昌平兴寿镇温室草莓棚中进行，草莓品种为红颜。将实施例3制备的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂兑水配制为浓度1.0×10⁸cfu/ml的菌液，田间使用时再稀释100倍作为处理，并设空白对照ck。

草莓叶部白粉病防治试验：处理设置3次重复，每个重复小区面积166m²，每小区种植1500株草莓。12月13日草莓发生白粉病开始，每隔7天喷雾1次，共施药3次。按照每667m²用液量75kg，药械为背负式电动喷雾器(3wbd-20)。

草莓果实白粉病防治试验：随机选取120颗感染白粉病的病果，蘸取稀释100倍的贝莱斯芽孢杆菌菌液。

1.2.2调查方法

每个小区定株30株，调查整株叶片和果实的白粉病发病情况，以及菌液对草莓的安全性。于施药前、第一次药后7d、第二次药后7d、第三次药后7d，共调查4次，记录发病等级。

1.2.2.1叶片分级标准如下：

0级，无病斑；

1级，病斑面积占整个叶面积的5％以下；

3级，病斑面积占整个叶面积的6％-15％；

5级，病斑面积占整个叶面积的16％-25％；

7级，病斑面积占整个叶面积的26％-50％；

9级，病斑面积占整个叶面积的50％以上。

1.2.2.2果实分级标准如下：

0级，无病斑；

1级，病斑面积占果实面积的15％以下；

2级，病斑面积占果实面积的16％-30％；

3级，病斑面积占果实面积的31％-50％；

4级，病斑面积占果实面积的50％以上。

1.2.2.3按照如下公式计算病情指数和防治效果：

发病率＝发病株数/调查总株数×100％

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)×100/(调查总株数×最高级值)

式中ck0、ck1分别为对照区施药前和施药后的病情指数，pt0、pt1分别为处理区施药前和施药后的病情指数。

2、结果与分析

2.1对草莓叶片上白粉病的防治效果

12月13日调查草莓白粉病，叶片发病率为5.56％，病情指数1.11(表5)。第一次施药后7d，处理和对照的发病率和病情指数都有所上升，说明白粉病传播很快，贝莱斯芽孢杆菌菌液起效慢，但与对照相比，处理的病情得到有效控制，防效达91.98％；第二次药后7d，处理和对照的发病程度都有所减轻，发病率分别下降了72.74％和71.43％，病情指数分别下降了76.88％和86.13％，都维持在轻发水平，防效为86.64％；第三次药后7d，发病情况与第二次药后7d的一样。

第二次和第三次药后7d，对照在没用药的情况下，白粉病发病减轻，原因是白粉病发生后，采用了摘除病叶和老叶，加强通风，同时升高棚室温度等物理措施，大大降低了白粉病菌孢子浓度，改善了草莓生长环境，所以病害发生减轻。

表5.贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂对草莓叶片上白粉病的防治效果

ck：空白对照。

2.2对草莓果实上白粉病的防治效果

草莓果实白粉病的初始发病率为16.67％，病情指数为8.61(表6)。第一次药后7d，处理和对照的发病率和病情指数都明显下降，防效为30.44％；第二次药后7d，处理区发病率降低了16.64％，病情指数降低了49.7％，说明病果数量虽然减少的不多，但是病果上白粉病的发病程度减轻了近50％，而对照的病果率和病情指数分别上升了77.78％和70.55％，防效达86.32％；第三次药后7d，防效为71.08％，但对照区的果实发病程度减轻，发病率和病情指数都下降，分析原因可能是同时期摘除病果、采摘等措施造成的。

表6.贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂对草莓果实白粉病的防治效果

2.3对草莓的安全性

施药后观察，没有发现烧灼斑、发黄、植株矮化等药害症状，植株生长正常，因此贝莱斯芽孢杆菌对草莓安全，同时也没发现对蜜蜂有影响，可以用于田间草莓白粉病的防治。但处理小区和对照均有少部分果实畸形，可能是正值草莓花期，喷施药剂，造成空气湿度过大，花药开裂受阻和花粉传播不良，畸形果增多，因此尽量在花期不施药，尽早预防草莓白粉病的发生。

