一种氨基酸代谢异常的果蝇模型及其应用的制作方法

本发明属于医药及生物领域，尤其涉及一种氨基酸代谢异常的果蝇模型。

背景技术：

人类肝脏作为人体中重要的解毒器官，其损伤的防治已成为一个全球性的严峻课题。寻找合适的肝损伤动物模型，对研究肝病的发生机制，探索保肝的方法，具有重要的现实意义。现阶段用化学有毒物质如四氯化碳、半乳糖胺、甲基亚硝胺、对乙酰氨基酚等构建肝损伤的大鼠和小鼠模型，可获得多项异常指标，重复性好，易行性好，已成为对肝脏进行代谢研究的较理想模型。然而哺乳类的作为模式动物越来越受到社会的谴责，受到伦理道德上的约束，如今倾向于用低等动物替代高等动物。黑腹果蝇由于其代谢和生理功能与人类相似，人类基因组序列分析表明果蛹与人具有极高的同源性，果蝇中与人类肝脏类似的器官是脂肪体，它是能量代谢中心，负责糖类、蛋白质和脂类三大物质代谢和合成，并对药物进行代谢和分解。

氨基酸代谢在营养学研究中非常重要，常规模型是通过破坏小鼠的肝脏进行模型建造，但当有毒物质进入体内后，不仅损害肝脏，也损害其他脏器，对药物功能的研究有很大干扰。近年来有的通过转基因小鼠模型，获得氨基酸代谢异常的模型，这需要耗费大量的时间和金钱，严重影响研究的进展。果蝇模型由于生长周期短，易于培养，有相对清晰的遗传学背景和丰富的表型，其代谢系统、生理功能、生长发育等同哺乳动物基本相似，已经在肿瘤、遗传性疾病、睡眠障碍、糖尿病、肥胖症等的研究方面获得广泛应用，可以进行生物的发育遗传、信号转导通路研究。果蝇模型在研究营养代谢的病变上具有许多独到的优势，果蝇营养代谢变化所引起的生物功能改变，可对人类代谢起参考作用。人类血清支链氨基酸/芳香族氨基酸比值测定对临床诊断肝炎和肝硬化，了解肝功能损伤等具有重要意义。人体肝脏受损害时，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸)含量和支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)含量会有所变化。本发明建立果蝇的氨基酸代谢异常模型，并运用其进行促进蛋白质代谢药物筛选。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种氨基酸代谢异常的果蝇模型，通过杂交得到fbp1rnai转基因果蝇而使果蝇fbp1基因表达下调导致对氨基酸吸收障碍，来解决现有的氨基酸吸收障碍模型中其他器官中毒而导致的干扰问题。

为解决上述问题，本发明的第一方面提供了一种氨基酸代谢异常的果蝇模型，果蝇模型中的果蝇fbp1基因下调，fbp1蛋白减少，且从卵到游走期比野生型果蝇推迟，幼虫体重降低。

进一步的，所述果蝇模型中果蝇含有fbp1rnai基因；所述果蝇模型中果蝇从卵到游走期比野生型果蝇推迟30～40小时；所述果蝇模型中果蝇幼虫体型减低10％～12％；所述果蝇模型中果蝇在蛹期黑化死亡率大于等于95％。

进一步的，所述果蝇模型中果蝇的血淋巴支链氨基酸是野生型果蝇的1.4～1.6倍，在该果蝇模型的脂肪体的支链氨基酸含量为野生型果蝇的0.4～0.6倍。

根据本发明的另一个方面，是将权利要求1-3任一项所述氨基酸吸收障碍果蝇模型中的果蝇在三日龄时开始饲喂待筛选的药物，如果蛹期黑化死亡率小于95％，则该药物能够促进氨基酸的吸收。

技术方案小结，本发明的原理阐述

果蝇的fbp1(fatbodyprotein)蛋白是一种膜蛋白，可以与果蝇的血淋巴蛋白结合，其介导血淋巴蛋白进入脂肪体中，被认为贮存蛋白的受体。fbp1的编码基因也以单拷贝形式存在，只在脂肪体中表达，主要在末龄幼虫摄食时和幼虫-蛹转变时出现，但其表达模式稍晚于血淋巴蛋白，也受蜕皮激素的诱导。