3、结论与讨论

利用生防菌剂防治草莓白粉病的研究较多。已有研究表明，枯草芽孢杆菌(b.subtilis)被用来防治草莓白粉病的研究最多，防效40％-65％。陈冲等(陈冲，王程亮，张潞生，蜡状芽孢杆菌ts-02防治草莓白粉病研究，安徽农业科学，2007，35(11):3298，3300)研究表明，蜡状芽孢杆菌(b.cereus)菌液对草莓白粉病的田间防效可达50％以上。另外，枯草芽孢杆菌与井冈霉素的复配剂，对草莓白粉病的防治效果明显优于单一的生防菌剂型，尤其在速效性和持效性方面。

本实施例利用实施例3制备的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂防治草莓白粉病，每隔7天施药1次，共施药三次，总体防效较好，叶部的防效超过85％，果实的防效超过70％，药效相当或优于常规的白粉病化学药剂。实际生产中草莓白粉病应尽早预防，建议在草莓定植后一个月，喷施贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂连续3次，每次间隔7d。

实施例8：200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂田间防治温室黄瓜根结线虫病

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1供试药剂

实施例3制备的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂，贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj001(cgmccno.14384)的含量为200亿cfu/g；

其它药剂：棉隆，含量98％，常用熏蒸性杀线虫剂，南通施壮化工有限公司生产；路富达，有效成分氟吡菌酰胺，含量41.7％，新型非熏蒸性化学杀线虫剂，拜耳作物科学公司生产；淡紫拟青霉(paecilomyceslilacinus)，含量2亿cfu/g，常用生物杀线虫剂，江西新龙生物科技股份有限公司生产。

1.1.2供试作物

黄瓜品种：津优35。

1.1.3防治对象

黄瓜根结线虫病，田间温室自然发病，病原为南方根结线虫(meloidogynincognita)。

1.2方法

1.2.1试验设置

试验在北京昌平金六环农业园温室黄瓜生产棚中进行，试验共设置1个空白对照、3个药剂对照、2个处理。具体如下：

空白对照(ck0)：水；

药剂对照(ck1)：棉隆，用量40g/m²，在9月30日覆膜高温熏蒸20d，10月20日揭膜翻土晾晒10d备用；

药剂对照(ck2)：路富达，0.03ml每株，定植后兑水灌根；

药剂对照(ck3)：淡紫拟青霉，用量40g/m²，定植前拌土穴施；

实验处理(tr1)：贝莱斯芽孢杆菌(cgmccno.14384)可溶粒剂，20g/m²，单剂处理，定植前拌土穴施；

实验处理(tr2)：淡紫拟青霉(用量20g/m²)+贝莱斯芽孢杆菌(10g/m²)，复配微生物菌剂处理。定植前二者混匀，拌土穴施。

以上每个处理设置3次重复，每个重复小区面积25m²，每个重复小区种植90株黄瓜。10月30日移栽自根瓜苗，第二年3月30日试验结束。

1.2.2调查方法

试验分别调查土壤中二龄根结线虫幼虫密度、前期植株株高、黄瓜根部根结病情指数3项指标，用以综合评判本发明的贝莱斯芽孢杆可溶粒剂相比于常规杀线虫剂的效果。

土壤中二龄根结线虫幼虫密度调查：采用浅盘法分离，计数测量二龄幼虫密度。棉隆熏蒸前(即9月30日)取土样1次；作物定植前一天(即10月30日)各处理均取样一次，每个重复五点法取样，为一个样品；次年3月30日试验结束，采用五点(每个点设置5个植株)法挨着作物根部取土样一次。

二龄根结线虫幼虫虫口密度减退率(％)＝(施药前二龄虫口密度-试验结束时二龄虫口密度)×100/施药前二龄虫口密度

二龄根结线虫幼虫虫口密度相对减退率(％)＝各处理的虫口密度减退率-空白对照的虫口密度减退率

前期植株株高调查：在植株打顶之前，测量植株自然株高。地表至植株顶端的高度记为株高。

根部根结病情指数：试验结束后，统一取出各重复植株根部，每个重复取有代表性的植株30株，展开调查。采用的10级分级标准和病情指数计算方法如下。

根部根结病情分级标准参考bridge和page方法，依据植物根系上根结数比例及着生位置，将根结级数分为以下0-10级，具体如下：

0级：无根结；

1级：具有少数不易发现的小根结；

2级：次生根上具有清晰可见的小根结；

3级：次生根上可见少数较大根结；

4级：次生根上多为较大的根结，主根无根结；

5级：50％根系被侵染，少数主根出现根结，根系功能受到影响；

6级：主根上出现大量根结；

7级：大部分的主根被根结覆盖；

8级：所有主根具有根结，仅极少数根未被侵染；

9级：所有根上具有严重的根结，植株通常即将死亡；

10级：主根具有严重的根结，无完整根系，植株死亡。

其中1-4级根结只出现在次生根上，5-10级根结分布在初生侧根和主根上。

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)×100/(调查总株数×最高级值)

处理效果(％)＝(试验处理数据-空白对照数据)×100/空白对照数据

2、结果与分析

2.1对土壤中二龄幼虫虫口密度的影响

结果表明(见表7)，相比于施药前土壤中南方根结线虫二龄虫口密度，ck0空白对照和ck1棉隆对照分别上升了2.74％和119.21％，ck2路富达和ck3淡紫拟青霉药剂对照则分别降低了76.05％和35.88％；而两个试验处理tr1贝莱斯芽孢杆菌和tr2“淡紫拟青霉+贝莱斯芽孢杆菌”则分别降低了19.89％和31.62％。而相比于空白对照，ck1、ck2、ck3、tr1、tr2的相对虫口减退率分别为-116.47％、76.05％、35.88％、19.89％、31.62％。可见，路富达可显著降低虫口密度，淡紫拟青霉也有一定效果；贝莱斯芽孢杆菌的单独使用的效果虽然不够理想，但是与淡紫拟青霉各自减半量混配使用则体现出一定的效果。棉隆处理后虫口密度反而增加，这可能由于冬季气温过低难以发挥药效所致。

表7.贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂对土壤中二龄幼虫虫口密度(条/100ml土)的影响

2.2对前期植株株高的影响

结果表明(见表8)，相比于空白对照ck0，在黄瓜植株生长前期，除了ck1之外，ck2、ck3、tr1、tr2均可增加黄瓜植株的株高，增高比例分别为6.5％、3.5％、9.0％和0.3％。贝莱斯芽孢杆菌在抑制土壤中根结线虫二龄幼虫的同时，还能有效促进植株生长。

表8.贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂对前期植株株高(cm)的影响

备注：r代表各重复的平均值(下同)。

2.3对植株根部根结指数的影响

在对黄瓜根结线虫病情指数的影响方面，试验结果表明(见表9)，相比于空白对照ck0，ck1、ck2、ck3、tr1和tr2各处理均可在一定程度上减轻根结病情，防效18.15％-30.77％不等。由于黄瓜属于对南方根结线虫极度敏感的作物，所以各处理之间的病情指数并没有体现出太明显的差异。虽然相比于各对照药剂，贝莱斯芽孢杆菌单独的效果并不突出，但是仍体现出一定的防效，尤其是与淡紫拟青霉各自减半量混配使用效果增加。

表9.贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂对植株根部根结指数的影响

3、结论与讨论

贝莱斯芽孢杆菌作为一种新型微生物因子，在植物病原真菌性病害的防控上已经显示出优异的特性。本发明的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂在黄瓜南方根结线虫病防控方面，虽然效果不如路富达、淡紫拟青霉等成熟的主流杀线虫剂，但是仍能在一定程度上降低根结线虫的虫口密度和根部病情指数，同时可有效促进黄瓜植株的生长，体现出一定的潜力。

实施例9:200亿cfu/g贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂田间防治水稻稻瘟病

1、材料和方法

1.1材料

1.1.1供试药剂

实施例3制备的贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂，贝莱斯芽孢杆菌nsz-ybgj001(cgmccno.14384)的含量为200亿cfu/g。

200亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，海南利蒙特生物农药有限公司生产；6％春雷霉素可湿性粉剂，武汉科诺生物科技股份有限公司生产；75％三环唑水分散粒剂，上海禾本药业股份有限公司生产。

1.1.2供试作物

水稻：宜香107。

1.1.3防治对象：水稻稻瘟病，田间自然发病。

1.2方法

1.2.1试验设置

试验在湖北恩施利川市南坪乡，试验共设置1个空白对照、3个药剂对照、2个处理，具体如下：

空白对照(ck0)：水；

药剂对照：200亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，100克/亩(ck1)；6％春雷霉素可湿性粉剂，50克/亩(ck2)；75％三环唑水分散粒剂，25克/亩(ck3)；