果蝇的血淋巴蛋白，在取食期幼虫脂肪体内合成后释放到血淋巴中。在末龄幼虫期达到顶峰，取食停止后化蛹时又由脂肪体选择性地摄取。在细胞内形成贮存蛋白颗粒，供蜕皮时再次进入血淋巴，为成虫器官发育和新组织形成提供氨基酸和氨基酸。当血淋巴蛋白进入脂肪体受阻后，则果蝇的生存会受到极大影响。

本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：

1、果蝇模型生长周期短，易于培养，成本低；

2、无毒副作用，不会对药物筛选等试验造成干扰；

3、可以简单、方便地用于筛选和研究氨基酸吸收过程，能够满足促进氨基酸吸收的药物筛选所要求的高通量、经济性强和时间短的要求。

4.果蝇模型的血淋巴支链氨基酸含量较正常高，芳香族氨基酸含量较正常高，在脂肪体中则氨基酸含量出现相反的趋势。

附图说明

图1氨基酸吸收障碍模型构建流程图；

图2果蝇模型的血淋巴游离氨基酸含量和种类的变化图；

图3果蝇模型的脂肪体游离氨基酸含量和种类的变化图；

图4果蝇模型的脂肪体的支链氨基酸；

图5果蝇模型的脂肪体的芳香族氨基酸的变化；

图6果蝇模型的血淋巴的支链氨基酸；

图7果蝇模型的血淋巴的芳香族氨基酸的变化；

图8果蝇模型的雷帕霉素靶蛋白(tor)信号相关的变化；

图9果蝇模型给药组与空白组死亡率变化；

图10果蝇模型给药组与空白组脂肪体中芳香族氨基酸变化；

图11果蝇模型给药组与空白组脂肪体中支链氨基酸变化。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

根据本申请的一个实施方式，一种氨基酸代谢异常的果蝇模型通过以下方法进行构建：

如图1所示，本实施例的果蝇模型是将雌性act-ga14处女蝇与雄性uas-dsfbp1rnai转基因果蝇进行杂交得到的子一代果蝇。或者是雄性act-ga14处女蝇与雌性uas-dsfbp1rnai转基因果蝇进行杂交得到的子一代果蝇。对照组为uas-dsfbp1rnai与野生型果蝇(w¹¹¹⁸)杂交。

果蝇的fbp1蛋白是一种膜蛋白，主要存在于脂肪体中，可以与果蝇的血淋巴蛋白结合，介导血淋巴蛋白进入脂肪体中，被认为贮存蛋白的受体。fbp1的编码基因也以单拷贝形式存在，只在脂肪体中表达，在果蝇变态发育中起重要作用的一种蛋白质。在取食期幼虫脂肪体内合成后释放到血淋巴中。在末龄幼虫期达到顶峰，取食停止后化蛹时又由脂肪体选择性地摄取。在细胞内形成贮存蛋白颗粒，供蜕皮时再次进入血淋巴，为成虫器官发育和新组织形成提供氨基酸和氨基酸。

uas-gal4系统是果蝇遗传学中一种常用的异位表达系统。uas(upstreamactivesequence，uas)上游激活序列，是酵母中一种类似高等真核生物增强子的序列。gal4(galactose—regulatedupstreampromoterelement，gal半乳糖凋节上游启动子元件)，是一个酵母转录激活因子。与原核生物乳糖操纵子相似，在酵母中gal4与uas结合可以调节与半乳糖代谢相关基因的表达。rna干扰(rnainterference,rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(double-strandedrna，dsrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。有关的dsrna及氨基酸可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和dna发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。运用uas-gal4系统，利用组织特异性的启动子,将gal4基因与启动子相连接,建立gal4转基因系,通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制gal4的表达。将uas与靶基因fbp1rnai融合,建立带有uas-fbp1rnai的转基因系。

将uas-dsfbp1rnai品系果蝇与act-gal4品系果蝇杂交，可使组织细胞中的fbp1的基因表达下降，即得到含有fbp1rnai的转基因果蝇，该果蝇表现为氨基酸吸收障碍果蝇模型，含有fbp1rnai的转基因可导致fbp1基因表达下调，通过下调fbp1基因使果蝇子代体内的fbp1基因表达大量减少，且fbp1蛋白表达降低，果蝇体内氨基酸含量的改变，寿命缩短、活动能力下降。