试验处理：本发明的贝莱斯芽孢杆菌(cgmccno.14384)可溶粒剂100克/亩(tr1)。

每个处理分别施3次药，3次重复，每小区50平米，小区随机排列，四周设置保护行。

1.2.2施药器械及方法

采用背负式电动喷雾器(3wbd-20)。每次每亩施药液50kg，施药于水稻叶片的正反面；按试验药液浓度按由低到高的顺序进行施药，每一处理3次重复施药后洗净喷雾器，再进行下一个处理。

1.2.3施药时间和次数

水稻孕穗期第一次施药，7d后第二次施药，14d后第三次施药。

1.2.4调查方法

1.2.4.1叶瘟

叶瘟的分级标准：

0级-无病；1级-叶片病斑少于6个，病斑长度小于1cm；3级-叶片病斑6-10个，部分病斑长度大于1cm；5级-叶片病斑11-25个，部分病斑连成片，占叶面积的10-25％；7级-叶片病斑26个以上，病斑连成片，占叶面积的26-50％；9级-病斑连成片，占叶面积的50％以上或全叶枯死。

1.2.4.2穗瘟

穗瘟的分级标准：

0级-无病；1级-每穗损失5％以下(个别枝梗发病)；3级-每穗损失6-20％(1/3左右枝梗发病)；5级-每穗损失21-50％(穗颈或主轴发病，谷粒半瘪)；7级-每穗损失51-70％(穗颈发病，大部分瘪谷)；9级-每穗损失71-100％(穗颈发病，连成白穗)。

于首次施药前调查病情基数，第一次药后7d、14d调查叶瘟防效，第一次药后27天水稻乳熟期调查穗瘟防效。根据《农药田间药效试验准则》，每小区5点取样，每点取50株，每株调查剑叶及剑叶以下2片叶；穗瘟每点调查50穗。

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)×100/(调查总株数×最高级值)

式中ck0、ck1分别为对照区施药前和施药后的病情指数，pt0、pt1分别为处理区施药前和施药后的病情指数。

2、结果与分析

2.1安全性调查

4种供试药剂在设计的浓度及使用剂量下，未见对水稻产生药害和不良影响。

2.2不用药剂对水稻稻瘟病的防治效果

表10.不同杀菌剂对稻瘟病的防治效果

由表可知，贝莱斯芽孢杆菌可溶粒剂、春雷霉素可湿性粉剂、三环唑水分散粒剂在药后14d对叶瘟的均有较好的防效，其中三环唑的防效最高，贝莱斯芽孢杆菌的防效次之，但三个药剂的防效无显著差异，枯草芽孢杆菌的防效最差；各药剂在药后27d对穗瘟的防效：三环唑和贝莱斯芽孢杆菌对穗瘟的防效高于70％，好于春雷霉素对穗瘟的防效，但三者间无明显差异，枯草芽孢杆菌的防效最差。

3、结论与讨论

试验结果表明：贝莱斯芽孢杆菌、春雷霉素、三环唑对水稻稻瘟病具有良好的防治效果，在供试剂量范围内各药剂处理对水稻安全、无药害，目测各处理区水稻生长后期的长势、叶色等，以三环唑处理区最好，贝莱斯芽孢杆菌和春雷霉素处理区次之，空白对照区水稻发病叶片出现干枯症状；贝莱斯芽孢杆菌和三环唑对穗瘟的防效优于对叶瘟的防效。

三环唑和春雷霉素是防治稻瘟病最常用的杀菌剂，已有稻瘟病菌对其产生低水平的抗性。在此次试验中，贝莱斯芽孢杆菌对稻瘟的防效不低于三环唑、春雷霉素等常规药剂，优于市场上的枯草芽孢杆菌菌剂。因此，本发明的贝莱斯芽孢杆菌在实际应用中可以用于防治水稻稻瘟病，与其他常规药剂一起进行轮换用药，以延缓病菌抗药性的产生，延长杀菌剂的使用寿命。

在描述本发明的上下文中，特别是在权利要求的上下文中使用术语“一个/种”和“一个/种”和“所述”以及类似的指示符应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独列举一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。不应将说明书中的语言解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。