使用本实施方法得到的果蝇模型中果蝇的血淋巴、脂肪体中的氨基酸含量与正常的非转基因的果蝇氨基酸、游离氨基酸含量不一致，且对氨基酸吸收具有障碍，而无其它毒副作用，从而可以作为筛选促进体内氨基酸吸收的药物的动物模型氨基酸。使用该方法构建的果蝇转基因模型能够简单、方便地用于筛选和研究氨基酸吸收过程，能够满足促进氨基酸吸收的药物筛选所要求的高通量、经济性强和时间短的要求。

分别检测三龄幼虫在游走期的脂肪体和血淋巴中氨基酸的含量，氨基酸含量检测步骤如下：

1)血淋巴样品获取：用镊子小心撕开果蝇头部，枪头吸取入eppdorff管(微量离心管)，共计10μl并马上放于-80℃冰箱保存。

2)脂肪体样品获取：用镊子小心取出果蝇脂肪体，注意不要破碎脂肪体，并在pbs中洗涤2次，再入eppdorff管中，共取10个果蝇的脂肪体，雌雄各五个，-80℃冰箱保存。

3)用同位素标记进行氨基酸质谱检测。主要过程如下。氨基酸水解：取等体积的浓盐酸，颠倒5次混匀后充氮气并封口，置110℃烘箱中高温消化20h。消化后取出溶液高速离心，加磺基水杨酸(含有氨基酸同位素试剂)，旋窝混匀30min，高速离心2min；取上清液，置于另一试管中，加人标记缓冲液，涡旋混匀，旋转离心；移取上层液置于另一试管中，加入异丙醇，混匀，离心；加入itraq试剂((isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation)即等重标签标记用于氨基酸相对和绝对定量技术)，混匀，旋转离心，室温孵化30min，加羟胺，混匀，旋转离心；在试管中加入标准稀释液复溶的标记液，混匀，旋转离心。清液为液质联用质谱仪检测样品。

4)氨基酸含量检测结果显示实验组与对照组有明显的差别，实验组在幼虫的游走后期，羟脯氨酸(hyp)在脂肪体与血淋巴中的含量是对照组的要高。在脂肪体中hyp的实验组是对照组的6倍，而在血淋巴中实验组是对照组的2倍。组氨酸(his)、苏氨酸(thr)、谷氨酸(glu)、谷氨酰胺(gln)、脯氨酸(pro)、3-甲基组氨酸(3-mhis)在血淋巴中含量较对照组高，精氨酸(arg)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)、甲硫氨酸(met)、缬氨酸(val)、γ-氨基丁酸(γ-gaba)、甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、牛磺酸、酪氨酸(tyr)、天门冬酰胺(asn)、瓜氨酸(cit)、鸟氨酸(orn)、肌氨酸(sar)在血淋巴中含量较对照低。而在脂肪体中游离氨基酸含量则呈相反的趋势。见图2和图3；支链氨基酸和芳香族氨基酸的含量变化见图4-7。

5)由于氨基酸代谢模式是引起营养代谢效应发生变化的主要原因，且主要体现为以亮氨酸(leu)为主的支链氨基酸对蛋白质代谢产生的效应。支链氨基酸能有效促进蛋白质合成代谢，抑制蛋白质降解，并通过细胞表面氨基酸转运载体(受体)识别和介导，将胞外氨基酸信号分子转运入细胞内，影响pi3k(磷脂酰肌醇3-激酶)途径和mtor(雷帕霉素靶蛋白)信号途径，由mtor分子作为合成和分解代谢的共同作用点，实现对蛋白质代谢的分子调控。我们检测mtor途径的相关蛋白质的变化。p70核糖体蛋白s6激酶(p70s6k)和真核细胞始动因子4e结合蛋白1(4ebindingprotein,4ebp1)是mtor的主要下游底物。p70s6k、4ebp1在蛋白质合成中均起重要作用。图8为转基因果蝇fbp1rnai的tor信号相关蛋白的变化。在游走期，fbp1rnai的转基因果蝇tor信号的下游通路被抑制。

6)可以通过监测支链氨基酸的含量变化，来研究治疗氨基酸代谢障碍的药物的疗效，从而可以作为治疗氨基酸代谢障碍的药物筛选的模型。当氨基酸吸收功能有所改善时，脂肪体、血淋巴中的氨基酸种类、含量都会有相应变化。该模型可用于鉴定、分析和评价营养代谢状态，评价研究相关物质对营养的吸收利用状态。

如图2所示，为本实施方法中果蝇模型与对照组血淋巴中游离氨基酸的变化。图3为本实施方法中果蝇模型与对照组脂肪体中游离氨基酸的变化。果蝇的血淋巴中氨基酸含量、游离氨基酸含量和种类与对照的氨基酸含量、游离氨基酸含量和种类有所不同，果蝇的脂肪体中的游离氨基酸含量和种类与对照act-gal4×野生型w¹¹⁸(act-gal4与野生型w¹¹⁸杂交的后代，图中用ck表示)有很大的差异。组氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、3-甲基组氨酸在血淋巴中含量较对照(ck)高，精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸、甘氨酸、丝胺酸、牛磺酸、酪氨酸、天门冬酰胺、瓜氨酸、鸟氨酸、肌氨酸在血淋巴中含量较对照(ck)低。所建模型中非必须氨基酸含量比对照血淋巴高。

根据本发明的另一个实施方式，提供了一种氨基酸代谢异常的果蝇模型的应用。

配置培养果蝇的培养基，其组成成分如下：6升的饲料，需要玉米粉：480g，红糖：750g，酵母粉：96g，琼脂：30g。

将待筛选的药物参杂在果蝇培养基中，将含有待筛选药物的培养基装入培养管。每瓶培养管里装30只氨基酸吸收障碍果蝇模型的新生蝇(三日龄)。

在果蝇幼虫的蛹羽化成虫的过程中，氨基酸吸收障碍果蝇模型有95％的果蝇蛹黑化而死，无法完成羽化。当蛹期黑化死亡率小于95％，则该药物能够促进氨基酸的吸收。

所用药物可分为药物种类系列和同种药的浓度系列，依据本实验系统可筛选出选药物。利用本发明的模型及方法，使快捷地对大量化合物和中草药进行筛选得以实现，可以据此开发出促进氨基酸吸收的高效药物。还可以在本实施方式的氨基酸吸收障碍模型的果蝇发育期的不同阶段，饲喂待筛选药物，筛选出延长果蝇寿命和促进氨基酸吸收的药物。

黑腹果蝇由于其代谢和生理功能与人类相似，人类基因组序列分析表明果蝇与人具有极高的同源性，果蝇中与人类肝脏类似的器官是脂肪体，它是能量代谢中心，负责糖类、氨基酸和脂类三大物质代谢和合成，并对药物进行代谢和分解。因此可以利用果蝇模型筛选促进氨基酸吸收的药物。

实验果蝇分为空白对照组(n组)，模型组(m组)，药物组(丹参酮)高、中、低剂量组,分别以药物组(l)、药物组(m)、药物组(h)来表示。幼虫从卵开始给药直至预蛹期。观察其死亡率和氨基酸代谢变化，给药组显示死亡率明显降低，见图9，且支链氨基酸和芳香族氨基酸含量都有所变化，结果见图10和图11。由于丹参酮可提高耐缺氧能力，改善微循环，抗肝纤维化，保护肝损伤及促进肝细胞再生等药理作用，将该药物来对模型进行验证研究，显示此模型在药物作用后，其脂肪体和血淋巴的氨基酸吸收障碍有所改善。

如图7和图5所示，本实施方式的果蝇模型的血淋巴中支链氨基酸(缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸)的含量与对照组相比浓度高，模型组血淋巴支链氨基酸是对照组的1.5倍，在该果蝇模型的脂肪体中，模型组的支链氨基酸较对照组高，模型组的脂肪体的支链氨基酸含量为对照组0.53倍。芳香族氨基酸含量如图4和图6所示，果蝇模型的血淋巴中芳香族氨基酸(主要表现在苯丙氨酸，酪氨酸)的含量与对照组相比浓度高，果蝇模型的脂肪体中，模型组的芳香族氨基酸较对照组低。所建模型的表型出现发育延迟，致死率高的特点，发育延迟表现为从卵到游走期幼虫，晚35小时，蛹期致死是95％。果蝇fbp1基因表达下降，发育延迟，幼虫生存力低，活动能力下降，体重较正常对照组约少12％；存活率在其发育期的不同阶段，饲喂待筛选药物，筛选出延长果蝇生存力和促进氨基酸吸收的药物。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。